Post on 06-Dec-2015
description
LABORATORIUM ANALITIKSEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2014/2015
PRAKTIKUM KROMATORAFI
MODUL : HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
PEMBIMBING : Drs. Edi Wahyu Sri Mulyono, M.Si..
Oleh :Kelompok : II
Nama : 1. Citra Pranata Niaga 131431005
2. Dina Heryani 131431006
3. Dini Heryani 131431007
4. Febby Elsa Nabila 131431008
Kelas : 2A
PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA
JURUSAN TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK NEGERI BANDUNG
2015
Praktikum : 22 Mei 2015
Penyerahan (Laporan) : 29Mei 2015
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam
teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang
bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu
padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba
memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi
kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-
daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir
bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-
fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang
menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan
suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir
tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar
kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan
Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang
baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan
Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat
umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada
tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai
kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas
dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar,
pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur
biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha
dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi
kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau
Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja
Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil
dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan
pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan
suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam
keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan
cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
I.2 Tujuan
Dapat mengetahui komponen-komponen instrumentasi HPLC
Dapat mengetahui prinsip kerja HPLC
Dapat mengoprasikan HPLC sesuai SOP
Dapat melakukan analisa sampel dengan menggunakan alat HPLC
BAB II
LANDASAN TEORI
2.1 Karakteristik Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada KCKT
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-
puncaknya terpisah.
Prinsip dasar dari KCKT, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung
berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya
hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode KCKT. Yang
pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi.
Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.
Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini dapat terjadi kalau
interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang
dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada setiap lempeng, banyaknya lempeng
dinyatakan dengan N).
2.2 Prinsip Kerja KCKT
Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol
< golongan asam.
KCKT dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara
yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time
(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah
sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah
spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D
yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat
tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis
di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah
kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18
yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya.
Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti
kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa
karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat
dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample
yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari
impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung
komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja
Seleksi Tipe KCKT
Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus membuat
keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan informasi yang
diinginkan.
Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi tipe KCKT .
Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan pemelihan tipe KCKT
yang memberikan para analis untuk memutuskan pemilihan tipe KCKT yang
memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahaan yang diinginkan. Namun, sampel
yang tidak dikenal (unknown) akan menyulitkan pemilihannya tipe KCKT.
Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat Molekul dapat
diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data spektroskopik seperti
nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red spectrophotometer, ultra
violet spectrumeter, dan mass
Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk bagi analis
memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.
2.3 Instrumentasi KCKT
Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Gambar dibawah ini :
Fase gerak d
Gambar 1. Komponen penting KCKT
Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua
tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan
konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua,
yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan
suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam
pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor
yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah
ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak
berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi
Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi
LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan,
maka sampel akan masuK ke dalam kolom.
Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50
-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5
cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur
kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung
pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid
Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution
Chromatography, EC)
Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor
yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar
respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu
kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan,
tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang
lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada
kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan
detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:
- Detektor Fluorometer - Detektor Spektrofotometer Massa
- Detektor lonisasi nyala - Detektor Refraksi lndeks
- Detektor Elektrokimia - Detektor Reaksi Kimia
Sistem penyuntik
Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai ketelitian
maksimum analisis kuantitatif. Yang terpenting sistem harus dapat mengatasi tekanan
balik yang tinggi tanpa kehilangan terokan. Pada saat pengisian terokan, terokan
dialirkan melewati lekuk dan kelebihanya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat
penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati lekuk ke kolom.
Tendon pelarut
Tendon pelarut atau fase gerak mempunyai ciri yaitu bahan tendon harus lembam
terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja anti karat jangan
dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika harus bertekanan, hindari
menggunakan gelas. Daya tampung tendon harus lebih besar dari 500 ml yang dapat
digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1 – 2 ml/menit.
Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi
gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih
dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari
bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek,
gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Tabel. Mode Kompatibilitas dengan Gradien
Gradien Mode Solven Gradien
Kromatografi Cair padat (LSC) Ya
Kromatografi ekslusi Tidak
Kromatografi Penukar Ion (IEC) Ya
Kromatografi Cair Cair (LLC) Tidak
Kromatografi Fasa Terikat (BPC) Ya
Pengolahan Data (Data Handling)
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram
pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3. 2 berikut ini
Gambar 2. Kromatogram dari senyawa 5’ Nukleotida
Dari Gambar di atas waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni
bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi
kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional
dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
3.9 Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat
disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah
BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
HPLC
Syringe
Aquadest
Metanol p.a
0,5% toluene dalam metanol
3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Analisis dengan HPLC
3.2.2 Mengaktifkan HPLC
3.2.3 Conditioning HPLC
3.2.4 Mematikan HPLC
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Tabel 1. Hasil Pengukuran Sampel Toluena 0,5% dalam Methanol
No. Komposisi fasa gerak(Metanol : Aquades)
Volume sampel yang diinjeksikan (uL)
Ret Time[min]
Width[min]
Area Height
1 99 : 1 10 1.341 0.0435 2644.70752 970.16730
2 99 : 1 20 1.344 0.0448 4909.58594 1729.23853
3 99 : 1 30 1.350 0.0451 5391.94141 1879.35938
4 90 : 10 40 1.645 0.0492 2937.82031 948.24231
5 90 : 10 50 1.646 0.0515 4880.93506 1481.17737
6 90 : 10 60 1.656 0.0525 5597.80273 1658.60327
4.2 Pembahasan
Kromatografi merupakan suatu metoda pemisahan campuran komponen (senyawa)
dalam komponen penyusunnya dengan cara komponen penyusunnya tersebut terdistribusi
diantara fasa diam atau fasa gerak. HPLC merupakan salah satu metode kromatografi Cair
dimana HPLC juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dengan menentukan berapa
banyak senyawa dalam komponen tersebut. Berdasarkan prinsip kerjanya HPLC dapat
memisahkan senyawa sesuai kepolarannya. Fasa diam yang digunakan yaitu kolom yang
berisi silica yang telah dimodifikasi, sedangkan fasa gerak yang digunakan yaitu terdapat 2
komponen yaitu air dan methanol yang divariasikan. HPLC dapat digunakan untuk analisa
kualitatif maupun kuantitatif. Namun pada praktikum kali ini yaitu analisa kualitatif dengan
melihat pengaruh komposisi fasa gerak dan volume sampel yang diinjeksikan terhadap peak
kromatogram.
Pada kromatografi terdapat empat bagian yang tersusun secara bertingkat. Pada
tingkat paling atas merupakan Degasser yang berfungsi untuk mengeluarkan udara yang
terjebak pada selang larutan fasa gerak, setelah itu ada pompa yang berfungsi memompa atau
mengalirkan fasa gerak yang digunakan, kemudian ada tempat kolom sebagai tempat
menyimpan kolom atau fasa diam, dan pada tingkat paling bawah ada detektor. Karena pada
HPLC yang digunakan adalah detector UV-Vis, maka yang diukur adalah serapan cahaya
oleh larutan yang keluar dari dalam sampel. Pada detektor ini digunakan sinar UV pada
panjang gelombang 254 nm atau 366 nm.
Sampel yang digunakan yaitu toluene standar dengan konsentrasi 0,5% dalam
methanol. Pengukuran dilakukan dengan panjang gelombang 254 nm, karna identifikasi
sampel menggunakan sinar UV pada panjang gelombang tersebut. Pada praktikum dilakukan
variasi pada komposisi fasa gerak, yaitu dengan komposisi methanol:air sebesar 99:1 dan
dengan komposisi fasa gerak dengan perbandingan methanol:air 90:10. Pada perbandingan
methanol:air = 90:10 menghasilkan waktu retensi yang lebih lama dibandingkan dengan
perbandingan methanol:air = 99:1. Hal tersebut terjadi karena sampel yang digunakan adalah
0,5% toluene di dalam methanol, sehingga semakin banyak komposisi methanol di dalam
fasa gerak akan menyebabkan sampel akan semakin cepat keluar. Hal tersebut yang
menyebabkan waktu retensi perbandingan 99:1 memiliki waktu retensi yang lebih kecil
dibandingkan dengan perbandingan 90:10.
Selain itu, volume sampel yang diinjeksikan akan mempengaruhi waktu retensi. Pada
saat praktikum sampel yang diinjeksikan, divariasikan dengan volume 10-30 μL. Terlihat
waktu retensi dari toluene dengan perbedaan volume injeksi menyebabkan waktu retensi
semakin besar, karna berdasarkan teoritis bila volume yang diinjeksikan semakin banyak
maka waktu retensi akan semakin besar.
BAB V
KESIMPULAN
5.1 Kesimpulan
Perbandingan konsentrasi dapat mempengaruhi waktu retensi
Jumlah volume yang diinjeksikan dapat mempengaruhi waktu retensi, semakin
banyak volume yang diinjeksikan semakin besar nilai waktu retensi.
DAFTAR PUSTAKA
Bassett, J, dkk. 1994. Buku Ajar Vogel. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
S.M Khopkar, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta, 1990:147-157
Robert C. Reynolds and C. Allen O’Dell, J. Chem. Educ., 1992, 12: 989-991