04-Lampiran.doc

7/25/2019 04-Lampiran.doc

1/20

60

LAMPIRAN

Lampiran 1.Spesifikasi Alat

No. Nama Alat Merek/Tipe Kegunaan Tempat

1. Erlenmeyer Iwaki, 100 dan

250 mL

Tempat

pembuatan gelagarosa

Lab. Genetika dan

Molekuler, . !iologi danLab "iset # $%&'E(

2. Timbangandigital

)re*isa Mengukur beratagarosa

Lab. Genetika danMolekuler, . !iologi dan

Lab "iset # $%&'E(

+. Mikropipet Eppendor- 0,5l/1000 l

Meneteskan suatularutan dengan

akurasi tinggi


Lab "iset # $%&'E(

. Tips Termo - 0,5 l/1000 l Tempatmeneteskan

larutan pada

mikropipet


Lab "iset # $%&'E(

5. utokla 3irayama Tempat sterilisasi

mekanik

Lab. isiologi Tumbuan,

. !iologi $%&'E(

4. "erigerator &anyo Tempat

penyimpanan

sampel dara

Lab. Genetika dan

Molekuler, . !iologi dan

Lab "iset # $%&'E(

. !iomedi*al

ree6er /20o7

Termo ree6er Tempat

penyimpanan

reagen dan

sampel (%

Lab. Genetika dan

Molekuler, . !iologi

$%&'E(

8. &arung tangan

steril

3and &eal Melindungi

tangan darikontaminan

Lab. Genetika dan


9. Tabung :ial Eppendor- 1,5

ml

Menyimpan

sampel (%

Lab. Genetika dan


10. Mesin thermal

cycler/ )7"

pplied

!io&ystems,;eriti

Mengampliikasi

sekuens genML3/1

Lab. Genetika dan


11. Apparatus

elektrooresis

7. !. &.

&*ientii*

;isualisasi produk

)7"

Lab. Genetika dan

Molekuler, . !iologi$%&'E(

12. )ower )a* 7. !. &.&*ientii*

&umber aruslistrik untuk

running

elektrooresis


Lab "iset # $%&'E(

1+. Gel/(o* 1000 !en*top 2$; ;isualisasi asil

elektrooresis gel

Lab. Genetika dan

Molekuler, . !iologi dan

Lab "iset # $%&'E(

1. Tissue Multi Membersikan

me


2/20

61

15. Inkubator !iosan 3eating=7ooling (ry

!lo*k

Inkubasi saatisolasi (%

Lab "iset # $%&'E(

14. Alumuniumfoil

#lin/)ak Menutuperlenmeyer


Lab "iset # $%&'E(1. ;orte> !iosan ;/1 plus Mengomogen/

kan larutan

Lab "iset # $%&'E(

18. &entriugator "erigated!en*top

mi*rosentriuge

#ITM%/T2

&entriugasilarutan saat isolasi

(%

Lab "iset # $%&'E(


3/20

62

Lampiran 2. Spesifikasi Bahan

No. NamaBahan Spesifikasi Kegunaan

1. &ampel ?aringan Tikus

@Rattus norvegicusA

25mg &umber (% ML3/1

2. (% isolation kit

(invitrogen)

50 reaksi #it untuk isolasi (%

+. Etanol absolut 100B $ntuk isolasi (% ML3/1

. Thermo Scientific Water Cater )7" steril &ebagai buer )7"

5. Thermo Scientific

DreamTaq PR !aster

!i" @2DA

,5 l $ntuk ampliikasi gen ML3/

1

4. 100 bp (%#a$$er 5 l Marka (% untuk

elektrooresis

. )rimer gen ML3/1 1 l $ntuk ampliikasi gen ML3/

18. Gel agarosa 1B Media untuk elektrooresis

gel

9. %thi$ium &romi$a@Et!rA 0,5 l gen interkalasi

10. T!E 1 > &ebagai pelarut agarosa dan

buer elektrooresis

11. 'orar$ an$ reverseprimer

11 pb @enetica

ScienceA)rimer untuk ampliikasiML3/1

12. T!E !uer 1> !uer elektrooresis gel


4/20

63

Lampiran 3. DSAIN PRIMR P!R ML"#$ $%$ PB &'($)*

DSAIN PRIMR+#INP,T -N ML"#$ &RATT,S NR-I!,S*

gene 1..37062 /gene="Mlh1"

/note="mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2

(. coli! #eri$e% &y automate% computational analysis

using gene pre%iction metho%' est)e*+e,-nomon."

/%&re*="-ene#'16"

/%&re*=")-#'62037"

m)45 oin(7..116,..7,111..11230,12277..1236,

170..112,160..1,1661..16730,13..1627,

2136..210,2201..277,200..217,3022..3000,

3206..321,31..33,31..333,3313..326,

36662..37062!

/gene="Mlh1"

/pro%uct="mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type

2 (. coli!, transcript $ariant 81" /note="#eri$e% &y automate% computational analysis using

gene pre%iction metho%' -nomon. +upporting e$i%ence

inclu%es similarity to' 23 +9s, 1 :rotein, an% 100;

co$erage o* the annotate% genomic *eature &y )45se

alignments, inclu%ing 12 samples


5/20

64

+@-5+@@5:A)D:++:-++)B)D:#+#@MM4#+)BM955C:)))4L9+@

L+LA4#)-D9L)ML)4D9?@-@4:AE5L5ADA9BLCLL499BL+L?CAL

C#?54?-@L)L::5:L?#?5ML5L#+:+-E9#-:B-L5C@?LBBB5BML

5#C?+@#-4L-L:LL#+C@::L-L:?L)L59@4E#?+L+B5

@?C+)BACL+5L+-AA+#M:-+:+B:EBE9@DCB5?)+DLL::BD?9#-4 @LAL54L:#LB@?)"

MUTASI GEN MLH1 (K618A) related to Lynch

Sydrome - olorectal arc!noma

E"#on 16 (nt $%&$%-$%&$6) ' AAG (Ly#!n) GG (Alan!ne)

3021 cgtaatgact ttttgtctgc ttgtcctgtt gttaagaata gggacactga aaccagcaat301 ggtgagtggc cgctgcatct cagctgatgc tctatatctg aaccgagttt ggtctgacag

311 gctcaagctt cccactgatc cctctgatcc tgctccttcc caggaaccag caccactctt3201 tgacctcgcc atgctggcct tagacagtcc tga(aag)tggc tggacagagg aagatggccc3261 aaaggaagga cttgcagaat acattgttga gtttttgaag aagaaagccg agatgcttgc3321 agactatttc tctgtggaaa ttgatgaggt gggtagggtc atttggagtt aattttcaga331 taagagtcaa gtccctaggt tgggacaaaa aggctggctt cccctcagaa gcagcagcat31 gtatttctca tacatggtat tttctccatt tctcgtttgc actggagatc agacagccat

FASTA :

gggacactgaaaccagcaatggtgagtggccgctgcatctcagctgatgctctatatctgaaccgagtttggtctgacaggctcaagcttcccactgatccctctgatcctgctccttcccaggaaccagcaccactctttgacctcgccatgctggccttagacagtcctgaaagtggctggacagaggaagatggcccaaaggaaggacttgcagaatacattgttgagtttttgaagaagaaagccgagatgcttgcagactatttctctgtggaaattgatgaggtgggtagggtcatttggagttaattttcagataagagtcaagtccctaggttgggaca

Primer+ utput

4o mispriming li&rary speci*ie%Fsing 1>&ase% seuence positionsGL-G start len tm gc; any 3HseL?9 :)M) 1 20 .7 0.00 3.00 2.00gggacactgaaaccagcaat)-D9 :)M) 171 20 60.01 .00 .00 0.00aggactgtctaaggccagca+AF4 +I' 374LF## )-G4 +I' 37

:)G#F9 +I' 171, :5) 54C GM:L' .00, :5) 3H GM:L' 1.00

1 gggacactgaaaccagcaatggtgagtggccgctgcatctcagctgatgctctatatctg JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ

61 aaccgagtttggtctgacaggctcaagcttcccactgatccctctgatcctgctccttcc

121 caggaaccagcaccactctttgacctcgccatgctggccttagacagtcctgaaagtggc
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_STARThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_LENhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_TMhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_GChttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_ANYhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_REPEAThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_OLIGO_SEQhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_STARThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_LENhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_TMhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_GChttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_ANYhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_REPEAThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_OLIGO_SEQ


6/20

65

KKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

11 tggacagaggaagatggcccaaaggaaggacttgcagaatacattgttgagtttttgaag

21 aagaaagccgagatgcttgcagactatttctctgtggaaattgatgaggtgggtagggtc

301 atttggagttaattttcagataagagtcaagtccctaggttgggaca

BC+ (in or%er o* prece%ence!'JJJJJJ le*t primerKKKKKK right primer

5##9G45L GL-G+ start len tm gc; any 3Hse

1 L?9 :)M) 1 20 .7 0.00 3.00 2.00gggacactgaaaccagcaat )-D9 :)M) 1 20 . .00 .00 1.00

tcttcctctgtccagccact :)G#F9 +I' 1, :5) 54C GM:L' .00, :5) 3H GM:L' 1.00

2 L?9 :)M) 12 20 60.01 .00 .00 3.00tgctggccttagacagtcct )-D9 :)M) 37 20 .6 .00 .00 1.00tgtcccaacctagggacttg :)G#F9 +I' 16, :5) 54C GM:L' .00, :5) 3H GM:L' 3.00

3 L?9 :)M) 17 20 . .00 .00 0.00agtggctggacagaggaaga )-D9 :)M) 37 20 .6 .00 .00 1.00tgtcccaacctagggacttg :)G#F9 +I' 173, :5) 54C GM:L' .00, :5) 3H GM:L' 1.00

L?9 :)M) 12 20 60.01 .00 .00 3.00tgctggccttagacagtcct )-D9 :)M) 2 20 60.10 0.00 .00 0.00caagcatctcggctttcttc :)G#F9 +I' 10, :5) 54C GM:L' .00, :5) 3H GM:L' 1.00+tatistics con too in in no tm tm high highhigh

si% many tar ecl &a% - too too any 3H polyen%

ere% 4s get reg -; clamp lo< high compl compl 8sta& oLe*t 2163 0 0 0 0 0 3 112 0 7 00 31)ight 217 0 0 0 0 0 667 0 0 1 0

37 6:air +tats'consi%ere% , unaccepta&le pro%uct sie 3, o 1primer3 release 1.1.

(primer3results.cgi release 0..0!
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_STARThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_LENhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_TMhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_GChttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_ANYhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_REPEAThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_OLIGO_SEQhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_STARThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_LENhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_TMhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_GChttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_ANYhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_REPEAThttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_OLIGO_SEQ


7/20

66

ANALISIS PRL PRIMR 0

Tm &1* 2 )$3(+ !

Tm &R* 2 )+3') !

Most stable + e>tensible primer/dimers @at +F7A, i any

"e:erse :s. "e:erse /1.24 k*al=mol

5 GG7TGT7TGG77G7 +

HH...........HH

+ 7G77GGT7TGT7GG 5

More stable non/e>tensible primer/dimers @at +F7A, i anyorward :s. orward /1.92 k*al=mol

5 GGG77TG77G7T +

HH..........HH

+ T7G77GT77GGG 5

orward :s. "e:erse /1.4 k*al=mol

5 GGG77TG77G7T +

..HHHH.....

+ 7G77GGT7TGT7GG 5

"e:erse :s. "e:erse /+.+5 k*al=mol

5 GG7TGT7TGG77G7 +

....HHHH....

+ 7G77GGT7TGT7GG 5


8/20

67

Lampiran 4. Komponen mi43 Komposisi P!R3 5an Siklus P!R

$* #it yang digunakan Thermo Scientific DreamTaq PR !aster !i",

#omposisinya sebagai berikut

Komposisi olume

DreamTaq(%polymerase

DreamTaq *uffer

Mg7l2

dT)

d7T)

dGT)

dTT)

/

/

mM

0, mM

0, mM

0, mM

0, mM

'* #omposisi )7" @)7" mi>A, dengan total :olume 15 l.

Komposisi olume

Thermo Scientific DreamTaq PR

!aster !i"@2DA

)rimer orward

)rimer re:erse

(% template

Water

,5 l

1 l

1 l

+ l

2,5l

+* &iklus )7" dalam mengampliikasi gen ML3/1


9/20

68

Lampiran 5. Pengukuran Konsentrasi DNA

*o *o

*1+*o

,&o ,&o

*' 1'

1'

&' ,'

8o

%

*'


10/20

69

No.

SampelKonsentrasi DNA(ng/!"

A230 A260 A280 A320A260/280

A260/230

1 AK # 1$000 0$008 0$003 0$003 0$001 1$000 0$286

2AK ##

7$500 0$038 0$020 0$013 0$005 1$875 0$4553 AK ### 2$500 0$024 0$008 0$006 0$003 1$667 0$238

4 AK #% 0$500 0$023 0$002 0$002 0$001 1$000 0$045

5 AK % 15$5 0$097 0$047 0$035 0$016 1$632 0$383

6 AK& # 6$000 0$049 0$018 0$014 0$006 1$500 0$279

7 AK& ## 8$000 0$050 0$021 0$012 0$005 2$286 0$356

8 AK& ### 19$5 0$073 0$051 0$034 0$012 1$773 0$639

9 AK& #% 12$0 0$059 0$032 0$021 0$008 1$846 0$471

10 AK& % 17$0 0$068 0$042 0$027 0$008 1$789 0$567

11 &K # 28$5 0$105 0$073 0$045 0$016 1$966 0$640

12 &K ## 3$500 0$018 0$008 0$003 0$001 3$500 0$412

13 &K ### 17$0 0$079 0$048 0$033 0$014 1$789 0$523

14 &K #% 4$500 0$011 0$009 0$002 0$000 4$500 0$818

15 &K % 22$0 0$113 0$059 0$038 0$015 1$913 0$449

16 &&K # 3$000 0$016 0$007 0$003 0$001 3$000 0$400

17 &&K ## 8$500 0$028 0$021 0$012 0$004 2$215 0$708

18 &&K ### 3$500 0$017 0$008 0$003 0$001 3$500 0$438

19 &&K #% 17$5 0$083 0$048 0$032 0$013 1$842 0$500

20 &&K % 2$000 0$015 0$006 0$003 0$002 4$000 0$308

Lampiran 6. "asil Deteksi DNA ML"#$ pa5a '( Sampel 6aringan 1iksatif

1ormalin Kolorektal Tikus


11/20

70

Sampel Nama Sampel "asil

1 # I

2 # II

+ # III

# I;5 # ;

4 #! I

#! II

8 #! III

9 #! I;

10 #! ;

11 !# I

12 !# II

1+ !# III

1 !# I;

15 !# ;14 !!# I

1 !!# II

18 !!# III

19 !!# I;

20 !!# ;

Lampiran 7. %thical Approval


12/20

71

Lampiran 8. Protokol Kit Isolasi DNA

P,RLINK7 -NMI! DNA KITS &INTR-N*


13/20

72

KIT !NTNTS 8 PRPARATIN 1 9RKIN- SL,TIN

3ari=tanggal .................................................. Lembar ker


14/20

73

Caktu mulai=akir )k. ..................s=d .........................

DATA SAMPL 0

N. SAMPL T-L PRLAK,AN NAMA PNLITI

1

2

+

5

4

8

9

10

!ARA KR6A 0

N. DSKRIPSI !K

1 K25 mg sampel


15/20

74

@7ampuran 180L )ureLink" Genomi* (igestion !uer 20 !

'roteinase K isiap)an terle*i+ a+,l, se*el,m -aringan

imas,))an paa 1$5 m! mirosentri,ge t,*e"

2 Inkubasi 1/ g, selama + menit, suu 507

&upernatant=lysate dimasukkan pada 1,5 mL mi*ro*entriuge tube

20 ! NAse A$ orte 510 eti) (+omogen"

5 Inkubasi 2 menit suu ruangan @"TA 2507

4 Lysate 200 ! ',re!in) enomi !sis/&ining &,er

(orte 510 eti)$ +omogen" 200 ! 96100 etanol

Masukkan lysate @420 !" )e alam ',relin) spin olo,mnengan olletion t,*e

8 &entriugasi 10.000 > g, selama 1 menit, suu 507

9 !uang *olle*tion tube dan pasangkan spin *oloumn pada *olle*tion

tube baru

10 Tambakan 500 ! enomi as+ &,er 1 )e alam

',relin) spin olo,mn *ersama olletion t,*e

11 &entriugasi 10.000 > g, selama 1 menit, suu 507

12 !uang *olle*tion tube dan pasangkan spin *oloumn pada *olle*tion

tube baru

1+ Tambakan 500 ! enomi as+ &,er 2 )e alam

',relin) spin olo,mn *ersama olletion t,*e

1 &entriugasi 1+.000 > g @maksA, selama + menit, suu 507

15. !uang *olle*tion tube dan pasangkan spin *oloumn pada 1,5

mi*rosentriuge tube

14. Tambakan 100 ! enomi l,tion &,er )e alam

p,relin) spin olo,mn *ersama 1$5 m! mirosentri,ge

t,*e in),*asi 1 menit$ s,+, r,angan (:" 250;

1. &entriugasi 1+.000 > g @ke*epatan maksimalA, selama 1 menit, suu


16/20

75

507@diperole (% genome murniA @#C1A

18. )asangkan )urelink spin *oloumn pada 1,5 mL mi*rosentriuge baru,

tambakan 50 ! enomi l,tion &,er$ in),*asi 1 menit$

s,+, r,angan 250

;

19. &entriugasi 1+.000 > g @ke*epatan maksimalA, selama 2 menit, suu

507 @diperole (% genome murniA @#C2A

20. &impan Larutan (% genome murni pada suu 07 atau /2007

Lampiran 10. Protokol P!R Mi4

PRTKL RT#P!R DRAM -RN#TA: P!R MASTRMI; &T"RM*

3ari=tanggal ....................................................... Lembar ker


17/20

76

Mesin )7" .....................................................

P!R MI; &plate on i

,5 0,0 0,0

2 15 M orward )rimer @1

M inal *on*entrationA

1,0 ,0 8,0

+ 15 M "e:erse )rimer @1M inal *on*entrationA

1,0 ,0 8,0

d32' @water )7" gradeA ,5 18,0 +4,0

5 (% template @aNA 1,0 @aNA 1,0 @aNA 1,0

Total olume $@3(

P!R !NDITIN & >(


18/20

77

garose Gel Elektrooresis .1 B

#ondisi running 80:olt, 200 mmp, 40 menit

N. N.

SAMPL

AMPLIKN

SI &Cp*

IS,ALISASI

AMPLIKN

&/#*

KTRAN-AN

1

2

+

5

4

8

9

10

Lampiran 11. &urat )ernyataan )enelitian

&$"T )E"%OT%

&aya yang bertanda tangan dibawa ini

%ama (ya #en*ana &inangling

%IM G1012091

?udul &kripsi (eteksi Gen ML3/1 pada Ekson 14 ?aringan iksati ormalin Tikus

)uti @Rattus norvegicusA Galur Cistar &tudi #arsinogenesis#olorektal kibat )aparan sap #retek


19/20

78

)embimbing I. dr. (ody %o:rial, &p.)., M.&i.,Med

II. (r. (rs. (aniel ?oko Cayono, M.!iomed.

Menyatakan bawa

1. &kripsi ini merupakan asil karya sendiri bukan asil plagiasi.

2. )elaksanaan penelitian ini merupakan bagian dari payung, dengan susunantim peneliti adala dr (ody %o:rial, &p.)., M&i. Med dan (r. (rs. (aniel

?oko Cayono, M.!iomed.

+. 3ak kekayaan intelektual penelitian berikut data/data asil penelitian men


20/20

79

. (ata )ribadi

1. %ama (ya #en*ana &inangling2. Tempat, Tanggal Lair 7irebon, 5 gustus 199

+. ?enis #elamin )erempuan

. gama Islam

5. #ewarganegaraan Indonesia4. lamat ?alan &ye* Lemaabang=11, #ab. 7irebon

. %o. 3) 081+959188

8. Email dsinanglingPyaoo.*om!. "iwayat )endidikan

2000/2004 &( %egeri 2 Lemaabang #ab. 7irebon

2004/2009 &M) %egeri 1 7irebon2009/2012 &M %egeri 1 7irebon

2012/sekarang )endidikan (okter, akultas #edokteran

$ni:ersitas ?enderal &oedirman7. "iwayat 'rganisasi

2012/201+ nggota M&E7 akultas #edokteran $nsoed

201+/201 #oor. Edukasi M&E7 akultas #edokteran $nsoed

2012/sekarang nggota 3MM# akultas #edokteran $nsoed
mailto:[email protected]:[email protected]

04-Lampiran.doc

Documents

Transcript of 04-Lampiran.doc