6

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Rumput Laut

Rumput laut atau seaweed merupakan salah satu tumbuhan laut yang

tergolong dalam rumput laut benthik yang banyak hidup melekat di dasar

perairan. Rumput laut merupakan ganggang yang hidup di laut dan

tergolong dalam divisi Thallophyta. Secara garis besar, klasifikasi rumput

laut terbagi menjadi 3 kelas utama, yaitu rumput laut hijau (Chlorophyta),

rumput laut merah (Rhodophyta), dan rumput laut cokelat (Phaeophyta)

sebagaimana disajikan pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1. Karakteristik dari Rumput Laut pada Masing-Masing Kelas

Jenis Rumput laut Zat Penyusun dinding sel HabitatHijau (Chlorophyta) Selulosa Air asin, air

tawarMerah (Rhodophyta) CaCO3 (kalsium karbonat),

selulosa, dan produk fotosintetik berupa karaginan, agar, fulcellaran, dan porpiran

Laut, sedikit di air tawar

Cokelat (Phaeophyta) Asam alginate Laut

Sumber: Kimball, 1992; dan Simpson, 2006.

Rumput laut merupakan salah satu kelompok tumbuhan laut yang

mempunyai sifat tidak bisa dibedakan antara bagian akar, batang, dan daun.

Seluruh bagian tumbuhan disebut thallus, sehingga rumput laut tergolong

tumbuhan tingkat rendah (Susanto dan Mucktianty, 2002 dalam Suparmi

dan Sahri 2009). Bentuk thallus rumput laut bermacam-macam, ada yang

bulat seperti tabung, pipih, gepeng, bulat seperti kantong, rambut, dan lain

sebagainya. Thallus ini ada yang tersusun hanya oleh satu sel (uniseluler)

atau banyak sel (multiseluler). Percabangan thallus ada yang thallus

dichotomus (dua-dua terus menerus), pinate (dua-dua berlawanan sepanjang

7

thallus utama), pectinate (berderet searah pada satu sisi thallus utama), dan

ada juga yang sederhana tidak bercabang. Sifat substansi thallus juga

beraneka ragam ada yang lunak seperti gelatin (gelatinous), keras diliputi

atau mengandung zat kapur (calcareous), lunak bagaikan tulang rawan

(cartilagenous), berserabut (spongeous), dan sebagainya dengan berbagai

keanekaragaman warna (Suparmi dan Sahri., 2009).

Bagianbagian rumput laut secara umum terdiri dari holdfast yaitu

bagian dasar dari rumput laut yang berfungsi untuk menempel pada substrat

dan thallus yaitu bentuk-bentuk pertumbuhan rumput laut yang menyerupai

percabangan. Tidak semua rumput laut bisa diketahui memiliki holdfast atau

tidak. Rumput laut memperoleh atau menyerap makanannya melalui sel-sel

yang terdapat pada thallus-nya. Nutrisi terbawa oleh arus air yang menerpa

rumput laut akan diserap sehingga rumput laut bisa tumbuh dan berkembang

biak. Perkembangbiakan rumput laut melalui dua cara yaitu generatif dan

vegetatif. Pertumbuhan dan percabangan thallus rumput laut antara jenis

yang satu dengan yang lainnya berbeda-beda. Bentuk thallus rumput laut

juga bervariasi, antara lain bulat seperti tabung, pipih, gepeng, bulat seperti

kantong, lembaran dan juga ada yang berbentuk seperti helai rambut

(Juneidi, 2004).

2. Rumput Laut di Indonesia

Rumput laut atau lebih dikenal dengan sebutan seaweed merupakan

salah satu sumber daya hayati yang sangat melimpah di perairan Indonesia

yaitu sekitar 8,6% dari total biota di laut (Dahuri, 1998). Luas wilayah yang

menjadi habitat rumput laut di Indonesia mencapai 1,2 juta hektar atau

terbesar di dunia (Wawa, 2005). Di Indonesia jumlah jenis rumput laut

mencapai 629 jenis. Rumput laut yang telah dimanfaatkan misalnya sebagai

bahan obat tradisional mencapai 58 jenis. Jumlah ini terbagi atas kelas

Chlorophyceae 18 jenis, Phaeophyceae 10 jenis, dan Rhodophyceae 30 jenis

(Zaneveld, 1955; Soegiarto et al., 1978; Atmadja et al, 1992 dalam

8

PERHIPBA, 1996). Potensi rumput laut perlu terus digali, mengingat

tingginya keanekaragaman rumput laut di perairan Indonesia

(Suparmi dan Sahri., 2009).

Van Bosse (melalui ekspedisi Laut Siboga pada tahun 1899-1900)

melaporkan bahwa Indonesia memiliki kurang lebih 555 jenis dari 8.642

spesies rumput laut yang terdapat di dunia. Dengan kata lain, perairan

Indonesia sebagai wilayah tropis memiliki sumber daya plasma nutfah

rumput laut sebesar 6,42% dari total biodiversitas rumput laut dunia

(Santosa, 2003; dan Surono, 2004). Rumput laut dari kelas alga merah

(Rhodophyceae) menempati urutan terbanyak dari jumlah jenis yang

tumbuh di perairan laut Indonesia yaitu sekitar 452 jenis, setelah itu alga

hijau (Chlorophyceae) sekitar 196 jenis, dan alga cokelat (Phaeophyceae)

sekitar 134 (Winarno, 1996).

Luas wilayah daratan Indonesia sepanjang 1,9 juta km2 sedangkan

luas wilayah lautannya sepanjang 5,9 juta km2. Data tersebut menunjukkan

bahwa luas perairan laut Indonesia tiga kali lebih besar jika dibandingkan

dengan luas daratan Indonesia (Aprilianto dkk., 2014). Panjang pantai

Indonesia mencapai 95.181 km dengan luas wilayah laut 5,9 juta km2

mendominasi luas total territorial Indonesia sebesar 7,7 juta km2.Wilayah

sebaran jenis rumput laut ekonomis yang penting di Indonesia, tersebar

diseluruh kepulauan. Rumput laut yang tumbuh alami (wild stock) terdapat

di hampir seluruh perairan dangkal Laut Indonesia yang mempunyai

terumbu karang. Produksi rumput laut nasional tahun 2010 mencapai 3,082

juta ton, diatas target yang ditetapkan Kementrian Kelautan dan Perikanan

sebesar 2,574 juta ton. Rumput laut telah menjadi komoditas unggulan dan

menjadi penyumbang utama produksi perikanan budidaya di Indonesia

(Kementrian Kelautan dan Perikanan, 2009).

Berdasarkan UNCLOS (1982) dalam Kementrian Kelautan dan

Perikanan (2011) luas territorial lautan Indonesia yaitu 284.210,90 Km2,

luas Zona Ekonomi Eksklusif 2.981.211 Km2, dan Luas Laut 12 Mil

9

279.322 Km2. Panjang garis pantai Indonesia menurut Baksortanal (2006)

dalam Kementrian Kelautan dan Perikanan (2011) adalah 104.000 Km.

Komoditas rumput laut menjadi salah satu hasil laut yang diunggulkan dan

dikembangkan secara luas, tersebar di seluruh wilayah perairan Indonesia

(mencapai 384.733 ha) dengan target produksi pada tahun 2014 sebesar 8.8

juta ton (Kementrian Perdagangan Republik Indonesia, 2013). Produksi

rumput laut pada tahun 2010-2014 ditunjukkan tabel berikut :

Tabel 2.2 Produksi Rumput Laut Indonesia Tahun 2010-2014Tahun Target (ton) Capaian (ton) Persentase (%)2010 2.672.800 3.915.017 146,482011 3.504.200 5.170.201 147,542012 5.100.000 6.514.854 127,742013 6.500.000 9.298.473,87 125,872014 8.777.600 10.234.357,17 116,60

Sumber: Laporan Kinerja KKP 2014

Jenis rumput laut yang banyak terdapat di perairan Indonesia adalah

Gracilaria, Gelidium, Eucheuma, Hypnea, Sargasum dan Tubinaria. Dari

beragam jenis rumput laut tersebut, yang dibudidayakan, dikembangkan dan

diperdagangkan secara luas di Indonesia hanya jenis karaginofit (di

atarannya Eucheuma spinosium, Eucheuma edule, Eucheuma serra,

Eucheuma cottonii, dan Eucheuma spp), agarofit (Gracilaria spp, Gelidium

spp dan Gelidiella spp), serta alginofit (Sargassum spp, Laminaria spp,

Ascophyllum spp dan Macrocystis spp), yang merupakan bahan baku

berbagai industri karena merupakan sumber karaginan (tepung rumput laut),

agar-agar dan alginat (Kementrian Perdagangan Republik Indonesia, 2011).

3. Pemanfaatan Rumput Laut

Menurut Handayani (2006), terdapat beberapa jenis alga yang dapat

dimanfaatkan sebagai bahan baku beberapa industri makanan, tekstil,

keramik, kosmetik, pupuk, dan fotografi. Hardani (1999) juga melaporkan

alga dapat dimanfaatkan dalam industri pangan dan bahan-bahan kimia,

10

misalnya: Gelidium sp dan Gracillaria sp, spesies penghasil agar yang

digunakan dalam pengalengan ikan dan daging untuk mencegah kerusakan;

pembuatan es krim, minuman, susu, kue, manisan, bahan-bahan kosmetik,

industri cat, dan insektisida; serta mencegah kanker dan agen anti penuaan.

Alga mengandung banyak vitamin dan minerai serta dietary fiber, sehingga

dapat mencegah kegemukan (obesitas) (Wulandari, 2010).

Menurut Yunial (1999) dalam Suparmi dan Sahri (2009)

pemanfaatan rumput laut secara ekonomis sudah dilakukan oleh beberapa

negara. Cina dan Jepang sudah dimulai sejak tahun 1670 sebagai bahan

obat-obatan, makanan tambahan, kosmetika, pakan ternak, dan pupuk

organik. Rumput laut telah dimanfaatkan sebagai makanan sehari-hari bagi

penduduk Jepang, Cina dan Korea. Di Indonesia, sebagian besar rumput

laut hanya dibiarkan sebagai sampah lautan, mengapung, hanyut terbawa

arus, ataupun terdampar di pinggir pantai. Kandungan rumput laut yang

telah dimanfaatkan dalam industri, bidang kesehatan, dan sumber

biopigmen. diantaranya agar, pikokoloid dan karagenan. Kandungan nutrisi

dalam rumput laut yang menjadi dasar pemanfaatan rumput laut di bidang

kesehatan diantaranya polisakarida dan serat, mineral, protein, lipid dan

asam lemak, vitamin serta polifenol. Pigmen rumput laut yang biasa

digunakan dalam berbagai bidang diantaranya klorofil, karotenoid, dan

fikobilin (Suparmi dan Sahri, 2009).

Pada Negara Filipina, Trono dan Ganzon Fortes (1988) mendaftar

sejumlah 352 jenis rumput laut yang termasuk ke dalam 43 marga yang

bernilai ekonomis. Sebanyak 48 jenis dari 26 marga di antaranya dinyatakan

berkhasiat sebagai obat dengan 20 marga diantaranya terdapat di perairan

Indonesia. Beberapa marga yang disebutkan digunakan sebagai obat anti

kesuburan, anti tumor, penyakit jantung dan menurunkan darah tinggi yaitu

marga Acanthophora, Hypnea, Dictyopteris, Sargassum, Stylophora, dan

Ulva (Atmadja, 1996).

11

Masyarakat Indonesia terutama penduduk di daerah pulau-pulau atau

kepulauan pada umumnya sudah memanfaatkan rumput laut di dalam

kehidupannya sehari-hari. Beberapa contohnya adalah dijadikan sebagai

lalab, sayur, makanan, bahan baku kue-kue dan beberapa diantaranya obat-

obatan. Namun pemanfaatan tersebut dilakukan sebagai sesuatu hal yang

bersifat tambahan kebutuhan saja. Pemanfaatan lainnya yaitu dijadikan

agar-agar oleh pabrik atau usaha industri rumah yang ada di Indonesia. Di

Jepang, pemanfaatan rumput laut dilakukan secara optimal dengan

memanfaatkannya sebagai bahan makanan atau keperluan industri, sehingga

kebutuhan impor rumput laut terus meningkat. Di beberapa negara rumput

laut digunakan pada beberapa keperluan misalnya: untuk makanan ternak

(sapi, babi, dan lain-lain), pemupukan (tomat, kentang, ubi, ubi kayu, dan

lain-lain), industri yodium dan lain-lain (Soegiarto et al., 1978).

Beberapa jenis rumput laut di Indonesia yang bernilai ekonomis

seperti Eucheuma sp dan Hypnea sp yang juga disebut carrageenophyte

menghasilkan metabolit primer senyawa hidrokoloid yang disebut

karagenan. Glacillaria sp dan Gelidium sp yang juga disebut agaerophyte

menghasilkan metabolit primer senyawa hidrokoloid yang disebut agar.

Sementara Sargassum sp yang disebut alginophyte menghasilkan metabolit

sekunder yang disebut alginat. Di perairan Indonesia terdapat 28 spesies

yang berasal dari 6 genus. Pemanfaatan rumput laut dapat digunakan dalam

industri pangan, industri farmasi, kosmetik, bioteknologi serta industri non

pangan. Pada industri farmasi dan pangan senyawa metabolit rumput laut

digunakan sebagai suspending agent, thickener, emulsifier, stabilizer, film

former, coating agent dan lain sebagainya. Pada industri kosmetik

penggunaan agar, karagenan dan alginat biasanya digunakan untuk produk

sabun krim, sabun cair, shampo, pasta gigi, pewarna bibir dan produk-

produk pewarnaan kulit seperti hand body lotion dan pencuci mulut serta

hair lotion. Penggunaan agar, karagenan dan alginat dalam industri non

12

pangan diantaranya industri makanan ternak, keramik, cat, tekstil, kertas dan

pembuatan film fotografi (Sudariastuty, 2011).

Gambar 2.1 Diagram Klasifikasi Rumput Laut Komersial dan ProdukOlahannya (Sumber : Sudariastuty, 2011)

4. Persebaran Rumput Laut di BinuangeunBinuangeun berada di Desa Muara, Kecamatan Wanasalam,

Kabupaten Lebak, Provinsi Banten. Secara Geografis Binuangeun terletak

pada 0605018 LS dan 10505258 BT. Perairan Binuangeun terletak di

sebelah selatan Provinsi Banten yang berhubungan langsung dengan

Samudera Hindia. Secara fisiografis Kecamatan Wanasalam mempunyai

bentang lahan dengan kemiringan 0-15% dengan ketinggian tempat 98%

kurang dari 100 mdpl. Binuangun terletak pada wilayah beriklim tropis

dengan curah hujan rata-rata per tahun berkisar antara 2000-3000 mm/tahun

dengan jumlah hari hujan 122-130 hari per tahun. Pada bulan Desember-

Februari Binuangeun memiliki curah hujan yang tinggi dan sering terjadi

Sargassum

G Gigas

Phaeophyta Rhodophyta

Phaeophyceae

Furcales

Sargassaceae

Turbinaria

Alginat

Rhodophyceae

Gigertinales

Solriaceae

Eucheuma

E Cotonii E Spinosum

Hypnea

Hypnea

Gracilariceae

Gracilaria

G Verucossa

Gelidiales

Gelidiaceae

Gelidium

Gelidium Sp

KaragenanAgar

13

angin kencang sehingga dapat memicu timbulnya gelombang yang besar,

sementara pada bulan Mei-September angin relatif tenang sehingga tidak

menimbulkan gelombang besar (Nababan, 2008).Pantai Binuangeun memiliki karakteristik suhu minimum sebesar

29,810C dan suhu maksimum sebesar 30,230C. Sementara pada faktor

salinitas, Pantai Binuangen memiliki nilai salinitas pada kisaran 31.62-

33.63%. Hal ini disebabkan oleh letak Pantai Binuangeun yang

berhubungan langsung dengan Samudra Hindia. Kondisi ini memungkinkan

suhu dan salinitas didaerah pantai berpotensi terjadi pertukaran massa air

dengan Samudera Hindia (Azis, 2007).Kusumawati dan Murdinah (2012) melaporkan Pantai Binuangeun

memiliki persebaran alga coklat yang tinggi. Salah satu lokasi rumput laut

coklat yang melimpah di wilayah Indonesia adalah pantai Binuangeun,

Kabupaten Lebak, Banten, diperkirakan melimpah di sepanjang garis pantai

tersebut (Nursid dkk., 2013). Dinas Kelautan dan Perikanan Kabupaten

Lebak (2012) melaporkan produksi rumput laut Kabupaten Lebak pada

tahun 2012 mencapai 4.900 kg. Beberapa laporan mengenai penelitian

bioprospeksi rumput laut coklat yang berasal dari Binuangeun misalnya oleh

Nursid, et al. (2007) dan Fajarningsih, et al. (2008) yang mengkaji potensi

alga coklat Turbinaria decurrens sebagai bahan anti kanker. Namun sejauh

ini laporan bioprospeksi alga coklat dari jenis lain dari wilayah ini masih

terbatas (Nursid et al., 2013).

5. Senyawa Bioaktif Alga HijauMenggunakan metode Folin Ciocalteu kadar fenol Ulva rigida

diteliti dan dinyatakan dalam mg gallic acid 100g-1 FW. Pada penelitian ini,

alga hijau Ulva rigida ditemukan memiliki kadar total fenol 73 mg gallic

acid 100-1 FW. Pembandingan dengan beberapa sampel Codium fragile,

Dictyopteris divaricata, Scytosiphon lomentaria, Gracilaria gracilis, dan

Ceramium kondoi dihasilkan bahwa kadar total fenol Ulva rigida relatif

lebih tinggi dari rumput laut tersebut. Komponen fenolik telah banyak

mendapatkan apresiasi karena peran pentingnya sebagai molekul

14

antioksidan dan agen chemo-preventive. Celikler et al juga melaporkan

Ulva rigida memiliki aktivitas antigenotoksik yang kuat pada limfosit

manusia secara in vitro dan efek anti hiperglikemik secara in vivo

(Yildiz et al., 2012).Berdasarkan penelitian terkini, secara jelas telah dibuktikan bahwa

ekstrak Enteromorpha compressa mampu meningkatkan fungsi imun

melalui regulasi plasma sel dalam sekresi antibodi IgE terhadap alergen

makanan. Senyawa tertentu pada Enteromorpha compressa bertanggung

jawab atas efek potensial anti alergi terhadap alergen berbeda pada berbagai

haplotype tikus tanpa pengaruh latar belakang genetik. Hasil

memperlihatkan bahwa ekstrak Enteromorpha compressa pada konsentrasi

seperti 0.25 mg dan 0.1 mg per tikus, mampu memperlihatkan penekanan

yang signifikan (P

15

dan Enteromorpha linza berturut-turut menghasilkan nilai IC50 sebesar 70

g/mL, dan 80 g/mL. Hal ini mengindikasikan keduanya merupakan

sumber antioksidan alami yang baik (Narasimhan et al., 2013).Evaluasi terhadap ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis untuk

aktivitas antiproliferative (penghambatan perkembangbiakan) pada sel

kanker serviks HeLa. Polisakarida yang diekstraksi dengan alkali (DAEB)

dari Enteromorpha intestinalis diketahui cocok untuk menghambat

pembentukan Sarcoma 180 tumor dan memiliki beberapa aktivitas

antitumor yang diperantarai oleh peningkatan imun pada sistem imun

sebagai ganti sitotoksisitas secara langsung. Dengan nilai IC50 yang lebih

kecil dibandingkan dengan Rizoclonium riparium (yang diujikan), ekstrak

Enteromorpha intestinalis diketahui lebih bersifat antiproliferative

(Paul dan Kundu, 2013).Pengujian aktivitas antibakteri pada dua spesies alga Enteromorpha

flexuosa dan Gracilaria cortica diteliti. Hasil memperlihatkan bahwa kedua

ekstrak tersebut aktif terhadap kedua patogen yang digunakan yaiktu

Klebsiella pneumonia dan Eschericia coli. Aktivitas maksimum dilaporkan

terdapat pada Enteromorpha flexuosa dengan zona penghambatan terhadap

Klebsiella pneumonia sebesar 2.5 mm, dan Eschericia coli sebesar 3.7 mm.

Hasil ini menunjukkan Enteromorpha flexuosa merupakan sumber senyawa

anti bakteri yang potensial dalam bidang medis (Rebecca et al., 2013).Enteromorpha intestinalis diketahui memiliki aktivitas anti mikroba

secara in vitro. Hasil penelitian memperlihatkan ekstrak metanolik

Enteromorpha intestinalis mampu menghasilkan aktivitas anti mikroba yang

baik terhadap bakteri yang diujikan dengan memproduksi zona

penghambatan dari 8.0- 19.0 mm. Uji time kill mengindikasikan bahwa

ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis mampu secara sempurna

menghambat pertumbuhan MRSA dan juga menunjukkan aktivitas

antibakteri yang berlangsung lama. Berdasarkan hal tersebut dapat

disimpulkan bahwa ekstrak metanolik Enteromorpha intestinalis berpotensi

16

untuk dikembangkan sebagai agen antibakteri dalam bidang farmaseutikal

(Ibrahim dan Lim, 2015).

6. Lektin

Tema riset lektin diperkenalkan pada tahun 1954 oleh William C.

Boyd, dari Universitas Boston, lektin tanaman tersebut atau

phytohemagglutinins, ditunjukkan pada tahun 1940-an yang menjadi

spesifik terhadap tipe darah. Lektin pada hewan pertama kali ditemukan

dalam hati kelinci di tahun 1974. Sementara aktivitas lektin pada hewan

pertama kali dideteksi pada ular di tahun 1902. Grup pertama lektin

spesifik-A ditemukan pada kerang di tahun 1960 yang kemudian diikuti oleh

penemuan grup anti-A lektin pada siput (Kilpatrick, 2002).

Lektin adalah protein pengikat karbohidrat atau glikoprotein non-

imun, dan berperan terhadap pelacak molekul pada sel-sel atau interaksi

antar matrik-sel. Beberapa lektin berfungsi sebagai penanda pada glycomics

dan pada bidang kesehatan karena mampu membedakan struktur

karbohidrat dan mengungkapkan beragam aktivitas biologi melalui

keterikatannya dengan karbohidrat. Interaksi lektin-karbohidart juga

ditemukan dapat memainkan peranan penting dalam mengenal antara

mikroorganisme dengan sel fagositis (seperti granulosit dan makrofag)

memimpin dalam uptakedan membunuh organisme. Fenomena ini

dinamakan dengan lectinophagocytosis, merupakan contoh awal innate

immunity. Tidak seperti antibodi, lektin menunjukkan keanekaragaman

struktur molekuler dan spesifitas pengikatan karbohidrat, tergantung pada

organisme sumbernya (Hung et al., 2012).

Hemaglutinin atau lektin adalah protein pengikat karbohidrat origin

non-immune, mengaglutinasi sel atau mempresipitasi glikokonjugat

(Goldstein et al., 1980). Brooks, et al (2002), Sharon dan Halina (2003),

Varki, et al (1999) dalam Praseptiangga (2013) melaporkan tiap molekul

lektin pada umumnya memiliki 2 atau lebih sisi carbohydrate-binding, tidak

hanya berinteraksi dengan gula di permukaan sel (contoh: eritrosit), lektin

17

juga berinteraksi membentuk ikatan silang dengan molekul-molekul

polisakarida atau glikoprotein dan menginduksi terjadinya presipitasi,

disebut fenomena aglutinasi. Lektin tidak memiliki aktivitas katalitik seperti

enzim. Lektin berbeda dengan antibodi dan bukan produk dari respon imun.

Lektin berguna sebagai alat yang mudah digunakan untuk menunjukan

perbedaan struktur karbohidrat serta memiliki berbagai macam aktivitas

biologis terkait dengan pengikatan dan interaksinya dengan karbohidrat,

sehingga terdapat ketertarikan yang besar dalam upaya untuk menemukan

dan mengisolasi lektin baru dari perspektif penggunaan lektin, khususnya

dalam bidang glikomiks dan medis (Praseptiangga, 2013).

Gambar 2.2 menunjukan interaksi permukaan sel lektin-karbohidrat.

Lektin membawa berbagai jenis sel yang berbeda seperti virus pada sel lain

melalui karbohidrat pada permukaan. Pada beberapa kasus, lektin pada

permukaan sel mengikat terutama glikoprotein (misal asialoglikoprotein),

dikasus lain karbohidrat pada permukaan sel glikoprotein atau glikolipid

pada sisi pengikatan digunakan untuk mengikat molekul biologi aktif lektin

(contoh karbohidat-bakteri spesifik dan toksin tanaman atau galektin).

Berdasarkan original diagram dari BioCarbAB (Lund, Sweden)

(Sharon dan Lis, 2004).

18

Gambar 2.2 Interaksi Permukaan Sel Lektin-Karbohidratmenurut Sharon dan Lis (2004)

Lektin sebagai senyawa bioaktif dapat untuk deteksi immunologi,

biologi sel, penelitian tentang kanker (Hori et al., 1981) dan menghambat

pertumbuhan sel leukimia (Queiroz et al., 2009). Keistimewaan lektin yang

merupakan protein berikatan dengan karbohidrat spesifik juga dapat

digunakan sebagai deteksi beberapa aktivitas biologi seperti aglutinasi sel,

presipitasi polisakarida, aktivitas mitogenik, aktivitas anti tumor, dan

toksisitas (Sharon & Lis, 1972; Lis & Sharon, 1973; Nicolson, 1976; Gold &

Balding, 1975 dalam Hori et al., 1981).

7. Lektin Alga

Lektin pada alga laut telah diteliti dalam berbagai penelitian dengan

alga yang diperoleh dari Puerto Rico (Boyd et al., 1966), Inggris (Blunden

et al.,1975, 1978; Rogers et al., 1980), Jepang (Hori et al., 1981, 1988),

Spanyol (Fabregas et al., 1985, 1992), USA (Chiles dan Bird, 1989; Bird et

al., 1993), dan Brazil (Ainouz dan Sampaio, 1991; Ainouz et al., 1992;

Freitaz et al., 1997), lebih dari 200 spesies alga telah dilaporkan

mengandung hemaglutinin. Jepang (Hori et al.,1981), China (Wang et al.,

2004), Vietnam (Hung et al., 2007), Pakistan (Alam dan Usmanghani 1994),

dan India (Kumar dan Barros 2010) tercatat merupakan negara Asia pelaku

riset terkait lektin alga (Hung et al., 2012).

20 spesies alga laut Brazil (16 alga merah dan 4 alga hijau) dianalisis

aktivitas hemaglutinasi menggunakan darah manusia golongan A, B, O dam

AB yang diperlakukan dengan enzim, kemudian ditambahkan darah ayam,

kelinci, domba, kambing dan sapi. Ekstrak salin dari 10 alga mengaglutinasi

eritrosit kelinci, 7 mengaglutinasi eritrosit ayam, 6 mengaglutinasi darah

sapi, dan 4 mengaglutinasi eritrosit domba. Darah kambing tidak

teraglutinasi dengan semua ekstrak alga yang diuji. Aglutinasi non spesifik

sel darah merah manusia dijumpai pada ekstrak 2 alga merah (Gracilaria

19

ferox dan Hypnea musciformis) dan 1 alga hijau (Caulerpa cupressoides)

(Ainouz dan Sampaio, 1991).

44 spesies ekstrak alga Vietnam terdiri dari 15 alga hijau, 18 alga

merah, dan 11 alga coklat dengan berbagai eritrosit hewan dan eritrosit

manusia tanpa perlakuan enzim dan dengan perlakuan enzim. Aktivitas

hemaglutinasi paling kuat pada ekstrak dari dua Klorofita (Anadyomene

plicata dan Avrainvillea erecta) dan empat Rhodofita (Gracilaria

eucheumatoides, Gracilaria salicornia, Kappaphycus alvarezii, dan

Kappaphycus striatum) dengan eritrosit kelinci perlakuan enzim dan eritrosit

domba. Pada uji penghambatan aktivitas hemaglutinasi dengan berbagai

monosakarida dan glikoprotein, tidak ada satupun hemaglutinin yang

memiliki afinitas dengan monosakarida, kecuali Codium arabicum dan

Gracilaria euchematoides dimana aktivitasnya dihambat N-acetyl-D-

galactosamine dan N-acetyl-D-glucosamine (Hung et. al., 2009).Dua belas macam lektin diisolasi dari empat spesies alga, Boodles

coacta (Alga hijau), Hypnea japonica (Alga hijau), Carpopeltis flabelata

(Alga merah) dan Solieria robusta (Alga merah) untuk kemudian dicatat

karakteristik kimia dan biologinya. Lektin alga mampu mengaglutinasi

dengan kuat eritrosit kelinci yang diberikan perlakuan enzim tripsin dan

aktivitasnya biasanya dihambat glikoprotein yang berhubungan dengan N-

glikan. Rata-rata lektin alga tidak memiliki afinitas dengan monosakarida.

Karakter inilah yang membuatnya sulit untuk diisolasi menggunakan

kromatografi afinitas dengan gula sederhana seperti pada ligan dan eluan.

Sementara itu aktivitas hemaglutinasi pada alga tidak terpengaruh dengan

pemanasan pada suhu 100oC selama 30 menit. Berhubungan dengan

kemampuan aglutinasi sel oleh lektin, secara umum dapat dijelaskan bahwa

lektin memiliki satu sisi pengikatan setiap satu atau dua unit, dan karena

hubungan sub unit ini, memiliki minimal dua sisi pengikatan yang dapat

mengaglutinasi sel (Hori et al., 1990).Eksperimen biokimia berdasarkan uji aglutinasi mengungkapkan

adanya aktivitas hemaglutinasi pada banyak ekstrak alga terhadap eritrosit

20

dari beberapa spesies binatang. Pada banyak studi, aktivitas hemaglutinasi

ini diartikan sebagai keberadaan protein atau glikoprotein yang memiliki

spesifisitas untuk secara selektif mengikat struktur karbohidrat pada sel

darah merah. Protein tersebut banyak ditemukan pada berbagai jenis

organisme, juga dilaporkan ada pada beberapa jenis alga (Boyd et al., 1966).

Banyak lektin rumput laut memiliki massa molekul yang lebih

rendah dibandingkan lektin dari tanaman lain pada umumnya, memiliki

bentuk monomerik, termostabil, dan aktivitas hemaglutinasi yang tidak

dipengaruhi oleh kehadiran kation divalen. Lektin tidak memiliki afinitas

terhadap gula sederhana melainkan terhadap gula yang lebih kompleks

seperti oligosakarida, terlebih glikoprotein, seperti yang ditemukan pada

hewan (Hori et al., 1990; Rogers dan Hori, 1993). Studi karakterisasi

menunjukkan bahwa banyak lektin alga, terutama dari alga merah, memiliki

karakter umum yaitu ukuran molekul yang kecil, bentuk monomerik, tidak

memiliki afinitas terhadap monosakarida, memiliki stabilitas suhu dan

divalent cation-independent yang mengindikasikan bahwa alga adalah

sumber lektin yang baik (Hung et al., 2009).

Banyak lektin alga dilaporkan memiliki aktivitas anti-tumor terhadap

sela kanker manusia (Karasaki et al, 2001; Timoshenko et al, 2001; Wang et

al, 2000). Kemampuan active targeting terhadap tumor secara spesifik

sering diteliti dengan mengimobilisasi ligan spesifik tumor (antibodi,

peptida, atau sakarida) kedalam sistem drug-carrier (Forssen dan Wills,

1998; Peer et al, 2007; Trochilin, 2005). Selain itu lektin turunan dari alga

laut juga kaya akan komponen antiviral. Aktivitas antiviral bergantung pada

kemampuan mengikat oligosakarida yang mengandung manosa yang ada

pada permukaan virus yang ditutupi oleh glikoprotein. Interaksi spesifik

lektin alga dengan glikan target pada permukaan virus akan menekan

inveksi virus (Balzarini, 2007).

Studi terkini menunjukkan bahwa rumput laut lektin juga terlibat

dalam aktivitas in-vitro atau in-vivo imunomodulatori, anti tumor, dan anti

21

kanker (Kawakubo et al., 1997; Sugahara et al., 2001; Neves et al., 2001;

dan Pinto et al., 2009). Lektin dari alga meah Griffithsia sp. adalah inhibitor

multiplikasi HIV paling potensial (Mori et al., 2005) atau lektin ESA-2 dari

alga merah Eucheuma serra yang memiliki spesifitas tinggi terhadap high

mannose N-glycans dan menunjukkan aktivitas anti-HIV (Hori et al., 2007).

Lektin dari berbagai alga seperti CV-N dari Nostoc ellipsosporum (Boyd et

al., 1997), SVN dari Scytonemavarium (Bokesch et al., 2003), MVL dari

Microcystis viridis (Bewley et al., 2004), dan OAA dari Oscillatoria

agardhii (Sato et al., 2007), memiliki potensi lebih besar sebagai anti-HIV

dibandingkan dengan lektin pengikat manosa dan lektin pada tanaman darat.

Hal ini menunjukkan bahwa alga dapat menjadi sumber dominan lektin

yang bermanfaat dalam aplikasi biokimia dan biomedikal

(Hung et al., 2012).

8. Pengujian Aktivitas HemaglutinasiLektin spesifik golongan darah manusia berperan penting pada siklus

pendugaan awal struktur dasar spesifisitas antigen dengan sistem darah

ABO. Tahun 1950, Walter J.T. Morgan dan Winifred M. Watkins dari Institut

Lister, London menemukan aglutinasi sel darah merah tipe A terhadap lektin

lima bean yang menghambat dengan baik ikatan -N-acetyl-D-

galactosamine dan eritrosit O oleh lektin dari L. tetragonolobus dihambat

dengan baik ikatan -L-fucose. Mereka menyimpulkan bahwa -N-acetyl-D-

galactosamine dan -L-fucose menentukan golongan darah A dan O masing-

masing secara spesifik. Kesimpulan ini kemudian diperkuat dengan

penelitian selanjutnya (Sharon dan Lis, 2004). Pada eritrosit manusia,

aglutinasi eritrosit golongan darah A, B, dan O terjadi karena pengikatan

yang kuat oleh lektin secara berturut-turut pada gugus N-acetyl-D-

22

galactosamine, D-galactose, dan L-fucose pada permukaannya

(Khan et al., 2002).

Bentuk sistem imun antibodi berlawanan dengan dengan antigen

golongan darah ABO tidak ditemukan di sel darah merah manusia.

Golongan darah A memiliki antibodi anti-B dan golongan darah B memiliki

antibodi anti-A. golongan darah O secara umum memiliki antibodi anti A-

dan anti-B pada serumnya. Golongan darah AB tidak memiliki antibodi anti-

A dan anti-B pada serum. Tabel 2.3 menunjukan sistem penggolongan darah

manusia.

Tabel 2.3 Sistem Penggolongan Darah Manusia

Golongan Darah Antigen pada Sel DarahMerah

Antibodi pada serum

A A Anti-BB B Anti-A

AB A dan B Tidak memilikiO Tidak memiliki Anti-A dan Anti-B

Sumber: Dean, 2005

Antibodi ABO terdapat secara alami di dalam serum.pembuatan

antibodi ini distimulasi ketika sistem imun bertemu dengan antigen

golongan darah ABO pada makanan atau mikroorganisme. Hal ini terjadi

pada usia dini karena gula yang identik dengan golongan darah ABO

ditemukan di seluruh alam. Alel A mengkode Glycosyltransferase yang

menghasilkan antigen A dan memiliki gula imunodiminan N-Acetyl

galactosamine. Alel B mengkode Glycosyl transferase menghasilkan antigen

B dan memiliki gula imunodominan D-Galaktosa (Dean, 2005).

Rogers, et al (1980) dan Hori, et al (1988) melaporkan bahwa

aktivitas hemaglutinasi lebih terdeteksi ketika eritrosit diberikan perlakuan

enzim (enzyme treated). Ainouz, et al (1991) menunjukkan bahwa eritrosit

kelinci lebih sensitif terhadap lektin makroalga dibandingkan dengan

eritrosit manusia, terutama ketika sel diberikan perlakuan enzim. Efek dasar

yang dihasilkan oleh eritrosit dengan perlakuan enzim proteolitik adalah

pembebasan sialoglikoprotein dari permukaan sel, sehingga menurunkan

23

muatan negatif permukaan pada sel dan memfasilitasi aglutinasi yang

dilakukan oleh lektin (Rogers dan Hori, 1993).

Efek kation divalen, pH, dan suhu terhadap aktivitas hemaglutinasi

pada hemaglutinin dari beberapa spesies alga Vietnam diteliti (Amansia

rhodantha, Avrainvillea obscura, Boodlea composita, Dictyosphaeria

versluysii, Dictyosphaeria cavernosa, Halimeda discoidea, Gelidiopsis

scoparia, dan Valonia fastigiata). Mayoritas aktivitas hemaglutinasi

agglutinin alga tersebut tidak berubah setelah dialisis dengan 50mM EDTA

dan dengan penambahan 10mM CaCl2 atau MgCl2, kecuali lektin

Gelidiopsis scoparia yang aktivitasnya mengalami sedikit penurunan setelah

di dialisis dengan EDTA. Penambahan CaCl2 atau MgCl2 pada konsentrasi

10mM mengembalikan hampir semua aktivitas hemaglutinasi seperti

semula. Aktivitas hemaglutinasi Dictyosphaeria versluysii dan Halimeda

discoidea tidak berubah setelah pemanasan pada 1000C selama 30 menit.

Lektin Amansia rhodantha, Avrainvillea obscura, Dictyosphaeria

cavernosa, dan Valonia fastigiata juga bersifat termostabil karena

aktivitasnya tidak berubah dalam pemanasan pada 80-900C selama 30 menit.

Namun aktivitas hemaglutinin tersebut hilang seluruhnya pada pemanasan

1000C selama 30 menit. Disisi lain, hemaglutinin Gelidiopsis scoparia

bersifat labil terhadap panas karena aktivitasnya menurun secara signifikan

dengan suhu inkubasi mencapai 500C. Hemaglutinin alga lainnya cukup

stabil pada rentang suhu yang relatif luas. Mayoritas hemaglutinin alga yang

diuji mampu mempertahankan aktivitasnya pada range pH yang luas

diantara 5 dan 9 dengan sedikit penurunan aktivitas pada media yang lebih

asam dan basa. Pengecualian terjadi pada Boodlea composita,

Dictyosphaeria versluysii dan Valonia fastigiata yang tidak berubah pada

rentang pH 3-9 (Hung et al., 2012).

15 Spesies alga Vietnam diuji spesifisitas masing-masing

hemaglutininnya menggunakan presipitat ammonium sulfat dari masing-

masing ekstrak, dengan pengujian hemaglutinasi inhibisi meggunakan

24

berbagai jenis monosakarida dan glikoprotein. Hasil penelitian

menunjukkan aktivitas hemaglutinasi spesies alga tersebut tidak dihambat

oleh berbagai monosakarida yang diujikan, kecuali ekstrak Codium

arabicum dan Gracilaria eucheumatoides. Di sisi lain aktivitas

hemaglutinasi mampu dihambat oleh glikoprotein terikat high mannose N-

glycan, Complex N-glycan, atau O-glycan. Karakteristik hemaglutinasi

inhibisi dengan berbagai jenis glikoprotein berbeda tergantung spesies

hemaglutininnya. Tanpa mengabaikan hemaglutinin Boodlea struveoides,

Kappaphycus alvarezii, dan Eucheuma denticulatum, yeast mannan terikat

high mannose N-glycan adalah inhibitor terkuat, dan porcine stomach

thyroglobulin terikat high mannose dan complex N-glycan juga merupakan

inhibitor yang baik. Hasil ini mengindikasikan bahwa spesies alga ini

masing-masing mengandung paling sedikit, lektin spesifik untuk high

mannose N-glycan (Hung et al., 2009).

9. Pemurnian LektinPemurnian protein adalah salah satu cara untuk memisahkan protein

dari protein jenis lain dan kontaminannya. Secara umum, pemurnian protein

dibagai menjadi tiga tahap, yaitu ekstraksi, pemekatan, dan fraksinasi. Salah

satu tujuan pemurnian protein adalah untuk mengidentifikasi fungsi dan

struktur protein. Komponen protein yang murni dari protein lain dan

senyawa kontaminan dapat digunakan untuk keperluan medis, farmasi, dan

penelitian biokimia karena spesifisitasnya yang tinggi (Lehninger, 1993).Tahap awal dari proses pemurnian adalah mengisolasi protein dari

sumber yang memproduksinya baik sel tanaman, hewan, maupun

mikroorganisme. Protein ekstraseluler yang disekresikan ke dalam medium

diperoleh melalui pemisahan sel dari media fermentasi dengan teknik filtrasi

dan sentrifugasi. Protein target berada dalam medium bebas sel yang

biasanya dalam bentuk yang sangat encer. Sedangkan untuk protein

intraseluler, sel dipanen dan diresuspensi dalam larutan buffer atau air

25

kemudian dipecahkan agar dapat dipisahkan proteinnya saja

(Ellyasheva dan Rachman, 2005). Protein target biasanya berada dalam bentuk terlarut sehingga perlu

dilakukan proses pemekatan. Metode pemekatan yang umum dilakukan di

laboratorium adalah: (1) pemekatan dengan pengendapan/presipitasi

menggunakan garam ammonium sulfat atau pelarut; (2) pemekatan

menggunakan ultrafiltrasi. Pengendapan menggunakan ammonium sulfat

adalah salah satu cara yang paling sering digunakan dan populer karena

kelarutannya yang tinggi, murah, tidak menyebabkan denaturasi protein dan

memiliki efek stabilitas pada protein. Penambahan ammonium sulfat dapat

meningkatkan kelarutan protein (salting-in) dan penambahan garam

selanjutnya akan mendestabilisasi protein sehingga protein akan mengendap

(salting-out). Pemekatan dengan pengendapan garam biasanya tidak

memberikan peningkatan kemurnian yang tinggi, namun memberikan

rendemen (yield) tinggi. Pelarut yang biasa digunakan dalam pemekatan

protein adalah etanol, isopropanol, aseton, dan dietil eter. Larutan protein

dapat juga dipekatkan dengan menggunakan ultrafiltrasi. Pemekatan protein

menggunakan ultrafiltrasi dengan ukuran pori membrane 1-20 nm cukup

untuk menahan protein berbobot molekul rendah (Nurachman, 2006).Kromatografi merupakan metode yang kuat untuk deteksi dan

purifikasi substansi biologi. Prinsip dari pemisahan menggunakan

kromatografi adalah pengelompokan atau pembagian molekul yang terpisah

diantara dua fase yang bercampur yang disebut fase gerak dan fase stasioner.

Metode kromatografi diklasifikasikan berdasarkan kriteria yang berbeda

termasuk bentuk fisik fase stasioner, sifat fase gerak dan atau fase stasioner,

mekanisme pemisahan atau sifat sistem kromatografi. Sebagai contoh,

kromatografi kertas disebut demikian berdasarkan material yang digunakan

pada fase stasioner; kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom

dinamakan berdasarkan bentuk fisik pada fase stasioner. Kromatografi gas-

cair memiliki fase gerak gas dan fase stasioner cair. Berdasarkan mekanisme

pemisahan kromatografi diklasifikasikan sebagai kromatografi pengisapan,

26

kromatografi pemisahan, kromatografi size-exclusion, kromatografi penukar

ion dan afinitas, serta kromatografi interaksi hidrofobik (Sattayasai, 2012).a. Hydrophobic Interaction Cromatography (HIC)

Terdapat beberapa tahapan proses selama HIC yaitu

equilibration, sample application, elution 1, elution 2, elution 3, dan

wash. Pada tahap equilibration HIC medium diekuilibrasi menggunakan

start buffer dengan kadar garam berkonsentrasi tinggi. Pada tahap

sample application, start buffer menyebabkan protein hidrofobik

berikatan dengan ligan hidrofobik pada medium, sehingga menjadi

terkonsentrasi pada kolom. Pada tahap ini, protein yang tidak cukup

hidrofobik akan terelusi selama atau hanya setelah injeksi sampel. Pada

tahap elution 1, akan terjadi pengurangan kadar garam (menggunakan

linear gradient) yang menyebabkan protein hidrofobik terelusi dengan

protein yang memiliki hidrofobisitas paling kecil akan terelusi pertama.

Pada tahap elution 2, pengurangan garam yang masih berlanjut akan

terus mengelusi protein sehingga hanya yang paling hidrofobik saja yang

tertinggal (semakin rapat terikat). Pada elution 3, ketika medium sudah

bebas dari garam, protein yang paling hidrofobik juga akan terlepas

bersamaan dengan protein yang memiliki hidrofobisitas sejenis. Pada

tahap wash, kondisi bebas garam akan menghilangkan semua ikatan

hidrofobik protein sebelum memasuki tahap re-equilibration

(GE Healthcare, 2006). Hydrophobic Interaction Cromatography (HIC) merupakan

metode kromatografi yang memisahkan protein berdasarkan

hidrofobisitas, sama seperti reverse-phase liquid chromatography

(RPLC). Fase stasioner pada kromatografi ini merupaka ligan hidrofobik

yang terhubung dengan matriks. Namun, tingkat hidrofobisitas dan

jumlah ligan pada kromatografi ini lebih sedikit dari RPLC. HIC cocok

untuk purifikasi protein dengan kondisi penggunaan kondisi elusi protein

yang diserap tidak terlalu ekstrim. Ligan hidrofobik pada HIC utamanya

merupakan kelompok alkil (etil hingga oktil) atau fenil atau kelompok

27

poliamida; matriksnya berikatan silang dengan agarosa atau silica. Untuk

prosedur umum HIC, sample dimasukkan kedalam kolom yang telah

diekuilibrasi dengan fase gerak yang secara keseluruhan mengandung

kadar garam tinggi. Protein yang diserap selanjutnya dielusi dengan

pelarut yang mengurangi konsentrasi garam menjadi semakin rendah.

HIC sangat cocok untuk pemisahan protein setelah metode presipitasi

dengan garam/kromatografi penukar ion sejak protein telah larut dalam

larutan garam konsentrasi tinggi. HIC mampu membuka kemungkinan

baru untuk pemurnian sejumlah biomolekul seperti protein reseptor dan

protein membrane (Walker, 2005).HIC adalah step kolom pertama yang logis untuk protein yang

sebelumnya telah mengalami perlakuan presipitasi dengan ammonium

sulfat. Sampel awal dapat disimpan secara aman pada suhu rendah untuk

waktu yang lama dalam ammonium sulfat jenuh. Ketika akan

dilanjutkan ke proses purifikasi, sampel perlu dithawing, disesuaikan

dengan konsentrasi ammonium sulfat yang sesuai, dan dimasukkan

kedalam kolom HIC yang telah diekuilibrasi menggunakan ammonium

sulfat dengan konsentrasi yang sama. Adapun pengonsentrasian ini

dimaksudkan untuk meningkatkan ikatan ligan dengan protein target.

HIC memberikan pemisahan yang signifikan dengan menjaga protein

pada medium yang stabil. Jika ammonium sulfat harus dijaga pada

konsentrasi yang tinggi, maka dapat digunakan medium hidrofobik yang

lemah (butil agarosa, atau metil agarosa). Dengan menggunakan medium

HIC yang lemah akan menjamin konsentrasi ammonium sulfat dapat

dijaga tetap tinggi, baik untuk pengikatan, maupun elusi, sehingga garam

penstabil selalu ada. Jika stabilitas pada tahap awal bukan merupakan

fokus utama, maka medium dengan pengikatan yang kuat seperti fenil

agarose dapat digunakan. Jika, seperti kebanyakan kasus pada fenil

agarosa, maka dibutuhkan elusi menggunakan air buffer (atau alkohol

konsentrasi rendah dalam larutan buffer) (Ward, 2009).

28

Media HIC terdiri dari ligan yang mengandung kelompok alkil

atau aril yang berpasangan dengan matriks inert yang berbentuk partikel

bulat. Matriks tersebut berpori yang dimaksudkan untuk memberikan

luas permukaan internal yang tinggi, dimana ligan memainkan peran

penting dalam hidrofobisitas akhir medium. Ketika ligan secara

signifikan berkontribusi terhadap derajat hidrofobisitas medium, matriks

juga dapat mempengaruhi selektivitas akhir. Keseimbangan optimal

diantara porositas dan ukuran partikel pada matriks akan memberikan

area permukaan yang besar yang dapat ditutup oleh ligan yang akan

memastikan kapasitas pengikatan yang tinggi. Porositas tinggi dengan

struktur pori terbuka merupakan keuntungan ketika memisahkan

biomolekul berukuran besar. Stabilitas fisik yang tinggi juga akan

memastikan volume medium yang telah dikemas akan tetap (tidak

berkurang) walaupun terjadi perubahan ekstrim pada konsentrasi garam

atau pH, sehingga akan meningkatkan reproduktifitas dan mencegah dari

kemungkinan melakukan packing kolom kembali. Selain itu, stabilitas

fisik yang tinggi, disertai keseragaman ukuran partikel akan

memfasilitasi flow rate yang tinggi, terutama selama tahap cleaning atau

re-equilibration (GE Healthcare, 2006).Beberapa faktor utama yang harus dipertimbangkan ketika

memilih media HIC dan optimalisasi proses pemisahan menggunakan

media HIC adalah: (1) tipe ligan dan derajat substitusi, (2) tipe matriks

dasar, (3) tipe dan konsentrasi garam, (4) pH , dan (5) temperatur. Tipe

ligan yang diimobilisasi (alkil atau aril) menentukan terutama

selektivitas penyerapan protein pada adsorbent HIC. Secara umum, ligan

alkil rantai lurus (hidrokarbon) menunjukan karakter hidrofobik alami,

dimana ligan aril menunjukkan sifat gabungan dimana baik interaksi

hidrofobik dan aromatik mungkin terjadi. Selain itu juga dapat diketahui,

pada derajat substitusi yang konstan, kapasitas pengikatan terhadap

protein pada adsorbent HIC akan meningkat dengan bertambah

29

panjangnya rantai alkil. Sementara pada faktor kedua, yaitu tipe matriks

dasar, dua tipe pendukung yang secara luas digunakan adalah

karbohidrat hidrofilik kuat seperti cross-linked agarose, atau material

kopolimer sintetis. Pada ligan yang sama selektivitas yang dihasilkan

pada kopolimer tidak akan sama dengan agarose. Pada faktor ketiga,

ketika konsentrasi garam meningkat, jumlah protein yang terikat juga

akan meningkat hampir linear sampai pada konsentrasi garam spesifik,

dan berlanjut meningkat pada konsentrasi yang masih tinggi. Tipe garam

juga mempengaruhi HIC. Sodium, potassium, ammonium sulfat masing-

masing menghasilkan presipitasi yang tinggi. Garam tersebut akan

meningkatkan interaksi hidrofobik secara efektif dan memberikan

pengaruh kestabilan pada struktur protein. Sementara pengaruh pH

secara umum adalah ketika pH meningkat akan melemahkan interaksi

hidrofobik, yang diduga sebagai hasil dari peningkatan titrasi kelompok

bermuatan, sehingga meningkatkan hidrofilisitas protein. Sementara

penuruan pH akan menghasilkan peningkatan interaksi hidrofobik.

Berdasarkan hal tersebut protein yang tidak terikat dengan ligan HIC

pada pH netral, akan mengikat pada pH asam. Efek terakhir, yaitu

temperatur telah dibuktikan oleh teori yang dikembangkan oleh Hjerten.,

yang melaporkan bahwa interaksi hidrofobik zat terlarut dalam air akan

meningkat seiring dengan peningkatan temperatur. Bukti eksperimental

telah dilaporkan oleh Hjerten dan Jennisen yang melaporkan bahwa gaya

van der waals yang menggerakkan interaksi hidrofobik juga akan

meningkat seiring dengan peningkatan yang terjadi pada temperatur

(Amersham Pharmacia Biotech, 1993). b. Reverse Phase Chromatography (RPC)

Secara teori, HIC dan Reverse-Phase Chromatography (RPC)

sangat berhubungan dengan teknik kromatografi cair. Namun secara

praktik keduanya berbeda. Adsorben RPC lebih banyak disubstitusi

dengan ligan hidrofobik dibandingkan dengan adsorben HIC. Derajat

substitusi adsorben RPC biasanya beberapa ratus mol/ml gel C4-C18

30

ligan alkil. Sebagai konsekuensi, pengikatan protein pada adsorben RPC

biasanya lebih kuat, yang dibutuhkan penggunaan pelarut non-polar

untuk elusinya. RPC telah menemukan aplikasi yang luas dalam

pemisahan analitis terutama pada peptida dan protein dengan berat

molekul rendah yang stabil pada pelarut cair organik

(Amersham Pharmacia Biotech, 1993).RPC telah menjadi teknik pemisahan dan analisis protein

beresolusi tinggi yang sangat penting. Teknk ini ideal digunakan untuk

aplikasi seperti pemetaan peptida, atau pengecekan kemurnian, dan

seringnya digunakan untuk final polishing oligonukleotida dan peptida.

RPC memisahkan molekul berdasarkan perbedaan hidrofobisitasnya.

Secara teori RPC dan HIC sangat berhubungan erat karena keduanya

menggunakan prinsip berdasarkan interaksi diantara patch hidrofobik

pada permukaan biomolekul dan permukaan hidrofobik medium

kromatografi. Namun secara praktik kedua teknik ini sangat berbeda.

Permukaan medium RPC biasanya lebih hidrofobik dari medium HIC.

Hal ini menyebabkan interaksi yan lebih kuat dimana agar elusi berjalan

sukses, harus berbalik menggunakan pelarut organik non polar seperti

asetonitril atau metanol. RPC menawarkan fleksibilitas yang baik dalam

kondisi pemisahan. Separasi dengan resolusi sangat tinggi dapat dicapai

dengan memisahkan komponen yang memiliki perbedaan hidrofobisitas

yang sangat sedikit. RPC juga dapat digunakan untuk memisahakan

molekul yang memiliki perbedaan hidrofobisitas signifikan

(GE Healthcare, 2006).

10. Penentuan Berat Molekul LektinSebagai akibat tingginya kebutuhan polimer, maka telah

dilakukan penelitian dan pengembangan secara berkelanjutan pada

polimer. Salah satu penelitian pada polimer adalah menentukan berat

molekul polimer (Mn). Dengan mengetahui berat mtolekul polimer (Mn),

akan dapat diketahui karakteristik polimer tersebut. Hal tersebut akan

31

memudahkan dalam penyesuaian penggunaan polimer dengan tepat

(Billmeyer dalam Nugraheni dkk., 2015).Berat molekul merupakan variabel yang istimewa karena

berhubungan langsung dengan sifat kimia polimer. Umumnya polimer

dengan berat molekul tinggi mempunyai sifat yang lebih kuat. Banyak

sekali bahan polimer yang tergantung pada massa molekulnya

(Cowd dalam Habibah dkk., 2013).

a. SDS-PAGEElektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di

dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya

tergantung pada muatan, ukuran, dan bentuk setiap molekul yang

terlibat. Pada pemisahan protein metode yang paling umum digunakan

adalah dengan cara elektroforesis menggunakan discontinuous

polyacrylamide gel sebagai medium penyangga dan sodium dodecyl

sulfate (SDS) untuk mendenaturasi protein. Metode ini disebut sebagai

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-

PAGE) atau dapat disebut juga metode Laemmli (Wibowo, 2011).Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(SDS-PAGE) adalah teknik satu dimensi berresolusi tinggi, yang cocok

untuk pemisahan analitis terhadap penyusun polipeptida pada campuran

protein kompleks. Denaturasi protein dengan SDS dan agen pereduksi,

menghasilkan polipeptida yang terikat dengan SDS pada rasio berat yang

konstan sehingga mobilitas elektroforesis merupakan fungsi penentuan

berat molekul. Namun teknik ini memiliki kelemahan, yaitu hanya

mampu mengeksploitasi satu parameter fisikokimia, yang

memungkinkan masing-masing pita protein memiliki lebih dari satu

komponen polipeptida yang akan menghalangi identifikasi

(Marshall, 1964).

32

Faktor kunci pada sistem elektroforesis gel adalah gel itu sendiri.

Gel menentukan laju migrasi protein dan penahanan protein ditempat

ketika mencapai akhir proses hingga dapat dilakukan staining untuk

peneraan. Gel poliakrilamid merupakan medium dasar yang paling

cocok untuk elektroforesis protein. Gel tersebut memberikan range

ukuran pori yang cocok untuk penyaringan protein. Keunggulan lainnya

adalah reaksi polimerisasi akan mudah terjadi dan mampu diproduksi

kembali, ukuran pori dapat ditentukan dengan kondisi polimerisasi dan

dapat dengan mudah diubah dengan mengubah konsentrasi monomer,

gel bersifat hidrofilik dan bermuatan netral ketika dibuat, serta

transparan terhadap cahaya pada panjang gelombang 250 nm dan tidak

mengikat pewarna protein. Gel dapat berperan sebagai penyaring

molekular untuk molekul protein. Gel terdiri atas jaringan tiga dimensi

material solid dan pori. Selama elektroforesis pada gel, material

polimerik berperan sebagai barrier terhadap gerakan protein,

menekannya untuk bergerak diantara pori yang telah diisi oleh buffer

pada gel. Pada pembentukan gel akrilamid, sistem kimia yang sering

digunakan untuk membentuk radikal bebas yang dibutuhkan untuk

polimerisasi terdiri atas ammonium persulfate (APS), dan N,N,N,N-

tetramethylethylenediamine (TEMED). TEMED berfungsi untuk

mempercepat dekomposisi molekul persulfat menjadi radikal bebas

sulfat yang selanjutnya akan menginisiasi polimerisasi. Basa bebas

TEMED dibutuhkan untuk reaksi ini, sehingga polimerisasi sangat

efisien pada pH basa. Laju polimerisasi bergantung pada (1) konsentrasi

jaringan monomer dan inisiator, (2) temperatur, dan (3) kemurnian

reagen. Reagen yang digunakan harus standar elektroforesis dan air yang

digunakan harus benar-benar air deionisasi atau akuades. Untuk hasil

dengan kualitas tertinggi, oksigen terlarut harus dihilangkan dari

campuran monomer dengan menghilangkan gasnya, karena oksigen akan

menurunkan laju polimerisasi (Garfin, 2003).

33

Pada prosesnya, untuk mendapatkan hasil pemisahan protein

yang optimal, stacking gel dituangkan tepat diatas separating gel.

Stacking gel memiliki konsentrasi akrilamid yang lebih rendah (ukuran

pori yang lebih besar), pH yang lebih rendah, dan perbedaan kadar ion

yang berbeda dengan separating gel. Hal ini memungkinkan pita protein

menjadi lebih rapat (protein terkonsentrasi) sebelum memasuki proses

pemisahan pada separating gel (Thermo Scientific, 2010). 2-mercaptoethanol akan mengurangi ikatan intra dan

intermolekul disulfida pada protein untuk memungkinkan pemisahan

yang tepat bukan berdasarkan bentuk tetapi ukuran. Sementara detergen

SDS berfungsi untuk mengikat secara berkala semua muatan positif pada

protein, sehingga memberikan setiap protein muatan negatif secara

keseluruhan (protein akan terpisah berdasarkan ukuran bukan muatan).

SDS juga akan mendenaturasi protein dan subunitnya sehingga

pemisahan dilakukan berdasarkan pada ukuran bukan bentuk. SDS

memiliki kemampuan pengikatan protein sebesar 1.3 g/g protein.

Bromophenol blue berperan sebagai indikator warna, dan indikator

migrasi yang dapat diamati melalui pergerakan pewarna yang berjalan

didepan protein. Bromophenol blue juga berfungsi untuk memudahkan

sampel agar terlihat saat proses pemasukan kedalam sumuran gel

bersamaan dengan marker. Sementara gliserol pada laemmli buffer akan

meningkatkan densitas sampel sehingga sampel akan terjatuh didasar

sumuran, yang akan meminimalisir kehilangan sampel protein pada

buffer dan dinding sumuran sampel (Laemmli, 1970).Oleh karena resolusinya yang tinggi, hanya sistem discontinuous

yang digunakan. Poin sederhana yang harus diingat untuk sistem anionik

yang digunakan untuk SDS-PAGE adalah bahwa untuk setiap sistem

yang digunakan, mobilitas ion sangat bergantung pada nilai pH. Semakin

tinggi pH, semakin cepat pergerakan garis batas, dan dengan demikian

akan semakin banyak sistem mampu memisahkan protein dengan massa

molekul rendah dengan mengorbankan ruang pemisahan untuk protein

34

dengan massa molekul tinggi. Sebaliknya, semakin rendah pH, akan

semakin banyak ruang bagi pemisahan protein dengan massa molekul

tinggi, dengan protein bermassa molekul rendah bermigrasi dengan garis

batas ion (Rabiiloud, 2010).SDS-PAGE normalnya digunakan untuk menghitung kemurnian

dan massa molekul protein. Metode serbaguna ini dapat diproduksi

kembali dan low-cost. Secara prinsip Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)

pada sistem akan mengikat kebanyak protein dalam jumlah kurang lebih

sebanding dengan massa molekul protein sehingga masing-masing

protein memiliki rasio muatan dengan berat yang identik, dan bermigrasi

sesuai dengan massa molekulnya. Penggunaan SDS-PAGE secara luas

merupakan protokol Laemmli yang terdiri dari sistem buffer

discontinuous. Pada sistem buffer ini, terdapat dua bagian gel

poliakrilamid, yaitu stacking gel dan separating gel. Terdapat beberapa

perbedaan diantara keduanya, yaitu komposisi, konsentrasi, dan pH

diantara buffer elektroda, yaitu buffer stacking dan separating.

Kegunaan sistem buffer ini adalah efek penumpukan yang terjadi pada

stacking gel. Efek ini akan meningkatkan konsentrasi protein pada

sampel yang akan membantu pemisahan protein pada separating gel.

Protein yang dipisahkan dengan gel poliakrilamid dapat dilihat dengan

berbagai jenis pewarnaan. Pewarnaan menggunakan pewarna, khususnya

Coomassie Brilliant Blue R250 merupakan yang paling umum

digunakan karena mudah, low-cost, serta efektif. Pewarnaan dengan

beberapa pewarna lainnya dan silver staining juga tersedia untuk tujuan

yang lebih spesifik. SDS-PAGE dapat digunakan untuk menghitung

massa molekul protein dengan menggunakan kurva standar diantara

mobilitas relative dan nilai log massa molekul protein standar

(Hames, 1998).b. Ultrafiltrasi

Membran ultrafiltrasi merupakan jenis dari teknologi membran

yang memiliki spesifikasi ukuran membran 0.001-0.1 m. Secara umum,

35

ultrafiltrasi diaplikasikan dalam proses pemisahan unsur-unsur

partikulat, makromolekul (fraksionasi), koloid, dan polimer organik

maupun anorganik dari larutannya dengan memanfaatkan beda tekanan

dalam proses kerjanya. Aplikasi proses ultrafiltrasi di industri

diantaranya adalah untuk proses sterilisasi obat-obatan dan produksi

minuman, klarifikasi ekstrak jus, pemrosesan air ultra murni pada

industri semi konduktor, metal recovery, dan sebagainya. Pada proses

pemurnian harus diperhatikan kondisi operasi yang optimal agar

membran dapat memurnikan suatu cairan secara optimal yang

ditunjukkan oleh parameter berupa fluks, permeabilitas dan faktor

rejeksi dari membran (Laboratorium Operasi Teknik Kimia ITB, 2010).Berdasarkan pada karakter membran yang digunakan, dikenal

berbagai proses filtrasi. Mekanisme pemisahannya adalah mekanisme

pengayakan (sieving mechanism) dimana partikel atau molekul yang

lebih kecil dari ukuran pori media penyaring akan lolos melewati

membran sedangkan yang lebih besar dari ukuran pori akan tertahan di

sisi umpan. Membran ultrafiltrasi biasanya digunakan untuk

memisahkan molekul dengan rentang ukuran 1000-100.000 Dalton (1-

100 mm) seperti protein, lemak, dan koloid. Karakteristik membran

ultrafiltrasi biasanya dinyatakan dengan nilai Molecular Weight Cut Off

(MWCO yaitu bilangan yang menyatakan berat molekul terbesar dari

partikel yang mampu lolos pada membran). Penentuan MWCO ini

dilakukan dengan melewatkan beberapa solut dengan berbagai berat

molekul, misalnya poli etilen glikol, pada suatu membran dan kemudian

diukur berat molekul dari solut yang mempunyai nilai rejection sekitar

90%. Nilai MWCO ini bergantung pada jenis molekul yang digunakan,

distribusi berat molekul, adsorpsi membran dan efek polarisasi

konsentrasi (Wahyuni, 1994).

Seperti dialisis, ultrafiltrasi menggunakan membran semi

permeabel dengan ukuran pori yang cukup besar yang memungkinkan

36

pergerakan molekul kecil dan cukup kecil untuk mencegah lolosnya

protein. Namun tidak seperti dialisis, dimana molekul kecil bergerak

melalui membran dengan difusi yang didorong oleh gradien

konsentrasinya, serta air yang cenderung bergerak ke dalam didorong

oleh tekanan osmotiknya, pada ultrafiltrasi molekul kecil bergerak dalam

larutan air karena kekuatan pendorong eksternal. Beberapa perangkat

ultrafiltrasi menggunakan tekanan tinggi (~500 kPa). Beberapa lainnya

menggunakan sentrifugasi dimana gaya sentrifugal akan memacu

pergerakan air dan padatan kecil melalui membran. Walaupun

ultrafiltrasi sedikit kurang efisien untuk menghilangkan zat terlarut,

ultrafiltrasi merupakan proses yang cepat dan hasilnya dalam bentuk

konsentrasi sampel protein (Brandt, 2014).

Metode pemisahan dengan membran ultrafiltrasi memiliki

kelebihan yaitu pengaruhnya lebih kecil terhadap denaturasi protein

dibandingkan presipitasi dengan polietilen glikol ataupun salting out.

Penggunaan membran ultrafiltrasi akan sangat menghemat, walaupun

tidak semua protein dapat dipisahkan dengan membran ultrafiltrasi yang

memiliki ukuran membran tertentu. Prinsip pemisahan dengan proses

ultrafiltrasi adalah memisahkan komponen berdasarkan berat molekul.

Meskipun retensi molekul merupakan fungsi dan ukuran molekul,

namun terbukti berat molekul dapat digunakan sebagai pengubah yang

lebih praktis, khususnya pada molekul dengan berat molekul tinggi

(Bollag dan Edelstein, 1991).

37

B. Kerangka Berpikir

Gambar 2.3 Kerangka Berpikir Penelitian Lektin Makroalga hijauEnteromorpha clathrata dari Pesisir Pantai Binuangeun, Banten

Indonesiamemiliki

perairan tropiskaya akan

biodiversitasalga

Tidak sepertipolisakarida,Protein darirumput lautbelum dikajisecara luas

Alga hijaumelimpah

namunpemanfaatan

kurangoptimal

Lektin algamemiliki

keunggulantermostabil, stabilrentang pH luas,

berat molekulrendah, mengikat

molekul lebihkompleks darimonosakarida

sepertioligosakarida dan

glikoprotein

Pesisir PantaiBinuangeun,

Bantenmemiliki

keragamanbiodiversitas

alga hijaumelimpah

Belum adapenelitianpurifikasi

lektinEnteromorpha

clathrata diIndonesia

Perlu dikajipurifikasi

parsial dankarakterisasi

awal senyawabioaktif lektin

dari pesisirPantai

Binuangeun,Banten

Lektin adalahprotein pengikatkarbohidrat yang

dapat dimanfaatkansebagai penandakarbohidrat dan

memilikibioaktivitas yang

berpotensi sebagaiobat

Alga hijaukaya akansenyawabioaktif