IDENTIFIKASI STREPTOMYCES SP.9 SECARA MOLEKULAR DENGAN 16S rDNA YANG BERPOTENSI

DALAM MENGHAMBAT RALSTONIA SOLANACEARUM PENYEBAB LAYU BAKTERI PADA

TANAMAN PISANG

Dr Dra Retno Kawuri M,Phil

Dr Drs IBG Darmayasa M.Si

UNIVERSITAS UDAYANA

2016

Latar belakang

Penyakit layu bakteri pada Tanaman Pisang di desa Pendem Jembrana

Streptomyces sp9

Figure 2. Antagonistic Test; Streptomyces sp1-sp9 vs R.solanacearum

Figure 3. The in vivo test negative control ( pathogen infection ) , positive

control ( no pathogen infection ) and treated by administration of

Streptomyces culture sp.9

Penelitian Tahun I

Ditemukan 9 isolat Streptomyces sp; pada tanah rhizosfer tanaman pisang di Desa Pendem, Kecamatan Jembrana dengan karakteristik yang berbeda satu sama lainnya.

Pada uji antagonistik Streptomyces sp dengan R.solanacearum menunjukan Streptomyces sp.9 mempunyai daya hambat terbaik yaitu 19 mm dan termasuk faya hambat kuat

Filtrate metabolit yang dihasilkan mempunyai konsentrasi hambatan terkecil (MIC) sebesar 10%.

Uji skala rumah kaca menunjukan kultur Streptomyces sp.9 yang disemprotkan sebanyak 4 x pada hari yang berbeda mampu menekan penyakit layu bakteri sebesar 100% dari 11% pada kontrol.

Penelitian Tahun ke II

• Tujuan

• 1) Identifikasi Streptomyces sp.9 secara molekular dengan menggunakan 16S rDNA

• 2) Identifikasi senyawa aktif pada filtrate antibiotika dari Streptomyces sp.9 dengan menggunakan GCMS

Metoda

• Metode yang digunaka yaitu untuk Identifikasi Streptomyces sp.9 menggunakan 16S rDNA dengan primer 20f(5’- G AGTTTGATCCT-GGTTCAG) dan 1500r (5’- GTTACCTTGTTACGACTT).

• Isolasi DNA genom

• Peremajaan isolat bakteri menggunakan media Yeast Salt Agar (ISP6) dan biakan diinkubasi pada suhu ruangan selama empat hari dan lima bulatan koloni (diameter 5 mm) dimasukkan kedalam media Yeast Salt Broth (ISP7) dan diinkubasi pada inkubator shaker dengan temperatur 25ºC selama 4 hari.

Isolasi DNA genom

• Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke ependorf 1,5 ml lalu disentrifugasi pada kecepatan 800 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0.3 M sukrosa; 25 mM Tris-HCL; 25 mM EDTA.2Na pH 8), kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Pelet dicuci sebanyak 3 kali secara berulang. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet ditambahkan 200 µl bufer STE dan 45 µl lisozim (20 mg/ml) dibolak-balik secara pelan lalu diinkubasi pada suhu 55 ºC selama 1 jam sehingga terbentuk protoplas.

Amplifikasi DNA dengan PCR

• Gen 16S rRNA diamplifikasi dengan mesin Polymerase Chain Reaction (Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400, Germany) menggunakan primer spesifik prokariot Actinomycetes, yaitu 20f (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG) dan 1500r (5’-GTTACCTTGTTACGACTT).

Sikuen dan alignment DNA

• Deoxyribosa Nucleic Acid (DNA) hasil amplifikasi disekuen secara parsial untuk mengetahui urutan basa nukleotida-nya menggunakan jasa PT Macrogen, Korea. Urutan basa nukleotida hasil sekuen kemudian disejajarkan dengan data GeneBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida) dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Amplifikasi Genom sampel cendawan menggunakan metode PCR dengan primer 63f dan 1387r menghasilkan fragmen DNA yang

berukuran sekitar 1300 pb

Hasil pensejajaran sekuen gen 16 SRNA isolat Sp9 terhadap data yang tersedia di NCBI (BLASTX)

Description Max

score

Total

score

Quary

cover

E value Identit

y

Acces

number

Streptomyces sp. INBio_4507J

16S ribosomal RNA gene, partial

sequence

2475 2475 100% 0.0 99% KM242426.1

Streptomyces capoamus strain

BCCO 10_1636 16S ribosomal

RNA gene, partial sequence

2449 2449 99% 0.0 99% KP718517.1

Streptomyces murinus strain

MDMT-5 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence

2440 2440 100% 0.0 98% KF973308.1

Streptomyces rhizophilus strain

JR-41 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

2429 2429 100% 0.0 98% NR_125578.

1

Streptomyces graminisoli strain

JR-12 16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

2412 2412 100% 0.0 98% HQ267994.2

Pohon Filogeni

Hasi lIdentifikasi Streptomyces sp.9 dengan 16SrDNA

teridentifikasi sebagai Streptomyces capoamus strain BCCO 10_1636 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

KESIMPULAN

• Streptomyces sp.9 teridentifikasi sebagai Streptomyces capoamus strain BCCO 10_1636 16S ribosomal RNA gene, partial sequence