Kuliah Pakar Kbk 2010.Ppt2

download Kuliah Pakar Kbk 2010.Ppt2

of 32

description

Kuliah pakar blok biomolekuler pada semester IIIPada blok ini banyak mempelajari tentang biologi molekuler dan DNA

Transcript of Kuliah Pakar Kbk 2010.Ppt2

  • TEKNIK BIOLOGI MOLEKULERAPLIKASINYA DI KLINIK

    Paramasari Dirgahayu

    Kuliah MKK Peminatan BIOMEDIKMK Biomedik Biomolekuler14 Agustus 2010

  • ISOLASI DNA.

    B. Tujuan Pembelajaran Setelah melakukan praktikum isolasi DNA, mahasiswa diharapkan mampu1. Menjelaskan struktur dan fungsi materi genetik2. Mengenali dasar-dasar teknik rekayasa genetika

  • Separation of nucleic acids from other cell components

    Chloroform Iso Amyl Alcohol (CIAA) Phenol CIAA PhenolTwo phases: phenol phase + aqueous phase

    ProteinsDNAaqueous phase

    phenol phaseCAUTION Taking to much aqueous phase will result in impure DNA !!

    debrisISOLASI DNA/RNA/PROTEIN SECARA KLASIK

  • isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dengan Metode CollumIsolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi

    Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses :

    Penghancuran dinding selPenghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampelPengendapan DNA/RNAPurifikasi

  • PRINSIPBerikatan dengan glass fleece Garam kaotropik Wash and spin Pelarutan DNA Analisa selanjutnya/ SimpanIsolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dengan Metode Collum

  • Measurement of genomic DNA quality and quantityAbsorption measurement by spectrophotmeterMeasurement of optical density (OD) at a wavelength of 260 nm

  • Polymerase Chain Reaction2007

  • Apakah Metoda PCR ?Metoda PCR adalah suatu teknologi yang dibuat dengan tujuan dapat membuat tiruan berlipat ganda secara in-vitro enzymatic amplification dari suatu segmen DNA spesifik.

    Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

    Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi

  • Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik

    Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.

  • Tahapan Proses PCRPre PCR : Preparasi reagensiaPreparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNAPCR : proses amplifikasiDenaturasi (pemisahan rantai DNA)Annealing (penempelan primer)Extension (pemanjangan oleh enzim)Post PCR :Deteksi/ Analisa Hasil PCR

  • Sekuen Target Target SequenceDNA StrandDouble HelixDNA StrandSupercoiledDNA StrandChromosomeDNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme

  • Sekuen NukleotidaHydrogen BondsCytosine (C)Adenine (A)Thymine (T)Guanine (G)Deoxyribose(Sugar molecule)Phosphoric Acid(Phosphate molecule)Cytosine (C)Adenine (A)Thymine (T)Guanine (G)

  • PROSES PCRMaster Mix + target DNA/ RNAMg2+Mn2+Taq DNA PolymeraserTth DNA PolymeraseAmpEraseBiotinylatedPrimerTarget RNAor DNAdCTPdTTPdGTPdUTPdATPandORand

  • Polymerase Chain Reaction Mg2+AmpEraseTaq DNAPolymeraseBiotinylatedPrimersTarget DNAPCRdCTPdTTPdGTPdUTPdATPBiotinylatedAmpliconBiotinylatedAmplicon

  • PROSES PCR : Amplifikasi 1 Denaturasi oleh panasTarget SequenceTarget Sequence

  • 2 Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung Sekuen TargetTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 2BiotinBiotin53553533

  • 3 - Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai Komplemen NukleotidaTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase

  • Akhir Siklus PCR ke-1Hasil 2 tiruan dari Sekuen TargetTarget SequenceTarget SequenceBiotinBiotin

  • PCRPolymeraseChain Reaction)

  • Cara kerjaTAMBAHKAN 40 L MINERAL OIL UNTUK MENUTUPI PERMUKAAN CAIRAN MENCEGAH PENGUAPAN SAAT PCR

    SETTING: DENATURASI 94-95 C ANNEALING: 50-65 C DAN EXTENSI 72 C

    PCR REACTION MIXTUREAddAdd2xPCR Mix Template DNAPrimerDDW 10 l1 l1 l8 l25 l2 l2 l21 lTotal Reaksi 20 l 50 l

  • Deteksi/ Analisa Hasil PCRElektroforesis gel agarosa (horizontal)Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)Enzym labelling oligonucleotideBiotin-labelled oligonucleotideDigoxigenin-labelled oligonucleotideSelanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

  • Definisi

    Agarose gel elektophoresis adalah suatu metode untuk memisahkan molekul DNA atau RNA berdasarkan besar molekulnya (BM) Pemisahan molekul tersebut dapat terjadi melalui pergerakan asam nukleat yang negatively charged menembus matriks agarose dalam tank electrophoresis.

    Molekul dengan berat molekul (BM) rendah akan bergerak lebih cepat daripada molekul yang BM nya besar. AGAROSE GEL ELEKTROPHORESIS

  • Aplikasi penggunaan teknik elektrophoresis:

    1. Untuk memperkirakan ukuran molekul DNA setelah dilakukan restriksi dengan enzim digesti tertentu (misal restriction mapping dari clone DNA)

    2. Analisis produk PCR, misal untuk kepentingan Analysis of PCR molecular genetic diagnosis atau genetic fingerprinting

  • KEUNTUNGAN DAN KERUGIANKeuntungan:sampel dapat dipisahkan dan divisualisasi, akan tetapi karena agarose gel tidak bersifat mendenaturasi protein, maka sampel yang sudah di running tersebut dapat di purifikasi kembali untuk kepentingan pembuatan plasmid

    Gel sangat mudah dibuat dan secara praktis hanya dituangkan ke dalam tank

    Kerugian: Gel tersebut dapat meleleh pada saat elektrophoresis

  • PRINSIP

    The DNA fragments will separate according to size. To see the DNA bands one must stain the gel with ethidium bromide, a fluorescent dye that intercalates DNA, and excite and view the fluorescence by U.V. transillumination.

    The gel may also be photographed. Unknown bands may be sized by comparison to molecular weight standards.

    The standards should be used to generate a standard curve for interpolation.

  • PRINSIP PROTOKOL KERJA

  • PROTOKOL KERJAD1. Persiapan Agar- TBE buffer + Agarose + SybrSafe/EtBromide

  • loading sampelGlycerol & bromophenol blue (6x) 3ml glycerol (30%) 25mg bromophenol blue (0.25%) dH2O to 10mL

  • Schematic drawing of the electrophoresis process, see text for description of steps

  • Deteksi Produk PCR: Elektroforesis Gel agarosa

  • PRAKTIKUM BIOMOL MAHASISWA KBK PBL

  • Beberapa alternative alamat untuk mencari jurnalEbsco: Google ketik ebsco ketik ebscohost (baris pertama. Username: ns003857. Pasword: Password. Lalu untuk artikel pilih EBSCOhost Research Database. Klik Medline with fulltext. Pilih Basic Search dan ketik artikel yang dicariAlternative: Ketik Highwire, bmjjournals, freemedicaljournals, nejm pada googlePROQUEST:http://www.fk.uns.ac.id lalu ketik proquest atau langsung ketik www.proquest.com/pqdweb. User: 00C7TQWTJJ; Password: pw pquns

    *All High Pure kits have the same principle in common. You know one, you know all of them. Based on the properties of nucleic acids to adsorb to silica or glass surfaces in the presence of high concentrations of a chaotropic salt (e.g. guanidine salts, Na-perchlorate, Na-iodide,..). Hydrate shell of NA is disturbed, thus entropy driven reaction to interact with SiO2 moieties of glass. Alcohol in wash buffer keeps NA adsorbed. With aqueous elution buffer the interaction is reversed. NA can directly be used for enzymatic reactions.All High Pure kits have the same principle in common. You know one, you know all of them. Based on the properties of nucleic acids to adsorb to silica or glass surfaces in the presence of high concentrations of a chaotropic salt (e.g. guanidine salts, Na-perchlorate, Na-iodide,..). Hydrate shell of NA is disturbed, thus entropy driven reaction to interact with SiO2 moieties of glass. Alcohol in wash buffer keeps NA adsorbed. With aqueous elution buffer the interaction is reversed. NA can directly be used for enzymatic reactions.