I. NOMOR PERCOBAAN : VI

II. TANGGAL PRAKTIKUM : 06 oktober 2014.

III. JUDUL PRAKTIKUM : Kromatografi Lapis Tipis

IV. TUJUAN PRAKTIKUM : Untuk Mengetahui Cara Pemisahan AsamAmino

Dengan KLT Dan Mengetahui HargaRf Asam

Amino

V. ALAT DAN BAHAN

Alat : Bahan :

Plat Kromatografi - Silika Gel

Selembar Kaca - Pelarut Etanol

Penggiling - Larutan Ninhidrin

Beker Gelas - Larutan Kuprinitrat

Pengaduk Magnetik - Larutan glutamat

Gelas Ukur - Larutan Alanin

Pipet Tetes - Larutan Glysin

Penyemprot - Larutan Arginin

Penggaris - Aquades

Pensil dan Oven

VI. DASAR TEORI

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, Dengan cara

ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam

amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara

asam-asam amino tersebut.

Banyak metode yang dapat dilakukan dalam pemisahan dan identifikasi asam

amino, seperti metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan

elektroforesis. Salah satu meteode yang paling banyak digunakan dalam pemisahan asam-

asam amino adalah metode romatografi.

Asam amino mempunyai sifat yaitu dapat dipisahkan. Pada umumnya, asam amino

diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan

cara ini diperoleh dengan campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan

jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan

antara asam-asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya

metode gravimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode yang

banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam

kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar

ion. Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik

menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam

asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing

asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen

menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan

salah satu jenis kromatografi analitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal,

karena banyak keuntungan menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah.

KLT termasuk dalam kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas.

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode

untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki

sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau

kromatografi cair kinerja tinggi.

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya

hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan

kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi

kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara

kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang

disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti

silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif

seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk

identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf

dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh

senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh

karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.

Pelaksanaan KLT

1.      Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan

diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan

semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal

efisiensi dan resolusinya.

Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara

mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi (Gandjar & Rohman,

2007).

2.      Fase Gerak

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-

coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah

campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah

diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah

beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :

1.  Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan

teknik yang sensitif.

2.  Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara

0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

3.  Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas

fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan

nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam

pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan

(Gandjar & Rohman, 2007).

3.      Penotolan Sampel

Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit

0,5 μl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus

dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.

4.      Pengembangan

Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel

dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi

bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak

kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah

berisi totolan sampel.

Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak

sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng

yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi

dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat

dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).

5.      Deteksi Bercak

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang

biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara

penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk

menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar

ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi,

membuat bercak akan terlihat jelas.

Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV

254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm

akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm

akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya. Metode deteksi lain adalah

dengan menggunakan pereaksi semprot.

VII. PROSEDUR PERCOBAAN

Pembuatan lapis tipis

Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25

gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai

homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat

buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini

ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan

kering diudara selama semalam.

Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa

Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 – 2,0 ug dalam 0,5 ul,

diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat

yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm

antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan

hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang

akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan

ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-

lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen

dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.

Ruang Kromatografi

Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan

eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam

sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi

dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi

mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.

Cara melakukan elusi

Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke

dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki.

Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10

cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat

diambil dan dikeringkan pada suhu kamar.

Cara perwarnaan

a) Dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang

ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj

yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30

menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat

akan berwarna sedikit rose.

b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat

kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial).

Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya

stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan

uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9.

walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

VIII.  HASIL PENGAMATAN

No Asam aminoJarak eluen

(cm)Jarak noda (cm) Rf (cm)

Rf (cm) teori

1 Glutamat 10 3.3 0.33 0.36

2 Arginin 10 2.2 0.22 0.20

3 Glysin 10 2.6 0.26 0.26

4 Alanin 10 2.5 0.25 0.28

IX. REAKSI

X. PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini berjudul Kromatografi Lapis Tipis pada asam amino yang

bertujuan untuk mengetahui cara pemisahan asam amino dengan cara kromatografi lapis

tipis dan menghitung harga Rf dari asam-asam amino yang diselidiki. Reaksi antara

ninhidrin dengan asam amino membentuk produk berwarna ungu. Pada percobaan kali ini

media pemisahan yang digunakan adalah silica gel G pada lempeng kaca. Sebagai pengikat

silica gel digunakan plester, yang juga disebut sebagai fase diam hidrofilik. Kemudian plat

silica gel dibiarkan kering dengan bantuan cahaya matahari dan udara.

pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 10 gr silika gel dengan 25 ml air

yang dituangkan kedalam plat kaca. Kemudian silikanya diratakan pada permukaan plat

kaca yang telah diukur pinggir kanan-kirinya 1 cm dan diselotip. Pada saat meratakan

hanya dapat diratakan dengan satu perataan tidak boleh berulang-ulang agar didapatkan

permukaan yang tidak bergelombang.

asam amino yang diperiksa diantaranya Alanin, Glutamat, Glysin,dan Arginin.

Diteteskan pada plat kaca 1.5 cm dari tepi bawah plat yang diteteskan berjajar dengan jarak

2 cm. Lalu asam amino dimasukkan ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan

eluen. Eluen yang digunakan adalah 100:39 etanol dan air.etanol bergerak naik hingga jarak

10cm kemudian di keringkan di udara.

Setelah kering, Untuk melihat bercak zat asam amino digunakan larutan

penyemprot ninhidrin. Setelah disemprot, pada silica gel muncul bercak – bercak atau noda.

Noda yang dihasilkan oleh setiap larutan asam amino (Alanin, glutamate,arginin,glysin.)

berwarna merah keunguan. Uji ninhidrin positif untuk semua asam amino yang memiliki

gugus amino bebas. Bercak-bercak warna yang terbentuk diukur.Berdasarkan hasil

percobaan yang dilakukan, diperoleh nilai Rf untuk asam amino glutamat adalah 0.33 asam

amino Arginin adalah 0.22 asam amino Glysin adalah 0.26 dan asam amino Alanin adalah

0,25. Hasil nilai Rf dari larutan sampel ini tidak ada yang sesuai dengan asam amino

tersebut namun, nilainya yang sama adalah dengan nilai asam amino Glysin.

Adanya kesalahan dari hasil percobaan yang dilakukan, yaitu perbedaan nilai Rf

asam amino yang diperoleh dengan nilai Rf asam amino berdasarkan teori, hal ini mungkin

disebabkan karena saat melakukan penyemprotan yang mendorong asam amino sehingga

panjang warna yang terbentuk tidak sesuai dengan teori.

XI.  KESIMPULAN

a) Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yag digunakan harus benar-benar

terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi.

b) Pada kromatografi fase geraknya adalah etanol dan fasa diamnya adalah silica

gel.

c) Digunakan larutan cuprinitrat pada saat pewarnaan adalah untuk menstabilkan

noda – noda yang timbul karena terjadi ikatan kompleks ninhidrin yang

berwarna.

d) Nilai Rf asam amino glutamate adalah 0.33, arginin adalah 0.22,glysin 0.26 dan

alanin 0.28.

e) Setiap asam amino memiliki koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut

tertentu. Asam amino yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang

lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut

yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada

fasa diam.

f) Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya

senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis

XII. DAFTAR PUSTAKA

Adorana,erlinda.2013. Kromatografi Lapis Tipis.

http://erlindaadonara.blogspot.com/2013 /09/kromatografi-lapis-

tipis.html.diakses pada 9 oktober 2014.

Anonim.2013. Kromatografi lapis tipis. http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-

lapis-tipis-klt.html . diakses pada 9 oktober 2014.