Laporan praktikum biokimia tm 8

8
Laporan Praktikum Hari,Tanggal : Senin, 18 November 2013 Biokimia Waktu : 11.00 12.40 WIB PJP : Inda setyawati, S.Tp M.Si Asisten : Lusianawati, S.Si Sari Yunarini, S.Si ISOLASI DNA KROMOSOM BAWANG MERAH (Allium Cepa Var. Aggregatum) Kelompok 10 Raden Dani Najar Saputra J3L112187 Andini Eka Pratiwi J3L112115 Dewi Rosmayanti J3L411211 Wika Herfiza J3L112057 PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

description

ISOLASI DNA KROMOSOM BAWANG MERAH (Allium Cepa Var. Aggregatum)

Transcript of Laporan praktikum biokimia tm 8

Page 1: Laporan praktikum biokimia tm 8

Laporan Praktikum Hari,Tanggal : Senin, 18 November 2013

Biokimia Waktu : 11.00 – 12.40 WIB PJP : Inda setyawati, S.Tp M.Si

Asisten : Lusianawati, S.Si

Sari Yunarini, S.Si

ISOLASI DNA KROMOSOM BAWANG MERAH (Allium Cepa Var. Aggregatum)

Kelompok 10

Raden Dani Najar Saputra J3L112187

Andini Eka Pratiwi J3L112115 Dewi Rosmayanti J3L411211

Wika Herfiza J3L112057

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Page 2: Laporan praktikum biokimia tm 8

Pendahuluan

Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit

mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat

itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleo tida

disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia

dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang

sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan

posisi 5′ pada mononukleotida lainnya (Murray et al 2009).

Gambar 1 Jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan

posisi 5′ pada mononukleotida lainnya

Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan

asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini

merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikas i

dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu

dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul

RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan

mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai

dengan kode DNA-nya (Fessenden dan Fessenden 1990).

DNA dan RNA banyak memiliki persamaan, tetapi RNA memilik i

perbedaan dengan DNA yaitu, Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan

bagian pentosa DNA adalah dioksiribosa. Bentuk molekul DNA adalah heliks

ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal yang terlipat, sehingga

menyerupai rantai ganda. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti

DNA tetapi tidak mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.

Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula

jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil (Poedjiadi 1994). Selain itu

Page 3: Laporan praktikum biokimia tm 8

perbedaan RNA dengan DNA yang lain adalah dalam hal ukuran dan bentuk,

susunan kimia, lokasi, dan fungsinya (Suryo 1992).

Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara

horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder

yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak

menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang

berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut

adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju

dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan (Day dan Underwood

2002). Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila

cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya

tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It)

(Khopkar 2003).

Tujuan

Menunjukkan sifat dan struktur DNA kromosom melalui proses isolasi

terhadap DNA kromosom

Metode

Alat-alat yang digunakan ialah neraca analitik, gelas beaker, sentrifus, pipet

tetes, tabung reaksi, tabung Eppendorf, dan vortex. Bahan-bahan yang digunakan

ialah umbi bawang merah, larutan lisis yang berisi Tris-HCl 50 mM pH 8.0 yang

mengandung 50 mM EDTA, SDS 10%, buffer elusi/buffer TE yang berisi Tris-HCl

10 mM pH 8.0 yang mengandung 0,1 mM EDTA pH 8,0, EtOH, NaCl, dan dH2O

steril.

Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8,0 yang

mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10

mM Tris-HCl pH 8,0 yang mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan

disimpan di pendingin.

Isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan

menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan seujung sudip garam

dapur digerus sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan

ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan

diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu

Page 4: Laporan praktikum biokimia tm 8

disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es sehingga larutan tersebut

segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian ditambahkan 1

gram NaCl, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian larutan

dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan

dipindahkan ke dalam 2 tabung baru. EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan

melalui sisi tabung. Kemudian, tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan

dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan mengendap pada bagian atas

dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. DNA kromosom diambil

dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH yang

terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung

disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-hati

tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom.

Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan

disentrifugasi kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom

dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah kering, buffer TE atau dH2O steril

1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.

Data Hasil Pengamatan

Tabel 1 Hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang merah

Larutan A 260 A 280 A Terkoreksi [DNA]

(µg/mg)

Rasio

A260/A280 A 260 A 280

Blanko (TE) 0,2730 0,2010 0,6478 0,5678 32, 3900 1,1409

Sampel 0,9208 0,7688

Perhitungan :

Aterkoreksi = Asampel - Ablanko

1. Aterkoreksi 260 = 0,9208 – 0,2730 = 0,6478

2. Aterkoreksi 280 = 0,7688 – 0,2010 = 0,5678

[DNA] = A260 x 50 µg/ml

= 0,6478x 50 µg/ml

= 32, 3900 µg/ml

Rasio A260 : A280 = A260 Terkoreksi : A280 Terkoreksi

= 0,6478 : 0,5678 = 1,1409

Keterangan :

50 : Larutan nilai basorbansi 1.0 sebanding dengan 50 µg/ml untai ganda

DNA per ml

Page 5: Laporan praktikum biokimia tm 8

Pembahasan

Prinsip isolasi DNA yaitu, sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama

sentrifugasi ialah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan

cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada

di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik

sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin

sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 3000 rpm (rotation per

minute). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan yaitu, Isolasi sel; Lisis dinding

dan membran sel; Ekstraksi dalam larutan; Purifikasi; dan Presipitasi.

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan untuk

rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi

total DNA/RNA dari jaringan ialah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan

tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,

dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi, sehingga dihasilkan pelet sel yang

mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama

dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan (Faatih 2009).

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai

macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan.

Praktikum Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah.

Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom

disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan

lebih jelas dan mudah diisolasi. Proses pekerjaan isolasi DNA harus dilakukan

pada suhu rendah, karena kromosom DNA tidak tahan panas dan dapat mengalami

denaturasi akibat suhu yang terlalu tinggi (Schmid 2003).

Biomolekul seperti DNA bersifat labil dan mudah kehilangan aktifitas

biologisnya, sehingga ekstraksi harus dilakukan dalam kondisi ringan yaitu dengan

menggunakan suatu larutan encer, tekanan osmotik yang ekstrim dan suhu tinggi.

Penambahan garam saat pengerusan bertujuan membantu ujung-ujung fosfat DNA.

Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu membentuk

ikatan dengan kutub negatif pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na+ garam berikatan

dengan fosfat (mendekat), saat itulah DNA akan berkumpul. Sedangkan

penambahan alkohol pada permukaan larutan betujuan untuk melakukan presipitasi

Page 6: Laporan praktikum biokimia tm 8

sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan

terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.

Detergen seperti sodium dodecyl sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat

digunakan untuk proses lisis (Subandiyah 2006). Buffer lysis dan Proteinase-K

disini dipakai sebagai reagen pelisis supaya komponen DNA dalam sitoplasma sel

bisa keluar dan diisolasi, sedangkan etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi

(Faatih 2009). Kristal protease juga dapat diganti dengan NaCl sebagai langkah

pemurnian DNA dari kontaminan protein dengan cara pengendapan molekul DNA

tersebut sehingga tidak tercampur dengan kontaminan (Ardiana 2009).

Larutan pelisis sel lysing solution yang mengandung EDTA

(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate)

dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Dinding sel

dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan

penghangatan pada suhu 60°C. Proses lisis dinding sel dilakukan dengan

menginkubasi tabung berisi contoh ke dalam waterbath suhu 60°C selama 30-90

menit atau sampai fase padat terpisah dari fase cair. Inkubasi dilakukan untuk

mempercepat proses isolasi DNA kromosom dari campuran. Suhu inkubasi tidak

boleh terlalu tinggi karena DNA kromosom dapat mengalami kerusakan (Poedjiadi

2009). Larutan buffer TE terdiri dari 1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base,

0,50 M EDTA pH 8,0, 18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat 2H2O berfungs i

menjaga struktur DNA. DNA kromosom lalu di sentrifugasi untuk memisahkan

DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun RNA. Sehingga DNA

kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar

setelah disentrifugasi. (Seidman & Moore 1999 dalam Agustian 2008).

Pengukuran absorbansi DNA digunakan panjang gelombang 260 nm

sedangkan absorbansi RNA digunakan panjang gelombang 280 nm, hal tersebut

dilakukan karena pada panjang gelombang tersebut terjadi serapan yang maksimal

(Day dan Underwood 2002). Berdasarkan perhitungan pada Tabel 1, A260 ialah

absorbansi DNA, sedangkan A280 ialah absorbansi protein. Perhitungan [DNA]

yaitu digunakan A260 terkoreksi, karena perhitungan konsentrasi DNA hanya

memerlukan absorbansi DNA, bukan absorbansi protein/kontaminan lain. Rasio

A260 : A280 merupakan gambaran tingkat kemurnian DNA. DNA memiliki nilai

Page 7: Laporan praktikum biokimia tm 8

tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika

melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari

protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat

belum murni. Jika kurang dari 1.8 maka dH2O yang diambil terlalu banyak

sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Wulandhari 2009). Hasil percobaan

menunjukkan rasio kemurnian DNA sebesar 1,1409 (A260:A280). Ini artinya DNA

yang diperoleh tidak murni. Kemurnian yang rendah ini diduga disebabkan protein

yang tercampur pada DNA yang dihasilkan. Sambrook et al. (1989) menjelaskan

bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1,8-2,0 jika ditemukan

kontaminasi dari protein atau fenol.

Simpulan

Berdasarkan percobaan, hasil isolasi DNA umbi bawang merah (Allium

Cepa Var. Aggregatum) memiliki rasio A260:A280 sebesar 1,1409 dengan

konsentrasi DNA sebesar 32, 3900 µg/mL dan hasil isolasi tidak murni.

Daftar Pustaka Agustian A. 2008. Karakterisasi Variasi Genetik Jatropha curcas L. dengan Menggunakan Marka Molekular Amplified Fragment Length

Polymorphism (AFLP) [skripsi]. Depok : Universitas Indonesia

Ardiana DW. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian.

14 (1): 12-16

Day JY dan Underwood AL. 2002 Analisis Kimia Kuantitatif. Iis Sopyan,

Penerjemah. Jakarta: Airlangga. Terjemahan dari: Quantitative Chemical Analysis.

Faatih M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &

Teknologi. Surakarta: Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universita s Muhammadiyah Surakarta.

Fessenden RJ. dan Fessenden JS. 1990. Kimia Organik Jilid 2. Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry 2.

Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik . A. Saptorahardjo, Penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry

Murray RK, Granner DK, dan Rodwell VW. 2009. Biokimia Harper Ed. ke-27. Brahm U. Pendit, Penerjemah. Jakarta: Buku Kedokteran, EGC. Terjemahan dari : Harper’s Illustrated Biochemistry 27th ed.

Poedjiadi A. 1994. Dasar – Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.

_________ . 2009. Dasar-Dasar Biokomia. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Page 8: Laporan praktikum biokimia tm 8

Sambrook J, Fritsch EF, And Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Vol. 3.Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press

Schmid R. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering.

German: Wiley-VCH.

Subandiyah S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Malang: Pelatihan

dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.

Suryo W. 1992. Genetika. Yogyakarta: UGM-Press.

Wulandhari A. 2009. Optimalisasi Hasil Ekstraksi DNA dari Darah Segar Sapi Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan Darah dan Lisis Buffer pada Kecepatan Sentrifugasi Berbeda [skripsi]. Bogor: Institut

Pertanian Bogor