Laporan Tetap Mumtika Empat

8/18/2019 Laporan Tetap Mumtika Empat

1/15

LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM BIOKIMIA I

JUDUL PRAKTIKUM : KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

KELOMPOK : IV (EMPAT)

NAMA : MUMTIKANAH

NIM : 06101381320029

DOSEN PEMBIMBING : D!" MADE SUKAR#A$AN% M"S&"

DESI% S"P'% M"T

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA

FAKULTAS ILMU KEGURUAN DAN KEPENDIDIKAN

UNIVERSITAS SRI$IJA#A

201


2/15

LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM BIOKIMIA I

I" P*+,--. K : IV (E/-)

II" T-.- P*+,--. : 0 N+4/, 201

III" J5'5 P*+,--. : K+/-+-& L-&! T&&!

IV" T575-. P*+,--. :

• Mengetahui cara pemisahan asam amino

dengan Kromatografi Lapis Tipis

• Mengetahui harga Rf asam amino

V" D-!- T+&

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi,

komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase

gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan

melarutkan at komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam

akan tertinggal. !edangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan

bergerak lebih cepat. "#mam $a%i%i, !ohibul,&''(). Kromatografi merupakan salah satu

cara pemisahan kimia yang paling populer dan paling banyak digunakan. Kromatografi

pertama kali dilakukan oleh Michael Ts*ett, seorang ahli botani Rusia yang beker+a di

arsa*a pada tahun '/. Pemisahan yang diu+icobakan adalah pemisahan klorofil dan

pigmen lainnya dalam suatu sari tanaman dengan menggunakan kolom gelas yang

diberi keran pada u+ungnya. Larutan petroleum eter yang mengandung cuplikan

diletakkan pada u+ung atas kolom gelas sempit yang telah diisi dengan bubuk kalsium

karbonat. Ketika ke dalam kolom tersebut dituangi petroleum eter maka akan terlihat

bah*a pigmen-pigmen terpisah dalam beberapa daerah atau pita. !etiap pita ber*arna

diisolasi dan diidentifikasi senya*a penyusunnya. 0danya pita ber*arna tersebut

melatarbelakangi nama 1kromatografi2 yang berasal dari bahasa 3unani. 1 Kromatos2

berarti *arna dan 1 graphos2 yang berarti menulis.

Kromatografi mencakup berbagai proses berdasarkan perbedaan distribusi dari

penyusun cuplikan antara dua fasa. !atu fasa tetap tinggal pada sistem dan disebut fasadiam. Fasa yang alin dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa


3/15

diam. 4erakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.

!etetes cairan +ika diteteskan pada sepotong kertas atau kain akan melebar dalam bentuk

bulat, dan +ika larutan itu mengandung senya*a ber*arna maka akan terlihat suatu

lingkaran ber*arna. Tehnik analisis sederhana ini digunakan bangsa Roma untuk

mengu+i at *arna. !ekitar satu abad lalu, ahli kimia 5erman, Runge, !choebien dan

4oppelsroedn membuat kema+uan tehnik ini sehingga lebih reprodusibel dan dapat

digunakan secara kuantitatif.

Tehnik Kromatografi Lapis Tipis "KLT) dikembangkan oleh 6gon !tahl dengan

menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT

merupaka kromatografi serapan, tetapi dapat +uga merupaka kromatografi partisi karena

bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. !istem ini sangat populer karena

memberikan banyak keuntungan, yaitu peralatan yang diperlukan sederhana, murah,

*aktu analisis yang singkat serta daya pisah cukup baik. !elain itu sampel yang

dibutuhkan sangat sedikit.

!ebagian besar dasar teori kromatografi kolom dapat diterapkan pada KLT.

Pemisahan dilakukan oleh keseimbangan cuplikan dalam dua fasa yaitu fasa gerak dan

fasa diam. 7era+at retensi pada kromatografi ini dinyatakan sebagai faktor retensi "R f ) 8

+arak tempuh at terlarutRf 9 +arak tempuh pelarut

5arak tempuh pelarut dapat diukur dengan mudah yaitu mulai dari tempat totolan sampel

sampai garis tempat berhentinya pelarut. 5arak tempuh cuplikan adalah +arak dari

totolan sampel sampai ke bercak atau noda pada lempeng.

Fasa diam yang biasa digunakan dalam KLT adalah serbuk silika gel, alumina,

tanah diatomae, selulosa dan lain-lain yang memiliki ukuran butir sangat kecil yaitu

','/:-',&; mm. Fasa diam tersebut dilapiskan pada kaca, aluminium maupun plastik dengan ketebalan tertentu. Plat KLT dapat dibuat sendiri atau dibeli langsung dalam

bentuk +adi "pra paking) dari beberapa perusahaan. Lapisan tipis ini secara umum ada

yang perlu diaktifkan sebelum digunakan, misalnya silika gel dan alumina, ada +uga

yang tidak perlu diaktifkan misalnya selulosa.

Larutan cuplikan "sekitar < dalam suatu pelarut) diteteskan dengan pipet mikro

atau in+ektor pada +arak -& cm dari batas plat. !etelah pelarut dari noda menguap, plat

siap untuk dikembangkan dengan fasa gerak yang sesuai hingga +arak eluen=fasa gerak

dari batas plat mencapai >-' cm. Proses pengembangan diker+akan dalam *adah

tertutup "chamber) yang diisi eluen yang sesuai dengan sampel. ?hamber tersebut


4/15

di+enuhi dengan uap eluen agar dihasilkan pemisahan yang baik dan dapat ulang

"reprodusibel). Tehnik pengembangan dapat dari ba*ah ke atas "asending), dari ba*ah

ke atas "desending) atau mendatar. Langkah berikutnya adalah mengeringkan sisa eluen

dalam lapisan tipis dengan didiamkan pada suhu kamar beberapa saat. @oda pada

lapisan tipis dapat diamati langsung untuk noda tampak. 5ika noda tidak tampak dapat

dilihat dengan lampu AB pada pan+ang gelombang pendek "&;C nm) atau pada pan+ang

gelombang pan+ang ":// nm). 7apat +uga dilihat dengan menggunakan pereaksi

semprot penimbul *arna.

-- //&& 5..

Pemilihan eluen yang tepat merupakan langkah yang sangat penting untuk

keberhasilan analisis dengan KLT. Prinsipnya sampel harus lebih terikat dalam fasa

diam daripada dalam fasa gerak. Pertimbangannya dapat menggunakan prinsip 1 similia

similibus solventur 2 atau biasa dikenal dengan prinsip 1like dissolve like”. Amumnya

eluen untuk kromatografi ditemukan dengan cara Dtrial and error” atau coba-coba.

5arang sekali penentuan eluen berdasarkan pada pengetahuan yang mendalam tentang

mekanisme proses kromatografi. Pedoman umum yang sederhana dan mudah dilakukan

dalam memilih eluen adalah berdasarkan pada polaritas, kemampuan membentuk ikatan

hidrogen dan reaktiEitas suatu eluen.

Kromatografi +enis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau

silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca.

!eperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino

diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada

kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti 8 metanol, asam asetat,

etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform. Kromatografi lapis tipis "KLT) seperti halnya

kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya, kromatografi inimemiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas, prosesnya mungkin

memerlukan *aktu kira-kira setengah +am. Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan

digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium.

Teknik KLT ini dikembangkan pada tahun (: oleh #smailoff dan !chraibar.

0dsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penun+ang fasa diam.

Fase bergerak akan merayap sepan+ang fase diam dan terbentuklah kromatogram. #ni

dikenal +uga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam

pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh

kembali senya*a-senya*a yang terpisahkan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi


5/15

larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Antuk

meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syiringe "penyuntik

berukuran mikro). !ampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi

"sebanyak ',' ' µ g at). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-

kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan Eertikal searah gerakan

pelarut. Teknik ascending digunakan untuk melaksanakan pemisahan pada suhu kamar,

sampai permukaan pelarut mencapai ;-( cm. aktu yang diperlukan antara &'-C'

menit. !emua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat +uga digunakan

dalam kromatografi lapis tipis.

Gat-at ber*arna dapat dilihat langsung, tetapi +uga dapat digunakan reagen

penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu at. 0sam kromat seringdigunakan

sebagai pelarut organik. Antuk menempatkan posisi suatu at, reagen dapat +uga

disemprotkan pada bagian tepi sa+a. Hagian yang dipeolrh lainnya dapat diperoleh

kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan penegrokan setelah pemisahan selesai.

Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan +ika dibandingkan dengan

kromatografi kertas, diantaranya 8

. @oda at yang timbul sesudah kromatografi tidak banyak melebar +ika

dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit sa+a

senya*a yang diperlukan.

&. Tidak memerlukan *aktu yang banyak

:. !enya*a-senya*a yang tidak menguap serta terlalu labil untuk

kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT

C. 7apat memeriksa adanya at pengotor dalam pelarut.

VI" A- '-. B--.A-

- Pipet tetes - Kaca

- 4elas ukur - Pengaduk

- Heker gelas - Kertas !aring

- Magnetic stirrer

- 0lat stahl

- @eraca analitik


6/15

B--.

- !ilika 4el

- 6thanol

- 4lysin

- 0rginin

- 0sparagin

- @inhidrin

- ?uprinitrat

VII" P+!'5 P*+,--.

1" P/,5--. L-&! T&&!

Plat gelas yang dipakai hars bersih, terutama harus bebas lemak. Timbang &; gr

silica gel dan kocok dengan ;' ml air selama :' detik "+angan terlalu kental).

Kemudian suspensi ini dituangkan keatas plat kaca dan siap ditipiskan. Tebal lapis

harus sama.

2" M.!-. L-5-. ;- #-. D&&!-

Gat asam amino "4lutamate, 0rginin, 4lisin, 0lanin) diteteskan pada plat silica gel

kira-kira : cm dari tepi ba*ah. 5ika banyak macam at yang akan diselidiki, maka

ini dapat diteteskan se+a+ar dengan +arak ,; cm dari tepi sisi. Penetesan harus

dilakukan dengan hati-hati sekali agar permukaan lapis tidak rusak. Tempat- tempat

pada plat yang akan ditetesi dengan larutan tersebut, sebelumnya telah diberi titik

dengan u+ung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan.

Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda.

3" -- M-5-. E5!&

Plat-plat yang telah dibasahi asam amino dan yang telah dikeringkan, dimasukan

kedalam ruang kromatografi. 7isini yang dipakai adalah kromatografi mendaki.

$endaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah eluen ber+alan

sekitar ' cm. Pada batas ini semula diberi tanda garis dengan u+ung pensil yangruncing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar.


7/15

VIII" H-!& P.-/--.

-- K7- P.-/--.

' gram silica gel I &; mL air diaduk

menggunakan pengaduk magnetic

selama :' detik.

!ilika gel ditetesi asam amino lalu

dielusi hingga ( cm

6lusi sampai ( cm

!ampel disemprot larutan ninhidrin,

lalu dimasukkan dalam oEen "'

menit)

Ter+adi perubahan *arna men+adi merah

muda keunguan

!ampel disemprot larutan kuprinitrat,

dan hitung +arak tempuh asam amino

dari titik a*al hingga akhirnya

!ampelRf

Teori

Rf

Praktek

Pan+ang

sampel0rginin ',& ',; C

4lisin ',&/ ',/( ;,;

0paragin ',; ',;/ C,;

0sam

amino J',& ',; C

I>" P!-/--. R-!&

Reaksi 0sam amino dan @inhidrin


8/15

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRIT

H2N CH C

O

OH

R

+ Cu(NO3)2

O

C

R

O

Cu++

NH2NH2

O

R

C

O

+ 2NO3-

asam amino

ku!ini"!i"

s#n$a%a komks un'u

>" A.-&!- D--

A" P/,5--. L-5-. G?!&. 2 @

Bolume larutan yang akan dibuat 9 '' ml

& < 4ly 9

&='' "'') 9 J "''='')

&''='' 9 J

& gram 9 J

Massa 4lysin yang dibutuhkan 9 & gram "dimasukkan kedalam labu ukur ''

ml I a%uadest)

B" P/,5--. L-5-. A&.&. 2 @


& < 4ly 9

&='' "'') 9 J "''='')

&''='' 9 J


9/15

& gram 9 J

Massa 0rginin yang dibutuhkan 9 & gram "dimasukkan kedalam labu ukur ''

ml I a%uadest)

" P/,5--. L-5-. A!--&. 2 @


& < 4ly 9

&='' "'') 9 J "''='')

&''='' 9 J

& gram 9 J

Massa 0sparagin yang dibutuhkan 9 & gram "dimasukkan kedalam labu ukur

'' ml I a%uadest)

D" P/,5--. L-5-. > 2 @


& < 4ly 9

&='' "'') 9 J "''='')

&''='' 9 J

& gram 9 J

Massa J yang dibutuhkan 9 & gram "dimasukkan kedalam labu ukur '' ml I

a%uadest)

E" P/,5--. L-5-. P.?/+ 5& .&-

Tambahkan &,; ml larutan +enuh kuprinirat dalam air ke dalam &;' ml /<

alkohol. Tambahkan +uga ',& ml larutan ' < asam nitrat. Tetapi sebelumnyadibuat dahulu larutan asam nitrat ' < dan larutan alkohol /<

• M/,5- -5-. -!-/ .&- 10 @

Bolume larutan yang akan dibuat 9 ml

'< 9

'='' ") 9 J "''='')

'='' 9 J', ml 9 J

Bolume J yang dibutuhkan 9 ', ml "ditambahkan ', ml a%uades )

• M/,5- -5-. -++ (-.+) 96@ !,-.?- 20/L

Larutan #nduk 8 etanol '' <

"ditambahkan ' ml a%uades)

F" P/,5--. -5-. .?/+ .&.&'&.


10/15

Larutkan ',>; gr ninhidrin ke dalam &;' ml n-butanol. Tambah >,; ml asam asetat

glasial.

G" M.&5. R -!-/-!-/ -/&.+

Dimana jarak tempuh pelarut = 8 cm

Rf asam amino 0rginin 9 ',C cm

Rf asam amino 4lysin 9 ',/( cm

Rf asam amino 0sparagin 9 ',;; cm

Rf asam amino J 9 ',C cm

>I" P/,--!-.

Pada percobaan kromatografi lapis tipis ini dilakukan untuk mengetahui harga

Rf dari beberapa macam asam amino yang diu+ikan. 0sam amino yang diu+i dalam

percobaan ini ialah arginin, glysin, asparagin dan +uga asam amino yang tidak

diketahui +enis asam aminonya. 0sam amino ini dapat diketahui setelah dilakukan u+i

asam amino yang memiliki ciri-ciri yang sama dengan asam amino yang diu+ikan. Pada

percobaan kaca yang digunakan harus benar-benar bersih bebas dari lemak oleh karena

itu dibersihkan menggunakan sabun anti lemak dan selan+utnya dilakukan

pengeringan. Fase diam yang digunakan pada percobaan KLT ini adalah silica gel,

sedangkan fase geraknya adalah etanol. Pembuatan lapisan dari silica gel dengan cara

mencampurkan &; gr silika gel dengan ;' ml a%uades kemudian di letakkan pada plat

kaca. Lalu membuat lapis tipisnya frame pada pinggiran kacanya harus dibuat rata serta

pada saat penarikan seilikanya harus dalam satu kali tarikkan agar permukaannya tidak

bergelombang setelah itu dilakuakn pengeringan. Pada penetesan asam amino perlu

dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam

amino yang kami lakukan dengan +arak cm dari tepi ba*ah. 6luen yang akandi+alankan diukur sepan+ang ( cm. !etelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen

siap di+alankan "dengan etanol). 6luen pun ber+alan tergantung dengan lapis silikan gel

yang dibuat. Hila lapisan silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan

ber+alan lambat, dan +uga sebaliknya.

Antuk melihat bercak noda dari +arak asam amino dapat disemprotkan dengan

larutan ninhidrin agar terbentuk *arna. 7i sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak

+alannya asam amino dengan menimbulkan *arna pada asam amino dan dapatmenghitung harga Rf dari asam-asam amino. !elan+utnya dilakukan penyemprotan

kuprinitrat untuk menstabilkan noda-noda setelah di*arnai dengan ninhidrin sehingga


11/15

ter+adi kupri-ninhidrin yang ber*arna. Hagus tidak hasilnya sangat dipengaruhi oleh

tebal atau tipisnya silika gel yang dibuat. !etelah disemprot, pada silica gel muncul

bercak - bercak atau noda. Pada pengamatan diketahui Rf asam amino 0rginin 9 ',C cm,

Rf asam amino 4lysin 9 ',/( cm, Rf asam amino 0sparagin 9 ',;; cm, Rf asam amino

J 9 ',C cm. 7ari percobaan maka hasil Rf asam amino dengan teori ada perbedaan yang

mungkin disebabkan kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya, kesalahan pada

pembuatan larutan sampel yang digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak

merata serta dengan +arak yang terlalu dekat dan mungkin karena penetesan sampel

pada plat yang tidak merata serta dengan +arak yang terlalu dekat.

>II" K!&/5-.

. Kromatografi merupakan salah satu cara untuk melakukan pengidentifikasikansuatu asam amino.

2. Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yang digunakan harus benar-benar

terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi.

:. Pada percobaan menggunakan silika gel sebagai fase diam serta eluen "fase

gerak)nya adalah etanol.

C. Penyemprotan ninhidrin dan ?uprit berfumgsi untuk mengidentifikasi *arna asam

amino yang terbentuk.

;. 0sam amino yang digunakan ialah 0rginin

/. Pengidentifikasian asam amino dengan melihat noda atau bintik yang dihasilkan,

sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino

D-- P5!--

Lehninger. (&. Dasar-dasar Biokimia. 5akarta 8 6rlangga

Poed+adi, 0na dan Titin !upriyanti. &''/. Dasar Dasar Biokimia. 5akarta8 AniEersitas

#ndonesia

!yahputra,0ries. &''. Kromatografi Lapis Tipis. "nline)

http://kimiadahsat.blogspot.com/!""#/"$/ kromatogra%i-lapis-tipis .html 7iakses

pada tanggal ; @oEember &';

inatarma,Putra. &'&.

Kromatogra%i. "nline) http://&ikivitamin.com/jenis-

kromatogra%i/ '7iakses pada tanggal ; @oEember &';

http://kimiadahsyat.blogspot.com/2009/07/kromatografi-lapis-tipis.htmlhttp://kimiadahsyat.blogspot.com/2009/07/kromatografi-lapis-tipis.htmlhttp://wikivitamin.com/jenis-kromatografi/http://wikivitamin.com/jenis-kromatografi/http://kimiadahsyat.blogspot.com/2009/07/kromatografi-lapis-tipis.htmlhttp://wikivitamin.com/jenis-kromatografi/http://wikivitamin.com/jenis-kromatografi/


12/15

L-/&-. I

J-- ?-. '&/5 5. S- '&!/+ 5&.&-

S- '&!/+ .&.&'&.


13/15


14/15

&. Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam aminoN

:. !ebutkan factor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT

5a*ab 8

Kepolaran senya*a, +arak penetesan, 5-&-! -'!+,.% ,--. -&!-.%

7.5-. 5-. +/-+-&% .& ./,-.-. (5!&)% !55% '-.

5-&-! -5"

C. Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu at tertentu dengan

cara kromatografi lapis tipis


15/15

5a*ab 8

7engan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat ;'< atau &;< dalam eetanol

kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak

sebagai noda-noda coklat.

Mengamati lempeng dengansinar AB sehingga noda-noda yang menyerap sinar AB

atau sebaliknya dengan memancarkannya.

Hahan sample ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan

pemisahahn dilakukan setelah lmepeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan

satu system solEen yang lain dengan arah tegak luus dari arah semula.

;. Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan

bilakah orang terpaksa melakukan cara itu

5a*ab8

7engan mengamati kepekatan *arna yang diperoleh. Antuk cara ini, sample

diteteskan dipo+ok kanan ba*ah dari plat TL? yang berukuran &' &' cm, kira-kira

& cm dari tepi kanan dan dari ba*ah. !etelah pengembangan pertama selesai, plat

dikeringkan. Antuk mencegah ter+adinya kerusakan senya*a yang dipisahkan

selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas @&. setelah dikeringkan,

plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan

memutar arah plat 'o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan

yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila

pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.

Laporan Tetap Mumtika Empat

Documents

Transcript of Laporan Tetap Mumtika Empat