larutan fixatif

download larutan fixatif

of 35

Transcript of larutan fixatif

DEPARTEMEN HISTOLOGI FKUSU

Zulham

Penuntun Praktikum HISTOTEKNIK

KATA PENGANTAR Alhamdulillahirobbil alamin. Segala pujian hanya pantas ditujukan kepada Allah SWT. Tak ada satu pun makhluk di dunia ini yang pantas mendapatkan pujian melebihi diriNya. Shalawat dan Salam hanyalah untuk Muhammad Rasulullah SAW, seorang manusia luar biasa. Ia senantiasa menjadi inspirasi saya. Ia menjadi semangat saya ketika saya melemah dan membutuhkan dukungan. Dengan senang hati, saya menghadirkan penuntun praktikum ini. Buku kecil ini dibuat untuk membantu mahasiswa Pascasarjana Biomedik USU. Buku ini didisain agar pembacanya dapat memahami pekerjaan pengawetan jaringan di Departemen Histologi FKUSU dalam waktu singkat. Histoteknik memiliki filosofi sendiri dan diperlukan waktu, ketekunan, dan kesabaran untuk mencapai tingkat keterampilan yang baik. Dengan segala kerendahan hati, saya akan menerima semua masukan bagi perbaikan buku ini di masa yang akan datang. Semoga bermanfaat. Medan, 17 Agustus 2009 Zulham [email protected]

i | dr. Zulham, M. Biomed.

DAFTAR ISI

Kata Pengantar Daftar Isi Histoteknik Pembiusan dan Pembedahan Hewan Kecil Membuat Larutan Pengawet Mengawetkan Jaringan Pemrosesan Jaringan Mengiris Blok Parafin Pewarnaan Haematoxylin dan Eosin Lembar Kerja Praktikum Lampiran 1 Lampiran 2 Lampiran 3

i ii 1 2 5 15 16 20 23 26 28 29 30

ii | dr. Zulham, M. Biomed.

1.

Histoteknik

Histoteknik adalah metoda membuat sajian dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian histologi yang siap untuk dianalisis. Sajian histologi lebih dikenal dengan sebutan preparat histologi. Preparat yang baik dapat digunakan untuk bahan praktikum mahasiswa dalam mempelajari struktur normal jaringan tubuh, mempelajari peran sel/jaringan dalam keadaan fisiologi atau patologis, mempelajari perubahan sel/jaringan akibat suatu perlakuan pada penelitian, dan alat bantu diagnosis penyakit pada suatu kelainan patologis. Preparat yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur jaringan tubuh sesuai dengan kondisi sewaktu hidup, memberikan hasil yang shahih (valid/akurat) yang sangat dibutuhkan para peneliti untuk menjawab permasalahan/pertanyaan riset, menunjang/menentukan diagnosis penyakit pasien atau kedokteran forensik. Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut preparat histologi yang dibuat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk, besar, dan susunan sel/jaringan sebagaimana aslinya pada saat sel/jaringan tersebut hidup. SUMBER JARINGAN Jaringan yang akan diproses untuk menjadi sajian histologi dapat diperoleh dari: 1. Manusia Dalam pendidikan kedokteran, sumber jaringan yang ideal adalah jaringan yang berasal dari manusia. Sumber ini dapat diperoleh dari cadaver/jenazah, biopsi organ, atau patologi bedah. Sumber cadaver yang dapat dipergunakan adalah sumber yang jaringannya diambil kurang dari 3 jam setelah kematian. Bila lebih dari 3 jam, maka jaringan telah mengalami pembusukan atau autolisis. Syarat tersebut pada saat ini sangat sulit untuk dipenuhi. Biopsi organ patologis yang didapat dari kamar operasi bisa menjadi alternatif sumber jaringan yang berasal dari manusia. Meskipun jaringan ini segar, hanya sedikit jaringan normal yang dapat diperoleh dari metoda ini. 2. Hewan Jaringan atau organ yang berasal dari hewan merupakan sumber alternatif. Beberapa hewan memiliki kemiripan struktur histologi dengan manusia. Beberapa organ memiliki perbedaan struktur dengan manusia. Beberapa hewan yang sering dipakai karena memiliki daya tarik untuk dipelajari, yakni: a. kera, paling menyerupai tubuh manusia karena sesama primata; b. kambing, terutama untuk mempelajari serat Purkinje di jantung; c. babi, terutama untuk mempelajari lobulus hati klasik dan arteri Hulsen di limpa; d. kucing dan anjing; untuk mempelajari organ penghidu; e. kelinci; digunakan untuk mempelajari papila foliata; f. mencit (mice) dan tikus (rat).

1 | dr. Zulham, M. Biomed.

2. Pembiusan dan Pembedahan Hewan KecilKesulitan mendapatkan jaringan tubuh manusia dapat dibantu dengan menggunakan hewan kecil. Eksperimen juga sangat menyenangi penggunaan hewan kecil karena masa hidup yang singkat dan kemudahan dalam pemeliharaan dan pengembangbiakannya. PRINSIP Tikus, mencit, dan hewan kecil lainnya bermanfaat sebagai subyek eksperimen yang bagus di laboratorium. Proses-proses fisiologis yang terjadi pada manusia dan vertebrata lainnya dengan mudah dipelajari pada tikus. Prosedur penanganan tikus dan pemberian anestesianya sebaiknya dipelajari dengan seksama. PROSEDUR PERLAKUAN DAN PENANGANAN HEWAN KECIL Tikus adalah hewan yang aktif pada malam hari dan hidup di dalam liang dengan kemampuan penglihatan yang lemah. Jika tikus diletakkan pada meja laboratorium, tikus tidak akan melarikan diri. Tikus dapat duduk di cawan timbangan cukup lama sehingga kita dapat membaca ukuran beratnya. Akan lebih mudah, tikus diberi anestesia lebih dulu. Tetaplah berhati-hati saat menangani tikus karena tikus dapat menggigit. Pegang tikus dengan telunjuk dan ibu jari mengelilingi kepala sehingga ujung telunjuk dan ibu jari berada di ujung bawah dari rahang bawah tikus. Pastikan tidak terjadi tekanan ke depan leher sehingga tikus tidak tercekik. Tidak membahayakan bagi tikus memegang ekor tikus. Namun, tikus dapat memanjat ekornya sendiri dan menggigit tangan anda jika tikus dijuntaikan terlalu lama. PERSIAPAN ALAT DAN BAHAN Alat yang dibutuhkan untuk bekerja pada pembedahan hewan kecil adalah minor surgery set (gunting, pinset anatomis, dan lainnya), sacrifice chamber (euthanasia chamber) (Gambar 2.1.), jarum suntik, dissecting tray (baki pembedahan), dan kapas. Bahan yang diperlukan dapat berupa ketamin (injeksi) atau eter (inhalasi). Beberapa alat dan bahan lainnya yang mungkin diperlukan sebaiknya disesuaikan dengan keperluan.

Gambar 2.1. Euthanasia chamber

2 | dr. Zulham, M. Biomed.

PEMBIUSAN Pembiusan dapat dilakukan dengan pemberian inhalasi eter. Kapas yang telah dibasahi dengan eter diletakkan dalam ruang kaca. Hewan kecil dapat menjalani eutanasia dengan ditempatkan pada suatu ruang kaca tertutup sehingga mengalami asfiksia oleh CO2. Anestesia lainnya yang dapat digunakan adalah ketamin. Obat tersebut diberikan dengan suntikan IM (intramuskular) pada otot gluteus maximus atau quadriceps (bokong atau paha atas). Suntikan sebaiknya dilakukan dengan jarum suntik 1 ml dengan panjang jarum 1 inchi berukuran 26 ga. Anestesia sudah sempurna dalam 5 menit. Jika anestesia terlalu dalam, tikus akan menunjukkan pernafasan dangkal dan lambat. Pernafasan yang cepat dan dalam adalah ciri rangsang yang mulai muncul karena anestesia yang terlalu ringan. Cara lain untuk eutanasia adalah dengan melakukan dislokasi leher. Leher tikus dipegang dengan tangan kiri sehingga tidak bergerak. Tangan kanan memegang ekor tikus lalu menarik ekor menjauhi kepala tikus. Bila prosedur ini dilaksanakan dengan benar tikus akan segera mati. PEMBEDAHAN Telentangkanlah hewan pada baki pembedahan (posisi supine). Gunakan tali untuk mengikat kaki sehinga hewan telentang lebar (Gambar 2.2.). Jangan mengikat kaki depan terlalu kuat karena akan mengganggu pernafasan. Lakukan insisi midline melalui kulit dari daerah pubis hingga ujung rahang bawah (Gambar 2.3.). Lakukan insisi midline pada otot dinding perut dari simfisis pubis hingga ujung bawah sternum (Gambar 2.4.). Pada potongan midline, akan terjadi sedikit perdarahan. Pemotongan hingga rongga dada akan membunuh tikus karena pneumothorax. Lakukan tracheotomy dan nafas buatan jika anda menginginkan hewan tetap hidup.

Gambar 2.2. Tikus terikat di dalam baki pembedahan

3 | dr. Zulham, M. Biomed.

Gambar 2.3. Insisi dibuat dengan gunting melalui kulit

Gambar 2.4. Potongan pada otot abdomen. Potongan tidak mengenai diafragma untuk menghindari pneumothorax.

4 | dr. Zulham, M. Biomed.

3. Membuat Larutan PengawetPengawetan/fiksasi adalah stabilisasi unsur penting pada jaringan sehingga unsur tersebut tidak terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua sajian histologi yang baik. Kesalahan yang dilakukan pada tahap ini tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada tahapan selanjutnya. Jadi, hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara melakukan fiksasi dengan baik. Tujuan fiksasi adalah: 1. Mengawetkan jaringan Fiksasi akan mempertahankan susunan jaringan agar mendekati kondisi sewaktu hidup. Tujuan fiksasi adalah mengawetkan jaringan secara permanen sedekat mungkin dengan keadaan saat hidup. Fiksasi sebaiknya dikerjakan sesegera mungkin setelah pengambilan jaringan (pada kasus patologi bedah) atau segera setelah kematian (dengan otopsi) untuk mencegah otolisis. Tidak ada bahan pengawet yang sempurna; formalin mendekati kesempurnaan. Dengan demikian, bahan pengawet yang digunakan bergantung pada jenis jaringan dan fitur yang akan didemonstrasikan. Seringkali larutan pengawet merupakan campuran dari berbagai bahan pengawet sehingga dapat memaksimalkan kemampuan masing-masing bahan atau mengurangi kelemahan bahan lainnya. 2. Mengeraskan jaringan Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak sehingga memudahkan pembuatan irisian yang tipis. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses: 1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman pembusuk dari dalam/luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap jaringan/organ adalah berbeda tergantung pada konsistensi dan kandungan unsur penyusun jaringan. Usus dan otak sangat rentan terhadap proses pembusukan dibandingkan dengan jaringan tubuh lainnya. Pembusukan sering disertai oleh pembentukan gas yang berbau. Autolisis adalah proses kerusakan jaringan tubuh yang disebabkan enzim-enzim proteolitik yang terdapat pada sel/jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat terjadi pada suhu tropik (24 36 oC). Proses proteolitik juga lebih mudah terjadi di negeri tropis dibanding dengan negeri iklim sub tropik. Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan ke dalam cairan fiksasi segera setelah kematian atau diambil dari tubuh. Bila keadaan ini tidak memungkinkan, jaringan dapat disimpan sementara dengan dibekukan dalam ruang bertemperatur dingin (freezer, -20 oC) atau dengan nitrogen cair (-70 oC). 2. Pengawetan jaringan 3. Pengerasan jaringan 4. Pemadatan koloid Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (sol) menjadi lebih padat (gel). 5. Diferensiasi optik Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan. Sebelum diwarnai, struktur jaringan yang telah difiksasi akan lebih mudah dilihat dibandingkan dengan struktur jaringan yang belum difiksasi.5 | dr. Zulham, M. Biomed.

6. Pengaruh terhadap pewarnaan Cairan fiksasi dapat mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat bagian reaktif jaringan. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PENGAWETAN Ada sejumlah faktor yang akan mempengaruhi proses pengawetan: 1. Dapar Pengawetan sebaiknya dikerjakan pada pH yang mendekati netral, 6 8. Jaringan hipoksia menurunkan pH, sehingga harus terdapat kapasitas dapar pada pengawet untuk mencegah keasaman yang berlebihan. Keasaman memudahkan terbentuknya pigmen heme-formalin yang akan muncul sebagai deposit hitam yang dapat terpolarisasi di jaringan. Dapar umum terdiri atas fosfat, bikarbonat, kakodilat, dan veronal. 2. Penetrasi Penetrasi jaringan bergantung pada kemampuan difusi masing-masing fiksatif. Formalin dan alkohol adalah yang terbaik sementara glutaraldehida adalah terjelek. Merkuri dan yang lainnya berada di antaranya. Untuk mengatasi ini, jaringan diiris dengan ketipisan 3 5 mm. Jaringan yang tipis akan lebih mudah dipenetrasi daripada jaringan tebal. Untuk pekerjaan rutin, jaringan dapat dibuat dengan ketebalan hingga 1 cm. Dengan ketebalan ini, diharapkan cairan fiksasi dapat dengan cepat memfiksasi seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal, maka permukaan luarnya saja yang berhasil difiksasi sedangkan bagian tengahnya dapat membusuk sebelum cairan fiksasi sempat merembes/menginfiltrasi ke sana. Untuk mikroskopi elektron, ketebalan irisan jaringan adalah 1 mm. 3. Volume PengawetVolume pengawet adalah penting. Sebaiknya, volume pengawet adalah 10 x volume jaringan yang difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan

4.

5.

6.

7.

sedangkan tebalnya jaringan menentukan lamanya fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang digunakan. Konsentrasi Konsentrasi pengawet sebaiknya diatur ke kadar terendah yang mungkin, karena pertimbangan ekonomis. Konsentrasi formalin terbaik adalah 10%, sedangkan glutaraldehida pada 0,25% - 4%. Konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menimbulkan artefak yang sama dengan panas yang berlebihan. Interval Waktu Jaringan yang didapat harus segera diawetkan. Artefak akan timbul bila jaringan mengering, sehingga bila belum mendapat pengawet, rendamlah dalam larutan garam fisiologis. Semakin lama jaringan menunggu untuk diawetkan, semakin banyak kehilangan organel sel dan pengerutan nukleus sehingga banyak artefak terbentuk. Suhu Peningkatan suhu, seperti reaksi kimia lainnya, akan meningkatkan laju pengawetan. Ini tidak berarti bahwa anda dibenarkan untuk merebus jaringan dalam bahan pengawet. Formalin yang panas akan mengawetkan lebih cepat. Jenis Larutan Pengawet Jenis larutan fiksasi yang akan digunakan bergantung pada jenis unsur jaringan yang ingin didemonstrasikan dan pewarnaan yang akan dilakukan.

6 | dr. Zulham, M. Biomed.

KELOMPOK BAHAN PENGAWET Ada 5 kelompok utama bahan pengawet yang dikelompokkan menurut mekanisme kerja, yaitu aldehydes, mercurials, alcohols, oxidizing agents, dan picrates. Aldehydes Contoh bahan pengawet kelompok aldehida di antaranya adalah formaldehida (formalin) dan glutaradehida. Jaringan terawetkan oleh cross-linkage yang terbentuk pada protein, khususnya antara residu lysine. Ini tidak banyak mengganggu struktur protein, sehingga antigenisitas tidak menghilang. Dengan demikian, formaldehida cocok untuk teknik imunoperoksidase. Formalin menyusupi jaringan dengan baik, tetapi relatif lambat. Larutan standar adalah formalin dapar netral 10%. Dapar mencegah suasan asam yang akan meningkatkan autolisis dan menyebabkan presipitasi pigmen heme-formol di jaringan. Formalin digunakan untuk semua jaringan otopsi dan patologi bedah rutin saat preparat HE dibuat. Formalin adalah pengawet yang banyak digunakan untuk kondisi yang tak ideal dan tak ada jaringan yang dirusaknya. Baunya yang menusuk hidung membuat formalin sangat dikenal oleh banyak pihak sehingga cukup berhati-hati dalam mengurusnya. Glutaraldehida menyebabkan deformasi struktur heliks-alfa protein sehingga tidak baik untuk pewarnaan imunoperoksidase. Namun, ia mengawetkan dengan sangat cepat sehingga baik untuk mikroskopi elektron. Ia mempenetrasi dengan lambat, tetapi memberi rincian sitoplasma dan nukleus. Larutan standar adalah glutaraldehida dapar 2%. Glutaraldehida harus dalam keadaan dingin dan dapar dan tak boleh berumur lebih dari 3 bulan. Jaringan haruslah sesegar mungkin dan irisan jaringan untuk fiksasi glutaradehida adalah tidak boleh lebih tebal dari 1 mm untuk meningkatkan pengawetan. Mercurials Belum diketahui bagaimana merkuri dapat mengawetkan jaringan. Pengawet Ini memiliki kemampuan rendah dalam hal penetrasi dan menyebabkan beberapa jaringan mengeras, tetapi bekerja cepat dan memberikan rincian nukleus yang sangat bagus. Penggunaan terbaiknya adalah untuk pengawetan jaringan hematopoietik dan retikuloendotel. Karena mengandung merkuri, larutan ini harus dibuang dengan berhatihati. Pengawet zenker direkomendasikan untuk jaringan retikuloendotel termasuk limfonodus, limpa, timus, dan sumsum tulang. Namun deposit merkuri harus dihilangkan melalui langkah dezenkerisasi sebelum pewarnaan atau deposit hitam akan terbentuk pada preparat. Alcohols Alkohol, termasuk metil alkohol (metanol) dan etil alkohol (etanol), adalah denaturan protein dan tidak secara rutin digunakan untuk pengawetan jaringan karena menyebabkan terlalu rapuh dan keras. Namun, kemampuannya sangat bagus untuk apusan sel karena kerjanya cepat dan memberi rincian nukleus yang bagus. Alkohol, khususnya etanol, terutama digunakan untuk apusan sel. Etanol (95%) beharga murah dan cepat bekerja. Karena apusan hanya setebal satu sel, tidak ada masalah pengerutan dan kerapuhan (karena apusan sel tak diiris).

7 | dr. Zulham, M. Biomed.

Oxidizing agents Oxidizing agents terdiri atas pengawet permanganat (kalium permanganat), dikromat (kalium dikromat), dan osmium tetroksida. Pengawet ini menimbulkan cross-link protein, tetapi menyebabkan denaturasi yang berlebihan. Picrates Pikrat terdiri dari pengawet dengan asam pikrat, yang terkenal adalah larutan Bouin. Mekanisme aksinya belum diketahui. Hampir sama baiknya dengan merkuri dalam hal rinci nukleus tetapi tidak banyak menimbulkan pengerasan jaringan. Larutan Bouin terkadang direkomendasikan untuk pengawetan jaringan testis, saluran cerna, dan endokrin. Larutan ini juga cukup baik untuk mengawetkan jaringan hematopoiesis. Berdasarkan tujuan pembutan preparat atau keperluan praktis, cairan pengawet dapat dikelompokkan pula menjadi tiga kelompok yaitu: a. Microanatomical Fixatives Jenis ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. Larutan pengawet yang tergolong kelompok ini adalah larutan formalin atau modifikasinya seperti larutan asam asetatalkohol-formalin, Heidenhains Susa, Zenker, dan Bouin. b. Cytological Fixatives Pengawet ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak dipertahankan dan diekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering dengan mengorbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan dengan mikrotom, dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan fiksasi yang tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnoy) dan fiksasi sitoplasma (larutan Muller, formal-saline, formal-calcium, Zenker formal). c. Histochemical Fixatives Pengawet ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan histokimia. Cairan pengawet histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: 1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan 2. Mengikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus tanpa atau sedikit mempengaruhi gugus reaktif yang digunakan pada visualisasi. 3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi. Misalnya glutaraldehida memfiksasi protein jaringan dengan menghasilkan suatu selaput gugus aldehida reaktif sehingga menghasilkan reaksi PAS positif. LARUTAN PENGAWET YANG SERING DIGUNAKAN Larutan Formalin Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Larutan formalin yang digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah Formalin (Formaldehida 40%)..................................................... 10 ml Air .............................................................................................. 90 ml Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai formalin atau formaldehyde8 | dr. Zulham, M. Biomed.

40%. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan formaldehyde 40% sama dengan larutan jenuh gas formaldehida dalam akuades. Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat digunakan untuk fiksasi; yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan dibuat netral atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekalikali menggunakan formalin 10% yang baru dibuat karena jaringan akan membusuk sebelum terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit alkalis dengan menggunakan larutan dapar fosfat dengan pH 7,2 sebagai pelarut, atau dengan menambahkan kalsium asetat. Larutan yang paling mudah dan murah adalah larutan formalsaline dengan formula: Formalin (40% formaldehyde) ................................................. 100 ml Natrium klorida (NaCl).............................................................. 9 gram Akuades.................................................................................... 900 ml Larutan dapar formalin 10% yang sering digunakan adalah: Formal Calcium (Lilli, 1965) Formalin (40% formaldehyde) ......................................................... 10 ml Kalsium asetat .................................................................................. 2 gr Akuades ................................................................................... ad 100ml Formal Calcium (Baker, 1944) Formalin (40% formaldehyde)......................................................... 10 ml Kalsium klorida ........'.......................................................................... 2 gr Akuades .......................................................................................ad 100 ml Neutral Buffered Formalin Formalin ............................................................................................ 10 ml Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0,40 gr Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0,65 gr Akuades ...........................................................................................ad 100 ml Buffered Formalin Sucrose (Holt dan Hicks, 1961) Formalin ............................................................................................. 10 ml Sukrosa................................................................................................ 7,5 gr Phosphate buffer saline (pH 7,4)..................................................ad 100 ml

1.

2.

3.

4.

Cairan formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik, fosfolipida, dan beberapa enzim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian gabungan sitokimia dan mikroskopi elektron. Untuk mendapatkan hasil terbaik, jaringan harus didinginkan dalam refrigerator (4oC). Kelebihan larutan fiksatif formalin adalah: a. merupakan cairan pengawet umum;9 | dr. Zulham, M. Biomed.

b. pH mendekati netral; c. pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk. Pembentukan pigmen formalin akan terjadi bila terdapat interaksi antara larutan formalin ber-pH asam dengan hemoglobin atau produknya. Pigmen formalin sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hati, limpa, dan sumsum tulang. Pigmen formalin dapat dihilangkan dengan perlakuan asam pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam natrium hidroksida (NaOH) saat rehidrasi irisan jaringan. Larutan Asam Pikrat-Alkohol (rendam selama - 2 jam) Larutan asam pikrat jenuh dalam alkohol 70%....................................85 ml Alkohol 70%..............................................................................................15 ml d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formal-saline untuk jangka waktu lama (dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti; e. Bila diperlukan, jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat diambil dan dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lain. Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah: a. Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam baru dapat diproses. b. Terjadi pengerutan pada jaringan. Pengerutan ini tidak disebabkan fiksatif formalin (yang menimbulkan sedikit pembengkakan) namun oleh alkohol dalam proses dehidrasi. c. Formaline-saline menjadi asam saat disimpan lama karena formaldehida teroksidasi menjadi asam format. Jaringan yang disimpan beberapa bulan sering gagal menghasilkan pewarnaan yang baik. Larutan Muller Cairan fiksasi ini merupakan fiksatif sitologi yang dapat digunakan untuk memfiksasi nukleus dan sitoplasma. Kalium dikromat yang terdapat dalam larutan Muller akan memfiksasi protein tanpa mempresipitasikannya. Hal ini diduga terjadi karena ion krom membentuk kompleks-kompleks dengan air yang mengikat bagian reaktif rantai protein di dekatnya. Kalium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga fiksatif yang mengandung ion krom tidak dapat dipakai untuk histokimia. Kalium dikromat dapat digunakan untuk reaksi kromafin. Setelah difiksasi dengan larutan Muller, jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir selama 24 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi. Pemindahan jaringan secara langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkaikan lagi dari jaringan. Kelebihan dari larutan Muller adalah: a. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan baik. Jaringan biasanya akan terfiksasi baik dalam waktu 24 jam; b. Memfiksasi nukleus dan sitoplasma dengan baik. Kekurangan dari larutan Muller adalah: a. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Muller harus segera dilakukan proses dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik.10 | dr. Zulham, M. Biomed.

b. Tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metoda histokimia/imunohistokimia; c. Harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan proses dehidrasi. Formula larutan Muller adalah: Kalium dikromat .................................................................. 12,5 gram Natrium sulfat........................................................................ 5 gram Akuades .................................................................................ad 500 ml Larutan Bouin Cairan fiksasi ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit. Asam pikrat mudah meledak dalam keadaan kering sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar larutan). Asam pikrat mempresipitasikan protein dengan membentuk ikatan pikrat-protein. Asam pikrat menyebabkan rusaknya eritrosit, karena menghilangkan Fe3+ terutama bila Fe3+ berada dalam jumlah sedikit, namun dapat melindungi RNA dari proses perusakan oleh enzim ribonuklease. Kelebihan dari larutan Bouin adalah: a. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan terjadinya sedikit pengerutan. Untuk mengatasi hal ini, ke dalam larutan Bouin biasanya ditambahkan asam asetat glasial sesaat sebelum dipakai. Waktu fiksasi cepat yaitu 24 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang dari 2-3 mm dapat selesai difiksasi dalam 2-3 jam. Jika jaringan difiksasi lebih lama dari 24 jam, jaringan akan menjadi rapuh dan sulit diiris. Penyimpanan yang lama dalam etanol 70% dapat mengakibatkan pengerutan jaringan. Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk fiksasi meskipun rendah. Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama-sama dengan larutan fiksatif lain dan berfungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya. Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar nukleus tampak jelas dan tajam. Jaringan yang telah difiksasi sebaiknya dipindahkan ke etanol 70%. Penyimpanan yang lama dalam etanol 70% dapat mengakibatkan pengerutan jaringan. b. Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome. c. Sangat baik untuk memperlihatkan nukleus dan kromosom seperti pada sel benih testis dan ovum, embrio, dan kulit. d. Warna kuning membuat jaringan mudah dilihat saat perendaman dan pengirisan jaringan. Kekurangan dari larutan Bouin adalah: a. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik. b. Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran11 | dr. Zulham, M. Biomed.

semalam. Oleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan harus segera dipindahkan ke dalam alkohol. Formula larutan fiksatif Bouin adalah: Larutan asam pikrat jenuh ......................................................................... 75 ml Formalin (40% formaldehida)..................................................................... 25 ml Bila akan digunakan, tambahkan " asam asetat glasial" ....................................... 5 ml Larutan Zenker Formol (Cairan Helly) Larutan fiksatif Zenker mengandung merkuri klorida yang berfungsi untuk mempresipitasi protein. Merkuri klorida akan mengikat gugus asam protein dan gugus asam fosfat nukleoprotein, dan juga bereaksi secara khusus dengan gugus tiol (SH). Kelebihan dari larutan fiksatif Zenker adalah: a. Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi lunak karena underfixed. Untuk mengatasi hal tersebut larutan fiksatif ini biasanya dikombinasi dengan asam asetat, formalin, kalium dikromat, dan sebagainya. Waktu fiksasi umunya 6-24 jam. b. Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang banyak mengandung darah seperti jantung dan otot c. Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih cemerlang. Kekurangan dari larutan fiksatif Zenker adalah: a. Pemaparan jaringan di dalam larutan fiksatif ini yang melebihi waktu yang ditentukan akan mengakibatkan jaringan menjadi rapuh (keras), overfixed di bagian perifer dan underfixed di tengahnya. Jaringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan mikrotom. Formula larutan Zenker adalah sebagai berikut Merkuri klorida.......................................................................................... 5 gr Kalium dikromat..................................................................................... 2,5 gr Natrium sulfat............................................................................................. 1 gr Akuades.................................................................................................. ad 100 ml Tambahkan formalin segera sebelum pemakaian...................................... 5 ml Larutan Etil Alkohol (Etanol/Alkohol) Fiksasi ini biasanya digunakan untuk sajian apusan dan tidak digunakan untuk fiksasi jaringan, sebab larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan cenderung mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan fiksasi ini. Larutan ini memfiksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan mempresipitasi glikogen. Apabila fiksatif ini dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan Carnoy, fiksasi berlangsung cepat.

12 | dr. Zulham, M. Biomed.

Untuk keperluan imunositokimia, larutan metanol absolut dan aseton absolut dengan perbandingan sama dalam suhu -20 oC sering digunakan. Larutan Asam AsetatAlkoholFormalin (Tellyesniczky) Fiksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. Larutan ini akan mencegah karbohidrat menjadi larut sebelum unsur protein selesai difiksasi. Karena formalin dan alkohol merupakan zat dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan fiksatif yang kerjanya cepat. Jaringan dengan ketebalan 5 mm selesai difiksasi dalam 4 jam. Asam asetat tidak pernah digunakan sendiri karena efek pembengkakan pada serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh reagen lainnya. Asam asetat dapat memresipitasi nukleoprotein namun asam asetat juga mampu merusak/menghancurkan mitokondria dan aparatus Golgi. Formula larutan fiksatif ini adalah: Formalin .................................................................................................... 5 ml Asam asetat glasial .................................................................................... 5 ml Alkohol 70% .............................................................................................. 90 ml Larutan Heidenhains Susa Larutan ini merupakan larutan fiksatif karbohidrat yang sangat baik. Larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata serta memberikan hasil pulasan yang sangat cemerlang dengan rincian sitologi yang sangat baik. Jaringan dengan ketebalan kurang dari 8 mm selesai difiksasi setelah 12-24 jam. Bila jaringan difiksasi lebih dari 24 jam, jaringan akan menjadi keras dan rapuh. Formula larutan fiksatif ini adalah: Merkuri klorida ............................................................................................ 4,5 gr Natrium klorida .............................................................................................0,5 gr Trichloracetic acid ......................................................................................... 2 gr Asam asetat ................................................................................................... 4 ml Formalin ....................................................................................................... 20 ml Akuades ...................................................................................................... 100 ml Kelebihan Larutan Heidenhains Susa: Cocok untuk fragmen bedah yang kecil (biopsi) karena waktu fiksasi yang singkat dan jaringan dapat langsung direndam ke dalam alkohol 80 % atau 90%. Efek pengerasan adalah menengah. Menghasilkan sedikit/tanpa deposit fiksasi. Sebagian besar metoda pewarnaan bekerja baik dengan Susa kecuali trikrom dan impregnasi perak. Kekurangan Larutan Heidenhains Susa:13 | dr. Zulham, M. Biomed.

a. b. c. d.

a. Hanya potongan tipis jaringan yang dapat digunakan karena penetrasinya jelek. b. Jaringan yang direndam lebih dari 24 jam menjadi terlalu keras. c. Garam merkuri mempengaruhi logam. Larutan Carnoy Larutan ini merupakan larutan fiksatif inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat. Disamping itu, larutan fiksatif ini juga akan mengawetkan substansia Nissl dan glikogen. Keuntungan dari larutan Carnoy adalah sangat cepat. Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu diagnosis perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya untuk diagnosis kanker pada saat pembedahan. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2 jam, sedangkan potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit. Kekurangan fiksatif ini adalah efek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian besar unsur sitoplasma lainnya Efek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan fiksasi pada suhu nol derajat Celsius selama 18 jam. Formula larutan Carnoy adalah: Alkohol absolut ............................ .......................................................... 60 ml Kloroform ................................................................................................ 30 ml Asam asetat glasial ................................................................................... 10 ml

14 | dr. Zulham, M. Biomed.

4. Mengawetkan JaringanCara melakukan pengawetan jaringan ada 2 macam, yaitu: 1. Supravital/intravital; Teknik ini memungkinkan fiksatif mencapai seluruh jaringan dengan lebih cepat karena fiksatif dialirkan ke seluruh tubuh melalui perfusi dengan mesin perfusi. Alat yang digunakan adalah mesin perfusi, wing needle, selang infus. Bahan yang digunakan adalah NaCl fisiologis dan larutan pengawet. Cara mengerjakannya adalah sebagai berikut: wing needle ditusuk ke ventrikel kiri. Alirkan NaCl fisiologis secukupnya. Buat guntingan/lubang pada atrium kanan. NaCl fisiologis dialirkan secukupnya lalu diganti dengan fiksatif yang sesuai. Mesin perfusi akan mengambil alih fungsi jantung untuk mengalirkan fiksatif melalui pembuluh darah. Fiksasi dilakukan hingga hewan menjadi kaku. Pada tikus (rat), hal tersebut ditandai dengan kakunya ekor tikus. Selanjutnya jaringan yang diinginkan diambil dan difiksasi rendam. Jika anda tidak memiliki mesin perfusi, gunakan tekanan hidrostatik dengan meninggikan botol berisi larutan fiksasi dalam posisi cukup tinggi seperti melakukan infus. 2. Merendam dalam larutan fiksatif.

Gambar 4.1. Merendam jaringan dalam larutan pengawet

15 | dr. Zulham, M. Biomed.

5. Pemrosesan JaringanSetelah jaringan diawetkan, jaringan harus diproses menjadi bentuk yang dapat diiris dengan mikrotom. Biasanya pengirisan dikerjakan dengan parafin (suatu jenis lilin). Pekerjaan untuk mendapatkan jaringan yang telah diawetkan menjadi blok parafin disebut pemrosesan jaringan. Langkah utama pemrosesan jaringan adalah dehidrasi dan pembeningan. KEGIATAN SEBELUM PEMROSESAN JARINGAN Jaringan tertentu memiliki struktur yang berbeda dengan kebanyakan jaringan lainnya. Jaringan yang mengandung kalsium (tulang) atau jaringan yang keras (kulit) akan menjalani proses tertentu sebelum proses dehidrasi. Dekalsifikasi Banyak spesimen bedah mengandung daerah berkalsium yang perlu dihilangkan sebelum pemrosesan dan pengirisan jaringan. Dekalsifikasi dapat dilaksanakan sebagai berikut: 1. Saat spesimen telah cukup terfiksasi, jaringan ditempatkan ke pot-berlabel berisi asam format 8% dan dibiarkan hingga esok harinya. 2. Tiap hari setelahnya, jaringan dinilai hingga jaringan cukup lunak untuk diiris setelah diproses. 3. Jika belum siap, larutan dekalsifikasi ditukar dan pot kembali ditempatkan di rak untuk 24 jam berikutnya. 4. Prosedur ini diulang setiap hari hingga dekalsifikasi sempurna. Terdapat beberapa teknik lain dekalsifikasi seperti perendaman dengan EDTA, elektroforesis, dan lain-lain. Teknik Lendrum Teknik ini digunakan untuk melunakkan jaringan kulit pascafiksasi. Hal ini terjadi karena kulit merupakan jaringan yang keras. Setelah potongan kulit dikeluarkan dari larutan fiksatif, kulit dicuci sebentar dengan air kran mengalir atau dengan alkohol 90%, kemudian direndam dalam larutan fenol 4% dalam akuades selama 1-3 hari. Dengan perlakuan khusus ini, kulit diharapkan akan mudah diiris dengan pisau mikrotom tajam tanpa merobeknya. Sebelum memotong, pisau mikrotom sebaiknya direndam dalam es sehingga memudahkan pemotongan. Setelah dibuat blok, blok preparat sebaiknya disimpan dalam air es.

DEHIDRASI (DEHYDRATION) Dehidrasi adalah proses pengeluaran air dari jaringan agar jaringan tersebut dapat diisi oleh parafin/paraplast atau material lainnya sehingga jaringan dapat diiris tipis. Cairan dehidrasi dapat berupa alkohol dengan kadar yang meningkat, metanol, sukrosa, dan aseton. Alkohol dan aseton adalah yang paling sering digunakan.16 | dr. Zulham, M. Biomed.

Alkohol dengan konsentrasi yang semakin meningkat Cara I o Alkohol 70% 3 hari (3x ganti), alkohol 95% 3 hari (3x ganti), dan alkohol 100% 3 hari (3x ganti). Cara II o Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari; alkohol 95% 2 hari (2x ganti); alkohol 100 % 2 hari (2x ganti). Sukrosa 20% (untuk cryostat): Sukrosa 20% selama 2 hari; Spiritus atau metanol: jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti etanol; Aseton: 3 x 20 menit.

PEMBENINGAN (CLEARING) Clearing adalah upaya untuk mengeluarkan zat penarik air (dehidran) dan menggantinya dengan bahan kimia yang dapat bercampur dengan dehidran maupun parafin. Ada banyak bahan kimia yang dapat digunakan sebagai clearing agent yaitu kloroform, benzena (benzol), xylena (xylol), cedar wood oil, benzyl benzoate, atau methyl benzoate. Kloroform Bahan ini bersifat toleran sehingga jaringan dapat disimpan semalaman tanpa menjadi keras. Kekurangan bahan ini adalah titik akhir pembeningan tak dapat dilihat dengan mata. Saat menjadi bening dan transparan tak jelas. Cara mengatasi kelemahan ini adalah dengan memperpanjang waktu pembeningan. Selain itu, bahan ini lebih mahal dari xylena dan benzena tetapi lebih murah dari cedar wood oil. Benzena dan Xylena Kelebihan bahan ini adalah waktu clearing cepat yakni sekitar - 1 jam. Benzena bekerja lebih lambat dari xylena tetapi kerapuhan jaringan lebih berkurang dibanding xylena. Kekurangan bahan ini adalah sifatnya yang karsinogenik. Pembeningan dilakukan dengan merendam jaringan dalam xylol 2 kali 15 menit hingga jaringan tipis menjadi bening dan transparan. Pada organ yang banyak terdapat darah, organ mungkin akan tampak menghitam. Volume bahan adalah 20 50 kali volume jaringan. Setelah itu jaringan dimasukkan ke dalam parafin cair panas dalam oven parafin. Cedar Wood Oil Bahan ini merupakan bahan dengan sifat clearing paling baik karena tidak mengeraskan jaringan. Jaringan yang halus sangat baik. Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan jaringan ikat padat). Jaringan dapat disimpan dalam waktu lama (berbulanbulan) dalam bahan ini.

17 | dr. Zulham, M. Biomed.

Benzyl Benzoate Pembeningan dilakukan dengan merendam jaringan dalam benzyl benzoate I selama 24 jam hingga jaringan tenggelam. Jaringan menjadi bening dan transparan. Setelah itu dimasukkan ke dalam benzyl benzoate II selama 2-3 jam, lalu dimasukkan ke dalam BenzolParaffin selama - 1 jam. Campuran benzol dan parafin cair adalah dalam perbandingan yang sama. Masukkan ke dalam parafin cair. Methyl Benzoate Kelebihan metil benzoat adalah pada daya penetrasi yang lebih cepat daripada benzol benzoate. Kelemahannya adalah jaringan mudah rapuh. Pembeningan dilakukan dengan merendam jaringan dalam metil benzoat I sampai jaringan tenggelam. Lalu dimasukkan ke dalam larutan metil benzoat II selama 1-2 jam. Selanjutnya dimasukkan ke dalam campuran benzol dan parafin dengan perbandingan sama. Masukkan ke dalam parafin cair.

PEMBENAMAN (INFILTRATION/IMPREGNATION/EMBEDDING) Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening (clearing agent) dari jaringan dan menggantikannya dengan parafin atau bahan plastik. Hal yang perlu diperhatikan adalah clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam jaringan sehingga saat dipotong dengan mikrotom jaringan akan robek. Zat pembenam (impregnation agent) Parafin cair panas Ada banyak jenis parafin yang digunakan untuk pembenaman. Parafin tersebut dapat berbeda dalam titik cair (melting point), untuk beragam kekerasan dan cara pemotongan (hangat vs dingin). Untuk tujuan rutin, yang digunakan adalah parafin yang mencair pada suhu 56o 59o C. Paraplast Paraplast adalah campuran parafin murni dengan beberapa polimer plastik. Bahan ini lebih elastis dari parafin biasa sehingga dapat dipotong dengan mudah dan lebih tipis. Plastik Alternatif parafin termasuk sejumlah plastik yang memungkinkan irisan yang lebih tipis. Plastik tersebut adalah metil metakrilat, glikol metakrilat, araldite, dan epon. Metil metakrilat sangat keras dan karenanya baik untuk pembenaman tulang yang belum hilang kalsiumnya. Glikol metakrilat adalah yang paling luas digunakan, di antara plastik lainnya, karena paling gampang untuk dikerjakan. Araldit hampir sama dengan metakrilat, tetapi membutuhkan proses pembenaman yang lebih kompleks. Epon digunakan secara rutin untuk mikroskopi elektron. Plastik memerlukan reagen khusus untuk dehidrasi dan pembeningan. Mikrotom khusus diperlukan untuk mengiris blok ini.

18 | dr. Zulham, M. Biomed.

Teknik Pembenaman 1. Parafin/paraplast I selama 1 jam; 2. Parafin/paraplast II selama 1 jam; 3. Parafin/paraplast III selama 1 jam.

Gambar 5.1. Blok parafin yang dicetak di atas cassette (kiri). Cassette (kanan).

PENGECORAN (BLOCKING/CASTING) Pengecoran adalah proses pembuatan blok parafin (Gambar 5.1.) agar dapat dipotong dengan mikrotom. Agar mudah diiris, jaringan dibentuk dan dikeraskan dengan parafin.

Gambar 5.2. Beragam cetakan blok parafin. Cetakan berbahan logam (kiri) dan plastik (kanan). Alat pencetak dapat berupa besi berbentuk L (Leuckhart), atau cetakan (mold) (Gambar 5.2.). Jika menggunakan besi potongan berbentuk L, maka susunlah 2 buah potongan besi di atas lembaran logam sehingga membentuk ruang kubus. Tuangkan sedikit parafin cair di bagian pinggir agar tidak bocor. Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris. Tuangkan parafin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya. Hindarkan terbentuknya gelembung udara (air bubble). Beri label identitas jaringan saat blocking.19 | dr. Zulham, M. Biomed.

6. Mengiris Blok ParafinSectioning adalah pengirisan blok parafin dengan mikrotom. Ada dua macam mikrotom yaitu mikrotom sledge dan mikrotom rotary (Gambar 6.1.).

Gambar 6.1. Jenis mikrotom: Mikrotom rotary (kiri) dan mikrotom sledge (kanan) PERSIAPAN Pisau Ada dua jenis pisau yaitu microtome knife dan microtome blade (disposable). Yakinkan pisau dalam keadaan tajam. Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu. Blok Parafin Rekatkan blok parafin yang akan dipotong pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel blade yang panas; jika menggunakan tissue cassette, hal ini tidak perlu dilakukan. Blok parafin dipotong lebih dahulu pada bagian atas dengan bentuk seperti di bawah (Gambar 6.2.). Letakkan holder beserta blok parafin pada tempatnya di mikrotom. Waterbath Waterbath diisi dengan akuades dan dinyalakan. Aturlah agar akuades dalam waterbath mencapai suhu titik cair parafin, yakni sekitar 55oC.

parafin jaringan

Gambar 6.2. Bentuk potongan blok parafin Kaca Benda (Object Glass) Untuk merekatkan irisan blok parafin, harus dipersiapkan perekat pada kaca benda. Zat perekat dapat berupa:20 | dr. Zulham, M. Biomed.

1. Albumin (putih telur) Tambahkan 50 ml albumin dengan 50 ml gliserin, lalu diaduk dan ditambahkan sedikit timol. Simpan dalam 4oC (refrigerator). Coated slides dapat dipergunakan segera. 2. Gelatin Campurkan secara hati-hati 2,5 gr gelatin di dalam 100 ml air hangat (50oC) hingga larut selama 30 menit. Biarkan dalam kondisi hangat. Lalu tambahkan 0,25 gr chrom potassium sulphate hingga terlarut sempurna. Tambahkan air sebanyak 400 ml. Angkat dan biarkan mendingin lalu saring dengan kertas saring. Inkubasi object glass dalam 1 menit. Biarkan coated slides mengering selama 24 jam sebelum digunakan. 3. Silane-coated slide o Metoda Handerson untuk membuat slide silane (Aminoalkylsilane (AAS) 2% dalam aseton) 3-aminopropyltriethoxysilane (AAS) (Sigma A-3648) 5 ml Aseton (99,5%) 250 ml Karena aminoalkylsilane bersifat sensitif terhadap kelembaban, simpanlah pada 4oC dalam wadah anhydrous calcium sulphate yang tertutup rapat. Buatlah larutan ini sesaat sebelum digunakan, gunakan hanya sekali, dan setelah selesai larutan dapat dibuang. o Prosedur Celupkan slide dalam larutan AAS 2% 10 detik Bilas dalam deionized water (1000 ml) 5 celup Bilas dalam deionized water (1000 ml) 5 celup Bilas dalam deionized water (1000 ml) 5 celup Biarkan hingga mengering selama semalaman Simpan dalam kotak slide pada suhu kamar o Pastikan kaca yang dipakai benar-benar bersih. Sebelum di-coated, kaca objek dapat dibersihkan dengan dicuci dalam deterjen selama 30 menit lalu dicuci dengan air kran mengalir 30 menit, akuades 2x5 menit, alkohol 95% 2 x 5 menit, lalu dikeringkan selama 10 menit. TEKNIK PENGIRISAN DENGAN ROTARY MICROTOME o Atur ketebalan potongan pada mikrotom: + 5 10 m o Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arah pisau sedekat mungkin; o Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis dan searah jarum jam, sehingga blok preparat menyentuh pisau dan mengiris blok parafin dengan sempurna; o Buang pita-pita parafin awal yang tanpa jaringan; o Setelah irisan mengenai jaringan, iris blok parafin secara hati-hati; o Pita parafin yang mengandung jaringan yang diinginkan lalu dipindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di dalam waterbath yang diatur pada suhu 55oC; o Setelah pita parafin terkembang dengan baik, dengan menggunakan sengkelit tempelkan secara hati-hati pita parafin tersebut ke kaca obyek yang telah disalut (Gambar 6.3.);

21 | dr. Zulham, M. Biomed.

Gambar 6.3. Menempelkan pita parafin pada kaca benda

o Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hot plate dengan suhu 40 45 oC atau incubator dan biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan membiarkan mengering semalaman dalam suhu kamar (Gambar 6.4.);

Gambar 6.4. Mengeringkan pita parafin pada kaca benda

o Simpan kaca objek berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.

22 | dr. Zulham, M. Biomed.

7. Pewarnaan Haematoxyilin dan EosinUntuk menganalisis struktur jaringan yang telah diiris, preparat harus diwarnai. Pewarnaan rutin yang sering dikerjakan adalah haematoxylin-eosin (HE). Hematoxylin akan mewarnai nukleus sedangkan eosin mewarnai sitoplasma. Ada delapan formula larutan pewarnaan haematoxylin. Masing-masing formula pewarnaan memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Yang paling sering digunakan adalah haematoxylin Mayer dan haematoxylin Harris. Formula Haematoxylin Mayer Kristal haematoxylin. 1 gr Akuades 1000 ml Sodium iodate 0,2 gr Ammonium/potassium alum. 50 gr Citric acid. 1 gr Chloralhydrate. 50 gr Cara Pembuatan Hematoxylin Mayer 1. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades. 2. Tambahkan haematoxylin dan campurkan secara baik. 3. Tambahkan sodium iodate, citric acid, dan chloralhydrate. 4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik. 5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya. Formula Eosin Eosin-alkohol Stock 1% Eosin y ws.. 1 gr Distilled water.. 20 ml Larutkan dan tambahkan alkohol 95% .. 80 ml Working Eosin Solution Eosin-alkohol stock 1 bagian Alkohol 80% 3 bagian Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik. Mewarnai Preparat Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit); Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) 95% (2 menit) 90% (2 menit) 80% (2 menit) 70% (2 menit) air kran (3 menit); Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri klorida mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam. Deposit merkuri dapat dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan diinkubasi dalam larutan iodine 0,5% dalam etanol 70% selama 5 10 menit. Irisan dibilas dengan air lalu diinkubasi dalam sodium thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicuci dengan air kran mengalir (Lampiran 1).23 | dr. Zulham, M. Biomed.

Inkubasi dalam larutan haematoxylin Mayer selama beberapa menit;

Gambar 7.1. Mencelup kaca benda pada larutan eosin

Cuci dalam air kran mengalir selama 15-20 menit; Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir selama beberapa menit (Lampiran 2). Bila sudah cukup warnanya, lanjutkan dengan tahap selanjutnya; Counterstaining dengan eosin working solution selama beberapa menit. Lama inkubasi bergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan (Gambar 7.1.); Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70% hingga 100% masing-masing selama 2 menit; Inkubasi dalam xylol 2x2 menit. Tutup (mounting) dengan entellan/balsam Kanada dan cover glass (Gambar 7.2.). Beri label pada sajian tersebut dan biarkan hingga entelan mengering (Gambar 7.3).

Gambar 7.2. Menutup kaca benda dengan cover glass (kiri). Hasil pewarnaan HE pada kulit tebal (kanan).

24 | dr. Zulham, M. Biomed.

Hasil Nukleus berwarna biru. Sitoplasma berwarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu.

Gambar 7.3. Irisan jaringan yang telah diwarnai dan ditutupi dengan cover glass diletakkan di atas slide tray hingga entellan mengering

25 | dr. Zulham, M. Biomed.

8. Lembar Kerja PraktikumKEGIATAN NO. 1. Pemrosesan Jaringan Colon 2. Dehidrasi Aseton I Aseton II Aseton III 3. Clearing Xylol I Xylol II 4. Impregnating 5. Blocking 6. Sectioning 7. Mounting 8. Drying 9. Pewarnaan HE Xylol I Xylol II Alkohol 100% I Alkohol 100% II Alkohol 96% I Alkohol 96% II Alkohol 90% I Alkohol 90% II Alkohol 80% I Alkohol 80% II Alkohol 70% I Alkohol 70% II Air kran/Akuades Haematoxylin Mayer Air kran mengalir Eosin Alkohol 70% I Alkohol 70% II Alkohol 80% I Alkohol 80% II Alkohol 90% I Alkohol 90% II Alkohol 96% I Alkohol 96% II Alkohol 100% I Alkohol 100% II26 | dr. Zulham, M. Biomed.

LAMA

CONTRENG

20 menit 20 menit 20 menit 30 menit 30 menit

2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 2 menit 5 menit 10 menit 2 menit 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup 10 celup

NO. Xylol I Xylol II Merekatkan cover glass

KEGIATAN

LAMA CONTRENG 2 menit 2 menit

27 | dr. Zulham, M. Biomed.

Lampiran 1LUGOLS IODINE Larutan ini digunakan untuk menghilangkan pigmen merkuri dari irisan jaringan yang difiksasi dengan larutan B-5 (dan Zenker), juga digunakan pada pewarnaan Gram dan elastic van Gieson.Bahan: Potassium iodide.. 80 gr Iodine crystals 40 gr Akuades. 4000 ml Larutkan potassium iodide dengan sedikit air, kemudian tambahkan kristal iodine yang akan larut segera. Tambahkan sisa air. Simpan dalam botol berwarna coklat. LARUTAN 5% HYPO-SODIUM THIOSULPHATE Larutan ini digunakan untuk menghilangkan iodine pada saat menangani slide yang dikenai merkuri dan sebagai stop bath untuk pewarnaan perak. Bahan: Sodium thiosulphate. 200 gr Akuades. 4 L Larutkan sodium thiosulphate. Simpan dalam botol.

28 | dr. Zulham, M. Biomed.

Lampiran 2Ada kalanya pewarnaan haematoxylin yang dikerjakan, hasilnya tidak memuaskan. Terlalu biru atau kurang biru. Beberapa larutan dapat digunakan untuk mengatasi hal ini.

ACID RINSE- HE DECOLORIZING Penggunaan larutan ini akan menurunkan intensitas warna biru haematoxylin. Larutan ini digunakan pada pewarnaan regresif.Formula Asam Alkohol 0,25% Alkohol 70% sebanyak 975 ml HCl jenuh. 25 ml

BLUEING SOLUTION (LARUTAN PEMBIRU) Penggunaan larutan ini bertujuan untuk menambah warna biru haematoxyilin, menyertai decoloration, pencucian asam pada pewarnaan regresif.Scotts Tap Water Magnesium sulphate (MgSO4). 30 gr Sodium bicarbonate.. 2 gr Air kran 3000 ml Campur dengan baik. Direkomendasikan untuk Gills III haematoxylin. Lithium Carbonate 0,05% Lithium carbonate.... 0,5 gr Akuades 1000 ml Campurkan dengan baik.

29 | dr. Zulham, M. Biomed.

Lampiran 3MEMBERSIHKAN JAMUR PADA KACA Kadang kala, kaca yang dimiliki sudah cukup lama dan lembab sehingga ditumbuhi jamur. Langkah berikut dapat menghilangkan jamur tersebut. 1. Buatlah 300 ml larutan yang dibuat dengan 2 bagian asam nitrat dan 1 bagian HCl dalam suatu beaker glass di lemari asam. Larutan akan berubah menjadi oranye-merah. 2. Rendam kaca ke dalam larutan. Biarkan selama 2 jam. Guncang sesekali. 3. Tuangkan asam ke botol limbah dengan berhati-hati. 4. Cuci kaca secara menyeluruh dengan air mengalir hingga pH air mencapai 5,5 6. 5. Simpan dalam alkohol 70%. 6. Bakar (flame) kaca di lemari asam sebelum digunakan.

30 | dr. Zulham, M. Biomed.

Referensi1. Animal Ethics Committee of Department of Education and Childrens Services of Government of South Australia. Euthanasia and dissection of animals in schools. 2007. 2. Ahmad Aulia Jusuf. Histoteknik (Bahan Kuliah). Jakarta. 2006. 3. Disbrey, B. D. dan Rack, J. H. Histological laboratory methods. E & S Livings. London. 1970.

31 | dr. Zulham, M. Biomed.

Zulham adalah staf pengajar pada Departemen Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Ia menamatkan pendidikan dokter pada tahun 1999. Di tahun 2008, Ia menamatkan pendidikan Magister Ilmu Biomedik kekhususan Histologi di Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Ia telah membuat buku penuntun praktikum histologi bagi mahasiswa di FK dan FKG USU. Buku ini adalah buku kedua baginya. Selain mengajar, ia menjadi penanggung jawab laboratorium histoteknik. Ia juga aktif menulis artikel kesehatan di surat kabar di Medan dan beberapa tulisan di Majalah Kedokteran Nusantara.

DEPARTEMEN HISTOLOGI FKUSU Web: histologi.usu.ac.id E-mail: [email protected]

Halaman | 32