BORANGNo.DokumenFO-UGM-BI-07-13

Berlaku sejak03 Maret 2008

LAPORAN PRAKTIKUMRevisi00

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGIHalaman

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Kultur jaringan(Tissue culture) adalah membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya. Juga Merupakan metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplas, sel, jaringan dan organ (daun,batang, akar, biji,bunga,buah) dan menumbuhkan dalam kondisi aseptik (Rahardja 1989). Menurut Nugroho dan Sugito (2004) Bagian tanaman yang akan dikulturkan disebut eksplan. Jadi eksplan bisa berupa mata tunas, anthera, batang, daun dan akar yang masih muda dan terdiri dari sel-sel meristematis, yang mana sel-selnya masih aktif membelah-belah dan apabila dikulturkan pada media tumbuh yang sesuai secara in vitro, maka eksplan tersebut akan tumbuh dan berkembang biak menjadi banyak. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman. Media Dasar Murashige Skoog (MS) termasuk media kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap dibandingkan media dasar lainnya,walaupun demikian perlu ditambah suplemen seperti air kelapa untuk mendorong pertumbuhan jaringan. Kisaran indeks keasaman (pH) media adalah 5,5 sampai 5,8. Komposisi dalam media Murashige Skoog meliputi unsur-unsur makro,mikro, vitamin, gula, asama mino dan zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penting untuk differensiasi sel. Menurut Marlina (2004) komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda jenis bahan kimia atau konsentrasinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro. Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsure hara makro, mikro, an vitamin untuk pertumbuhan tanaman

1.2 Permasalahan

Medium MS terdiri dari berbagai macam komponen kimia yang diperlukan untuk pertumbuhan kimia yang diperlukan untuk pertumbuhan tanaman. Komponen yang diperlukan tersebut ada yang dibutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit da nada yang diperlukan dalam jumlah besar. Untuk membuat larutan MS diperlukan tata cara tertentu untuk mendapatkan medium yang baik dan efisien. Oleh karena itu perlu dipelajari tentang tata cara pembuatan medium MS yang baik dan sesuai dengan prosedur yang ada.

1.3 Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari cara pembuatan medium MS sehingga dapat meningkatkan pemahaman dalam mengembangkan protocol pembuatan medium MS yang efisien dan aman.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Medium yang baik digunakan untuk kultur jaringan dapat dinilai dari kualitas fisik zat kimia yang terkandung didalamnya. Beberapa kandungan zat kimia sebagai komponen utama dapat dibagi menjadi empat kategori yaitu : garam mineral, substansi organic, zat pengatur tumbuh, dan senyawa alami kompleks. Medium MS merupakan salah satu jenis medium yang memiliki kandungan senyawa-senyawa tersebut dan sering digunakan dalam berbagai penelitian kultur jaringan tumbuhan karena sering memberikan hasil yang memuaskan. Meskipun tidak selalu memberikan hasil terbaik. Medium MS memiliki banyak macam kandungan garam mineral yang dapat dibuat secara terpisah, sehingga dapat diatur komposisi yang diinginkan sesuai dengan jenis tanaman dan tujuan penelitian. Namun pada kenyataannya, untul menentukan komposisi larutan mineral yang cocok untuk kultur jaringan tumbuhan, beberapa peneliti yang telah melakukan berusaha membuat medium kultur yaitu : Gamborg, Heller, Murashige dan Skoog, Knudson dan White. Medium yang mereka memiliki nama yang sesuai dengan nama penelitinya. (Auge et al, 1995)Kualitas fisik yang suatu medium kultur jaringan tumbuhan ditentukan dari kepadatan medium. Untuk membuat medium yang padat biasanya digunakan agar dalam jumlah tertentu. Konsentrasi agar yang tinggi akan menyebabkan medium yang lebih padat daripada medium dengan konsentrasi lebih rendah. Penambahan konsentrasi agar disesuaikan dengan jenis tanaman dan juga penelitian. Selain itu, kepadatan medium sangat dipengaruhi oleh keadaan pH medium. Bila pH medium terlalu rendah, mka medium yang akan terbentuk lebih cair dan bila pH terlalu basa, maka medium akan keras. Biasanya sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam, berkisar antara 5,5-5,8. (Auge et al, 1995)Media Murashige & Skoog (media MS)Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media : (Suryowinoto,1991)1.Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, danmemodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.2.Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.3.Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.Komposisi dan Fungsi Dasar dalam Media MS : (Sasnawaria, 2005)a. AirAir merupakan komponen yang penting di dalam pengkulturan eksplan karena 95% dari medium mengandung air. Air yang digunakan yaitu air destilasi, dimana air tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang dapat merusak proses perkembangan eksplan.b. Larutan garam anorganikTiap tanaman memerlukan setidaknya 6 elemen mikronutrien N, P, K, Mg, Ca, S, dan elemen yaitu Fe, Mn, B, Mo, Cl. Pereduksi CU2-menjadi Cu-bermanfaat pada perkembangan dan perbaikan vitamin adalah bahan yang perlu ditambahkan sebab tumbuhan yang dikulturkan belum mampu membuat vitamin sendiri, biasanya yang ditambahakan yaitu vitamin B, asam nukleat, pridosin (vitamin B6).c. Zat-zat organicSenyawa organic yang dipakai yaitu karbohidrat yang tersusun atas unsur-unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama karbohidrat mempunyai fungsi utama yaitu sebagai sumber energy untuk keseimbangan tekanan osmotic.Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media : (Sriyanti, 1994)a. Sterilisasi peralatan Sterilisasi peralatan (glassware dan logum) dan aquades dilakukan dengan sterilisasi kering (oven 1300c-1700c selama 2-4 jam). Sterilisasi peralatan dengan autoclave dilakukan pada suhu 1210c takanan 15 PSI selama 1 jam. Sterilisasi peralatan logam (pinset, gunting, jarum) yang digunakan dengan merendam perakitan tsb dalam alcohol 95% diikuti dengan pembakaran dan pendinginan.b. sterilisasi medium kultur Metode autoclaveMedium dalam botol kultur ditutup dengan alumunium foil pada suhu 1210C, tekanan PSI selama 15-40 menit dari waktu medium mencapai suhu yang diperlukan. Metode FiltrasiYaitu sterilisasi menggunakan membrane filter berukuran 0,45-0,22 mm di dalam kontiener steril.Medium MS yang banyak mengandung senyawa-senyawa organic akan sangat mudah ditumbuhi berbagai macam mikroorganisme kontaminan seperti jamur dan bakteri. Oleh karena itu, dalam pembuatan medium ini diperlukan proses sterilisasi dan cara penyimpanan yang dapat mencegah dan meminimalisasikan kontaminan tersebut. Untuk itu sterilisasi medium biasanya digunakan aotuclave dengan suhu 121C dengan tekanan 15psi (1 atm) selama 15 menit (Lestari, 2008)

III. METODE3.1 Alat dan BahanAlat dan bahan yang digunakan yang digunakan yaitu tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS, universal indikator pH, HCl 1N, dan atau KOH 1N, Alumunium foil, kertas timbang, tissue, dan tabel, Erlenmeyer 100ml dan 50ml, gelas piala 600ml, gelas ukur 1000ml, Erlenmeyer 1000ml, botol ukur, pipet, pengaduk, magnetic stirrer dengan hot plate dan magnet, timbangan analitik, dan autoclave.3.2 Cara kerjaPembuatan medium MS padat sebanyak 1 Liter.Disiapkan Erlenmeyer 1000ml yang berisi 500ml akuades. Ditimbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan tabel) dan bahan dimasukkan satu persatu sambil diaduk. Untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu dengan magnetic stirrer. Kemudian dimasukkan 5ml stok besi, masukkan 1ml stok makronutrien, masukkan 4ml larutan stok vitamin. Ditimbang 100mg Myo-inositol dan dimasukkan dalam Erlenmeyer sambil dilarutkan. Ditimbang 30mg sukrosa, dimasukkan dalam Erlenmeyer dan dilarutkan. Setelah itu ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000ml. pH diukur hingga berada pada 5,6-6,3 dengan penambahan HCL atau KOH. Ditimbang agar-agar sebanyak 8gr, dimasukkan dalam Erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk hingga larut. Dalam keadaan masih cair, medium tersebut dibagi kedalam botol-botol sekitar 20ml/botol. Selanjutnya botol ditutup rapat dengan alumunium foil dan diberi label sesuai perlakuan. Botol dimasukkan kedalam autoclave dan disterilisasi dengan suhu 121C selama 15 menit dengan tekana 15 psi (1 atm). Setelah tekanan turun sampai 0 atm, medium yang sudah steril segera dikeluarkan dari autoclave. Jangan menunggu hingga medium dingin dalam autoclave, karena pemanasan yang berlebih akan merusak medium.

DAFTAR PUSTAKAAuge, R., G.Beaischesne., J. Boccon-Gibbon., L. Decourte., B. Digat., R. Jalouzot., R. Minier., J-Cl. Morand., J.P. Reynoird., D.G. Strullu., and H. Vidalie. 1995. In vitro culture and its application in holtikulture. Science Publishers,Inc. New Hampshire.Lestari, E.G. 2008. Kultur jaringan. Penerbit Akademia. Bogor. Sasnawaria, 2005. Mikrobiologi dasar. Papa sinar sinantris. Jakarta.Sriyanti, Daisy P. 1994.Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.Suryowinoto, M. 1991.Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.