Panduan Praktikum Fitokimia
-
Upload
imas-laili-lestari -
Category
Documents
-
view
353 -
download
58
description
Transcript of Panduan Praktikum Fitokimia
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA
SEMESTER 4
Ferry Ferdiansyah Sofian
Ami Tjitraresmi
Yasmiwar Susilawati
Dudi Runadi
Disusun oleh :
LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN i
KATA PENGANTAR
Praktikum analisis fitokimia merupakan bagian dari paket materi
kuliah fitokimia yang diberikan kepada mahasiswa agar mahasiswa
mengetahui cara-cara analisis komponen kimia dalam tumbuhan,
khususnya tumbuhan obat. Materi praktikum disusun sedemikian rupa
sehingga dapat menunjang serta sekaligus memberikan gambaran yang
lebih jelas mengenai materi yang diberikan pada perkuliahan. Melalui
praktikum yang terarah diharapkan dapat meningkatkan motivasi dan
merangsang inovasi baru dari mahasiswa dalam teknis praktis.
Buku panduan praktikum analisis fitokimia ini diupayakan dapat
memberi gambaran mengenai tahapan analisis fitokimia yang biasa
dilakukan oleh para peneliti bahan alam, dimulai dengan tahapan
pengenalan metabolit sekunder dalam tanaman obat melalui penapisan
fitokimia, metode ekstraksi untuk memisahkan sebagian besar komponen
kimia, metode pemisahan metabolit sekunder dengan teknik
kromatografi, serta metode pemurniannya, sehingga diperoleh komponen
tunggal/isolat. Selain itu, juga dipelajari mengenai isolasi minyak atsiri
dengan metode destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan.
Teknik yang diberikan dalam buku panduan ini merupakan teknik
dasar namun dapat diterapkan di laboratorium dan cukup terandalkan.
Harapan kami semoga buku Panduan Praktikum Analisis Fitokimia
ini dapat dimanfaatkan sebaik-baiknya untuk proses pembelajaran di
Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, khususnya dalam mata kuliah
Fitokimia.
Jatinangor, Februari 2015
Penyusun
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN ii
DAFTAR ISI
Halaman KATA PENGANTAR ............................................................ i
DAFTAR ISI ..................................................................... ii
PENDAHULUAN ............................................................... 1
Bahan Praktikum ............................................................... 2
Pembagian Tugas Grup Praktikum ........................................ 3
Jadwal Praktikum ............................................................... 8
Modul Praktikum 1 ........................................................... 9
Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat ....................... 9
Lembar kerja 1 ................................................................... 17
Modul Praktikum 2 ........................................................... 20
Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia Tumbuhan Obat ... 20
Lembar kerja 2 ................................................................... 27
Modul Praktikum 3 ........................................................... 30
Metode Pemisahan Ekstrak ................................................... 30
Lembar kerja 3A ................................................................. 36
Lembar kerja 3B ................................................................. 38
Modul Praktikum 4 .......................................................... 41
Metode Pemurnian Fraksi .................................................... 41
Lembar kerja 4A ................................................................ 48
Lembar kerja 4B ................................................................ 50
Modul Praktikum 5 .......................................................... 52
Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri .............................. 52
Lembar kerja 5 .................................................................. 56
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 1
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
PENDAHULUAN
Fitokimia ialah suatu ilmu yang terletak antara kimia organik bahan
alam dan biokimia tumbuhan. Bidang yang menjadi perhatiannya adalah
aneka ragam senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh
tumbuhan, meliputi struktur kimianya, biosintesisnya, perubahan dan
metabolismenya, penyebarannya secara alamiah, serta fungsi biologinya.
Untuk melakukan analisis fitokimia diperlukan pengetahuan
mengenai metode pemisahan, pemurnian, dan identifikasi kandungan
kimia dalam tumbuhan. Pemanfaatan teknik analisis fitokimia yang sudah
dikenal secara umum dan inovasinya terhadap teknik tersebut
diharapkan mampu menangani masalah-masalah yang timbul dalam
analisis fitokimia yang terjadi di kemudian hari.
Buku ini berupa panduan praktikum analisis fitokimia bagi
mahasiswa, terdiri dari beberapa topik, dimulai dengan penapisan
fitokimia, ekstraksi, fraksinasi, pemurnian/isolasi, serta isolasi minyak
atsiri dengan destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan.
Metode penapisan fitokimia merupakan praktikum paling mendasar
yang bertujuan untuk mengetahui golongan metabolit yang terkandung
dalam simplisia dan merupakan panduan untuk melakukan ekstraksi,
pemisahan, dan identifikasi isolatnya.
Ekstraksi dapat dilakukan dengan beberapa metode yaitu ekstraksi
dengan menggunakan pelarut atau tidak menggunakan pelarut organik;
dengan penambahan suhu (cara panas) atau pada suhu kamar (cara
dingin); atau dengan beberapa metode ekstraksi lainnya. Pemilihan
metode ekstraksi tergantung pada sifat kimia dari kandungan tumbuhan
tersebut. Ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi mengandung
berbagai macam metabolit primer dan sekunder. Untuk pemisahan
metabolit dalam ekstrak tersebut, dapat digunakan beberapa cara
metode fraksinasi seperti ekstraksi cair-cair (ECC) dan kromatografi
dipercepat (Fast Chromatography).
Metode pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memperoleh suatu
isolat/komponen yang terdapat dalam fraksi. Pemurnian dapat dilakukan
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 2
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
dengan satu atau gabungan beberapa teknik kromatografi, seperti
kromatografi datar dan metode kromatografi kolom.
Topik lain membahas metode penetapan kadar minyak atsiri
menggunakan metode destilasi dengan alat destilasi Stahl. Metode
penetapan kadar minyak atsiri menggunakan alat destilasi Stahl ini
merupakan metode yang paling sederhana tetapi mempunyai ketepatan
dan ketelitian yang dapat diandalkan, sehingga metode ini dapat
dikatakan menjadi metode baku bagi penetapan kadar minyak atsiri
dalam suatu simplisia. Selain itu, dilakukan isolasi minyak atsiri
menggunakan destilasi air, serta destlasi uap dan air untuk jumlah
simplisia yang lebih banyak dari bagian tanaman. Selain itu, isolasi
minyak atsiri pun dapat dilakukan metode enfleurasi untuk simplisia dari
bagian bunga tanaman, serta metode ekstraksi hasil pemerasan dari
bagian kulit buah tanaman.
BAHAN PRAKTIKUM
a. PENAPISAN FITOKIMIA (MODUL 1)
Grup I
1. Morindae citrifoliae fructus
2. Chinae cortex
Grup II
1. Retrofracti fructus
2. Coffeae semen
Grup III
1. Andrographidis herba
2. Guazumae folium
Grup IV
1. Curcumae domesticae rhizoma
2. Rhei radix
Catatan : Jumlah simplisia yang digunakan 10 gram.
b. ISOLASI (MODUL 2 S/D MODUL 4)
1. Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu) ; 250 gram
2. Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa) ; 250 gram
3. Andrographidis herba (Herba Sambiloto) ; 250 gram
4. Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit) ; 250 gram
Catatan : untuk metode Refluks dan Soxhlet, jumlah simplisia yang
digunakan sebanyak 100 gram.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 3
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
c. ISOLASI DAN PENETAPAN KADAR MINYAK ATSIRI
(MODUL 5)
1. Caryophylli flos (200 g), menggunakan destilasi uap dan air.
2. Jasmini Flos (100 g), menggunakan metode enfleurasi.
3. Canangae odoratae Flos (100 g), menggunakan metode
enfleurasi.
4. Zingiberis Rhizoma (100 g/500 g), menggunakan destilasi air
atau destilasi uap dan air.
5. Citri aurantifoliae Percarpium (500 g), menggunakan metode
pemerasan dan ekstraksi.
6. Melaleucae leucadendrae Folium (100 g/500 g), menggunakan
metode destilasi air atau destilasi uap dan air.
PEMBAGIAN TUGAS GRUP PRAKTIKUM
Satu kelompok praktikum dibagi dalam 4 grup dengan pembagian
tugas sebagai berikut :
KELOMPOK 1 : SENIN (13.00-16.00)
a. ISOLASI SENYAWA
GRUP BAHAN METODE
EKSTRAKSI
METODE
FRAKSI-NASI
METODE
ISOLASI
TARGET ISOLASI
SENYAWA
I
Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)
Maserasi (etanol 70%)
KCV K.Kolom Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)
II
Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
ECC K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)
III
Andrographidis herba (Herba Sambiloto)
Maserasi (etanol 95%)
ECC KLT Preparatif
Terpenoid (misal : andrografolid)
IV
Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)
Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)
KCV KLT Preparatif
Curcuminoid (misal : curcumin)
b. ISOLASI MINYAK ATSIRI
GRUP BAHAN METODE ISOLASI
I Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi uap dan air
II Jasmini Flos (Bunga Melati) Enfleurasi
III Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi air
IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 4
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
KELOMPOK 2 : SELASA (10.00-13.00)
a. ISOLASI SENYAWA
GRUP BAHAN METODE
EKSTRAKSI
METODE FRAKSI-
NASI
METODE ISOLASI
TARGET ISOLASI SENYAWA
I
Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
KCV KLT Preparatif
Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)
II
Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)
Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)
KCV K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)
III
Andrographidis herba (Herba Sambiloto)
Maserasi (etanol 95%)
ECC KLT Preparatif
Terpenoid (misal : andrografolid)
IV
Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
ECC K.Kolom Curcuminoid (misal : curcumin)
b. ISOLASI MINYAK ATSIRI
GRUP BAHAN METODE ISOLASI
I Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi uap dan air
II Canangae odoratae Flos (Bunga Kenanga) Enfleurasi
III Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi air
IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi
KELOMPOK 3 : RABU (10.00-13.00)
a. ISOLASI SENYAWA
GRUP BAHAN METODE
EKSTRAKSI
METODE FRAKSI-
NASI
METODE
ISOLASI
TARGET ISOLASI
SENYAWA
I
Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)
Maserasi (etanol 70%)
ECC KLT Preparatif
Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)
II
Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)
Maserasi (etanol 95%)
KCV KLT Preparatif
Alkaloid (misal : piperin)
III
Andrographidis herba (Herba Sambiloto)
Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)
KCV K.Kolom Terpenoid (misal : andrografolid)
IV
Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
ECC K.Kolom Curcuminoid (misal : curcumin)
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 5
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
b. ISOLASI MINYAK ATSIRI
GRUP BAHAN METODE ISOLASI
I Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi uap dan air
II Jasmini Flos (Bunga Melati) Enfleurasi
III Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi air
IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi
KELOMPOK 4 : RABU (13.00-16.00)
a. ISOLASI SENYAWA
GRUP BAHAN METODE
EKSTRAKSI
METODE
FRAKSI-NASI
METODE ISOLASI
TARGET ISOLASI SENYAWA
I
Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)
Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)
KCV KLT Preparatif
Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)
II
Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)
Maserasi (etanol 95%)
ECC K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)
III
Andrographidis herba (Herba Sambiloto)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
KCV K.Kolom Terpenoid (misal : andrografolid)
IV
Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)
Maserasi (etanol 95%)
ECC KLT Preparatif
Curcuminoid (misal : curcumin)
b. ISOLASI MINYAK ATSIRI
GRUP BAHAN METODE ISOLASI
I Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi uap dan air
II Canangae odoratae Flos (Bunga Kenanga) Enfleurasi
III Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi air
IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 6
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
KELOMPOK 5 : KAMIS (10.00-13.00)
a. ISOLASI SENYAWA
GRUP BAHAN METODE
EKSTRAKSI
METODE FRAKSI-
NASI
METODE ISOLASI
TARGET ISOLASI SENYAWA
I
Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
KCV K.Kolom Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)
II
Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)
Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)
KCV KLT Preparatif
Alkaloid (misal : piperin)
III
Andrographidis herba (Herba Sambiloto)
Maserasi (etanol 95%)
ECC KLT Preparatif
Terpenoid (misal : andrografolid)
IV
Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)
Maserasi (etanol 95%)
ECC K.Kolom Curcuminoid (misal : curcumin)
b. ISOLASI MINYAK ATSIRI
GRUP BAHAN METODE ISOLASI
I Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi uap dan air
II Jasmini Flos (Bunga Melati) Enfleurasi
III Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi air
IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi
KELOMPOK 6 : JUMAT (07.00-10.00)
a. ISOLASI SENYAWA
GRUP BAHAN METODE
EKSTRAKSI
METODE
FRAKSI-NASI
METODE
ISOLASI
TARGET ISOLASI
SENYAWA
I
Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)
Maserasi (etanol 70%)
ECC K.Kolom Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)
II
Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)
Dengan Alat Refluks (etanol 95%)
KCV K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)
III
Andrographidis herba (Herba Sambiloto)
Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)
KCV KLT Preparatif
Terpenoid (misal : andrografolid)
IV
Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)
Maserasi (etanol 95%)
ECC KLT Preparatif
Curcuminoid (misal : curcumin)
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 7
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
b. ISOLASI MINYAK ATSIRI
GRUP BAHAN METODE ISOLASI
I Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi uap dan air
II Canangae odoratae Flos (Bunga Kenanga) Enfleurasi
III Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi air
IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 8
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN
JADWAL PRAKTIKUM
Semua grup melakukan Modul Praktikum 1 (Penapisan fitokimia)
sampai Modul Praktikum 5 (isolasi minyak atsiri) yang dikerjakan sesuai
dengan jadwal praktikum berikut ini :
Pertemuan
ke- KEGIATAN
1 Responsi : Teori Metode Pemisahan Senyawa Bahan Alam
2 a. Presentasi metode isolasi sampel.Persiapan alat, bahan, dan responsi studi literatur metode isolasi
b. Ekstraksi (2 Kelompok awal)
3 a. Diskusi : Metode Isolasi Sampel
b. Ekstraksi (2 Kelompok akhir)
c. Pemekatan Ekstraksi (2 Kelompok awal)
4 a. Penapisan Fitokimia (masing-masing kelompok 2 sampel)
b. Pemekatan Ekstraksi (2 Kelompok akhir)
c. Pemeriksaan Kadar Air (2 Kelompok awal)
5 Evaluasi mutu ekstrak :
a. Perhitungan Rendemen Ekstrak
b. Perhitungan Bobot Jenis Ekstrak
c. Pemeriksaan Kadar Air (2 Kelompok akhir)
d. Pemantauan KLT, dan
e. Pemantauan Pola Dinamolisis
6 Fraksinasi : ECC dan KCV
7 a. Fraksinasi Lanjutan : ECC dan KCV
b. KLT fraksi dan penetapan senyawa identitas
c. Isolasi Minyak atsiri dengan Destilasi Stahl
8 a. Persiapan isolasi senyawa identitas, penetapan eluen KK dan pengembang KLT preparatif
b. KLT minyak atsiri
9 Isolasi senyawa identitas dengan KK atau KLT preparatif dari ekstrak dan minyak atsiri
10 a. KLT isolat
b. Uji kemurnian isolat dengan KLT dua dimensi
11 a. KLT isolat (Lanjutan)
b. Uji kemurnian isolat dengan KLT dua dimensi (Lanjutan)
c. Perhitungan rendemen isolat
12 Presentasi Akhir (2 kelompok)
13 Presentasi Akhir (2 kelompok)
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 9
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
MODUL PRAKTIKUM 1
Penapisan Fitokimia
Simplisia Tumbuhan Obat
TUJUAN PERCOBAAN
Melakukan pengujian penapisan fitokimia terhadap beberapa
simplisia tumbuhan obat sehingga diketahui golongan metabolit sekunder
yang terkandung dalam simplisia tersebut.
TUJUAN INSTRUKSIONAL
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa mampu menganalisis
kandungan metabolit sekunder suatu simplisia tumbuhan obat atas dasar
hasil pengujian penapisan fitokimia.
TEORI
Tumbuhan obat adalah tumbuhan atau bagian-bagiannya yang
digunakan baik untuk pencegahan ataupun pengobatan penyakit-
penyakit tertentu, atas dasar pengggunaan secara empirik ataupun
pengujian ilmiah. Pengujian khasiat suatu tanaman obat dilakukan
melalui uji pra klinik hingga uji klinik.
Pengembangan obat tradisional di Indonesia semakin menunjukkan
kemajuan yang mengarah kepada upaya memasuki jalur pelayanan
kesehatan formal. Obat tradisional yang akan memasuki jalur pelayanan
kesehatan formal dituntut mempunyai kualitas yang memenuhi standar
yang telah ditetapkan. Evaluasi kualitas ini diperlukan untuk
mendapatkan obat tradisional yang memenuhi persyaratan, memiliki
khasiat, dan aman digunakan.
Khasiat atau aktivitas farmakologi yang menjadi tumpuan bagi
penggunaan suatu tumbuhan sebagai tumbuhan obat ditentukan oleh
kandungan senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan atau bagian
tumbuhan tersebut. Kandungan senyawa metabolit sekunder yang
mempunyai arti penting dalam kaitan dengan khasiat atau aktivitas
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 10
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
farmakologi tumbuhan obat adalah senyawa metabolit sekunder
kelompok alkaloid, tanin dan polifenolat, mono dan sesquiterpen,
senyawa kuinon, glikosida jantung, flavonoid, triterpenoid dan steroid,
serta saponin.
Uji fitokimia terhadap kandungan senyawa kimia metabolit sekunder
merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai
tumbuhan obat atau dalam hal penelusuran senyawa aktif baru yang
berasal dari bahan alam yang dapat menjadi prekursor bagi sintesis obat-
obat baru atau menjadi prototype senyawa obat dengan aktivitas
tertentu. Oleh karenanya, metode uji fitokimia harus merupakan uji
sederhana tetapi terandalkan. Metode uji fitokimia yang banyak
digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan yang dapat
dilakukan di lapangan atau di laboratorium.
METODE EVALUASI FITOKIMIA
Metode evaluasi fitokimia meliputi penapisan fitokimia dan
pencarian senyawa identitas melalui analisis kromatografi.
1. PENAPISAN FITOKIMIA
a. Alkaloid
Alkaloid adalah senyawa metabolit sekunder yang dalam
struktur molekulnya terdapat atom Nitrogen (umumnya heterosiklik).
Adanya pasangan elektron bebas pada atom Nitrogen ini
menyebabkan alkaloid dapat membentuk kompleks yang tidak larut
dengan logam-logam berat. Fenomena ini merupakan dasar bagi
reaksi pengenalan adanya alkaloid dalam simplisia tumbuhan obat.
Alkaloid adalah kelompok atau golongan senyawa kimia
metabolit sekunder asal tumbuhan atau hewan dengan struktur yang
mempunyai atom Nitrogen (umumnya terikat dalam lingkar
heterosiklik), bersifat basa, serta mempunyai aktivitas fisiologis
tertentu.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 11
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
Berdasarkan biosintesisnya, alkaloid terbagi atas:
(1) True alkaloid (alkaloid sesungguhnya), biosintesisnya berasal
dari asam amino, bersifat basa, umumnya mempunyai atom
Nitrogen dalam lingkar heterosiklik
(2) Proto alkaloid, merupakan amina yang bersifat sederhana
dengan atom Nitrogen yang tidak terdapat dalam lingkar
heterosiklik. Contoh meskalin, efedrin
(3) Pseudo alkaloid, biosintesisnya tidak berasal dari asam amino.
Contohnya basa purin (antara lain kafein)
Umumnya alkaloid bersifat basa karena adanya pasangan
elektron bebas pada atom Nitrogennya (Teori Asam-Basa Lewis).
Dalam tumbuhan biasanya alkaloid terdapat dalam bentuk garam
(tartrat, laktat, sitrat). Sifat kimia alkaloid ini merupakan dasar bagi
cara isolasi maupun pengenalannya. Pengenalan alkaloid didasarkan
pada kemampuannya membentuk senyawa kompleks tidak larut
dengan pereaksi-pereaksi yang mengandung logam berat, misalnya
pereaksi Mayer (mengandung kalium ioda dan raksa (II) klorida),
pereaksi Dragendorff (mengandung Bismuth subnitrat dan raksa (II)
klorida). Alkaloid dengan pereaksi Mayer akan memberikan endapan
putih, sedangkan pereaksi Dragendorff akan memberikan endapan
jingga coklat. Walaupun reaksi pengenalan alkaloid dengan kedua
pereaksi tersebut merupakan reaksi pengenalan umum tetapi
beberapa senyawa non alkaloid dapat mengendap dengan pereaksi-
pereaksi tersebut di atas, misalnya protein, kumarin, -piron,
hidroksi flavon serta tannin. Reaksi pengenalan palsu tersebut
terkenal dengan sebutan reaksi positif palsu (false positive). Perlu
menjadi perhatian, selain adanya reaksi positif palsu, dengan metode
ini senyawa alkaloid kuarterner dalam simplisia tidak dapat diubah
menjadi alkaloid bentuk basa dan akan tetap tinggal dalam sel,
sehingga tidak dapat dikenali dengan metode pengendapan oleh
reaksi-reaksi tersebut di atas. Keadaan seperti itu disebut sebagai
reaksi negatif palsu (false negative).
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 12
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
Metode:
Simplisia dibasakan dengan ammonia encer, digerus dalam
mortir, kemudian ditambahkan beberapa milliliter kloroform sambil
terus digerus. Setelah disaring, filtrat dikocok dengan asam klorida 2
N. Lapisan asam dipisahkan kemudian dibagi menjadi tiga bagian dan
diperlakukan sebagai berikut :
(1) Bagian pertama digunakan sebagai blangko
(2) Bagian kedua ditetesi dengan larutan pereaksi Mayer, kemudian
diamati ada atau tidaknya endapan berwarna putih
(3) Bagian ketiga ditetesi dengan larutan pereaksi Dragendorff,
kemudian diamati ada atau tidaknya endapan jingga coklat
b. Flavonoid
Flavonoid adalah senyawa metabolit sekunder yang memberikan
berbagai warna pada tumbuhan. Flavonoid mempunyai struktur yang
sangat bervariasi, namun pada umumnya mempunyai struktur dasar:
Gambar. Struktur dasar Flavonoid
Pengenalan flavonoid didasarkan pada reaksi reduksi gugusan
karbonil pada lingkar -lakton menjadi gugusan alkohol membentuk senyawa hidroksi yang berwarna-warna tergantung pada gugusan
fungsional yang terikat pada lingkar A atau B. warna yang terjadi
dapat ditarik oleh amil alkohol.
Metode:
Senyawa dipanaskan dengan campuran logam Magnesium dan
asam klorida 5N, kemudian disaring. Adanya flavonoid akan
menyebabkan filtrat berwarna merah yang dapat ditarik oleh amil
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 13
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
alkohol. Untuk lebih memudahkan pengamatan sebaiknya digunakan
percobaan blangko.
c. Tanin dan Polifenol
Tanin dan senyawa polifenolat alam mudah dikenali melalui
pengenalan gugusan fenol yang dapat memberikan warna biru-hitam
dengan pereaksi besi (III) klorida. Untuk membedakan tanin dengan
polifenolat alam, digunakan sifat tanin yang dapat mengendapkan
larutan gelatin 1%.
Metode:
Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air di atas tangas air,
kemudian disaring panas-panas. Sebagian kecil filtrat ditetesi larutan
besi (III) klorida. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan
adanya tanin dan polifenol alam. Sebagian kecil filtrat diuji ulang
dengan penambahan larutan gelatin 1%. Adanya endapan putih
menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat tanin.
d. Saponin
Saponin adalah senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan
yang bersifat dapat membentuk busa, serta dapat menghemolisis sel
darah merah. Struktur kimia umumnya merupakan glikosida, yang
bila dihidrolisis akan menghasilkan bagian glikon (senyawa gula) dan
aglikon (senyawa non gula). Struktur aglikon tannin umumnya
merupakan struktur triterpenoid dan struktur steroid, hingga ditinjau
dari strukturnya saponin dapat dipilah menjadi saponin-triterpenoid
dan saponin-steroid. Reaksi pengenalan saponin didasarkan pada
sifatnya yang mampu memberikan busa pada pengocokan dan
persisten pada penambahan sedikit asam atau pada pendiaman.
Metode:
Di atas tangas air, dalam tabung reaksi, simplisia dicampur
dengan air dan dipanaskan beberapa saat, kemudian disaring.
Setelah dingin filtrat dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selama
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 14
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
lebih kurang 30 detik. Pembentukan busa sekurang-kurangnya
setinggi 1 cm dan persisten selama beberapa menit serta tidak hilang
setelah penambahan 1 tetes asam klorida encer menunjukkan bahwa
dalam simplisia terdapat saponin.
e. Monoterpenoid dan Sesquiterpenoid
Monoterpenoid dan sesquiterpenoid adalah senyawa-senyawa
C10-C15 yang tersusun dari unit isoprene (C5H8). Senyawa
monoterpenoid dan sesquiterpenoid ini merupakan komponen-
komponen penyusun minyak atsiri. Reaksi pengenalan didasarkan
pada kemampuannya membentuk warna-warna dengan pereaksi
anisaldehid-asam sulfat atau pereaksi vanillin-sulfat.
Metode:
Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga
kering. Pada residu diteteskan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau
pereaksi vanillin-sulfat dari pinggir cawan. Terbentuknya warna-
warna menunjukkan adanya senyawa monoterpenoid dan
sesquiterpenoid.
f. Steroid dan Triterpenoid
Senyawa kelompok steroid dan triterpenoid adalah senyawa-
senyawa kelompok metabolit sekunder yang mempunyai struktur
dasar yang hampir sama.
(a) (b)
Gambar. (a) Steroid, (b) Triterpenoid
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 15
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
Pengenalan senyawa triterpenoid dan steroid didasarkan
kemampuannya membentuk warna dengan pereaksi Liebermann-
Burchard.
Pereaksi Liebermann-Burchard dibuat dengan cara mencampurkan 20
bagian asam asetat anhidrat dengan 1 bagian asam sulfat pekat.
Pereaksi ini harus digunakan dalam media bebas air.
Metode:
Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga
kering. Pada residu diteteskan pereaksi Liebermann-Burchard.
Terbentuknya warna ungu menunjukkan bahwa dalam simplisia
mengandung senyawa kelompok triterpenoid, sedangkan bila
terbentuk warna biru-hijau menunjukkan adanya senyawa kelompok
steroid.
g. Senyawa Kuinon
Senyawa kuinon umumnya merupakan turunan p-benzokuinon.
Gambar. p-benzokuinon
Pengenalan senyawa ini didasarkan pada kemampuannya
membentuk garam berwarna antara hidrokuinon dengan larutan
alkali kuat (NaOH atau KOH).
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 16
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
Gambar. Reaksi hidrokuinon dengan larutan alkali kuat
Metode:
Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air, kemudian disaring.
Filtrat ditetesi dengan larutan NaOH. Terbentuknya warna kuning
hingga merah menunjukkan adanya senyawa kelompok kuinon.
PUSTAKA
Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening Of Plants.J. Pharm. Sci. 55(3): 243-269
Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia. Terjemahan K. Padmawinata
dan I. Sudiro.: Penerbit ITB. Bandung Marini, C.P. 1981. Plant Screening By Chemical And Chromatography
Prosedure in the Field Condition. J. Chromatogr. 213:117-122
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 17
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
LEMBAR KERJA 1 PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN
PRAKTIKUM 1 : Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat
NAMA MAHASISWA : .............................................................
NPM : .............................................................
KELOMPOK : .............................................................
NAMA TANAMAN : .............................................................
NAMA SIMPLISIA : .............................................................
METODE DAN HASIL :
No Golongan Senyawa
Prosedur Hasil (+/-)
Paraf Asisten
1 ALKALOID 1. 1 gram serbuk simplisia dibasakan dengan 10 mL amonia 10%, digerus menggunakan mortar.
2. Tambahkan 5 mL kloroform, gerus kuat.
3. Lapisan kloroform dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas, masukkan ke dalam tabung reaksi.
4. Tambahkan kedalamnya HCl 2N (1:10 v/v). Kocok kuat hingga terbentuk 2 lapisan.
5. Lapisan asam dipipet,kemudian dibagi menjadi 3 bagian : a. Filtrat 1 :
ditambahkan pereaksi Mayer, terjadinya kekeruhan atau endapan
putih menunjukkan adanya alkaloid.
b. Filtrat 2 : ditambahkan pereaksi Dragendorff, terjadinya endapan jingga coklat menunjukkan adanya alkaloid.
c. Filtrat 3 : digunakan sebagai blanko.
2 SENYAWA
POLIFENOLAT
1. 50 mg serbuk simplisia dalam tabung reaksi dididihkandalam 50 mL air selama 15 menit,
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 18
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
No Golongan
Senyawa Prosedur
Hasil
(+/-)
Paraf
Asisten
kemudian didinginkan dan disaring (Filtrat A).
2. Kedalam filtrat ditambahkan larutan pereaksi FeCl3 1%. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan adanya senyawa polifenolat.
3 TANIN 3. Kedalam Filtrat A ditambahkan larutan gelatin 1%, terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya tanin.
4 FLAVONOID 1. 1 gram serbuk simplisia ditambahkan 50 mL air panas, dididihkan selama 5 menit, lalu disaring.
2. Filtrat yang dihasilkan ditambahkan sedikit serbuk Mg dan 5 mL HCl 2N.
3. Kemudian tambahkan amillalkohol, lalu dikocok kuat-kuat dan dibiarkan hingga memisah. Terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik
dengan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
5 MONO-
TERPENOID DAN
SESQUI-
TERPENOID
1. 1 gram simplisia digerus dengan 5 mL eter, kemudian dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas (Filtrat B).
2. Filtrat ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering.
3. Ke dalam residu diteteskan larutan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat melalui pinggir cawan, terbentuknya warna-warna menunjukkan adanya mono dan sesquiterpenoid.
6 STEROID DAN
TRITERPENOID
4. Filtrat B ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 19
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1
No Golongan
Senyawa Prosedur
Hasil
(+/-)
Paraf
Asisten
5. Ke dalam residu diteteskan 2 hingga 3 tetes pereaksi Liebermann Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya golongan triterpenoid, sedangkan terbentuknya warna biru hijau
menunjukkan adanya golongan steroid.
7 KUINON 6. Kedalam Filtrat A ditambahkan larutan KOH 5% terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya golongan kuinon
8 SAPONIN 7. Sejumlah 10 ml Filtrat A, dikocok vertikal dalam tabung reaksi selama 10 detik.
8. Terbentuknya busa yang persisten pada penambahan asam klorida atau pada pendiaman selama lebih kurang 10 menit, menunjukkan adanya golongan saponin.
KESIMPULAN :
Dalam simplisia yang diperiksa, diperkirakan terdapat senyawa
metabolit sekunder golongan:
1. ................................................................................
2. ................................................................................
3. ................................................................................
4. ................................................................................
5. ................................................................................
6. ................................................................................
Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan
Hari/Tanggal :
( )
Hari/Tanggal :
( )
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 20
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
MODUL PRAKTIKUM 2
Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia
Tumbuhan Obat
TUJUAN PERCOBAAN
Melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan
obat dengan beberapa metode ekstraksi.
TUJUAN INSTRUKSIONAL
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan
mampu melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan
obat dengan cara sederhana namun terandalkan.
TEORI
Pada analisis fitokimia tumbuhan obat idealnya digunakan bahan
baku segar yang dididihkan dengan alkohol selama beberapa menit
segera setelah dikumpulkan. Hal ini dimaksudkan untuk menonaktifkan
enzim, supaya tidak terjadi reaksi enzimatis selama percobaan dilakukan.
Kadang-kadang tumbuhan yang akan diteliti tidak dapat diperoleh dengan
segera dan bahkan mungkin kolektornya tinggal di daerah atau benua
lain, sehingga bahan baku dikeringkan terlebih dahulu sebelum dilakukan
ekstraksi. Pengeringan ini harus dilakukan dengan hati-hati dan dijaga
jangan sampai terjadi perubahan kimia. Oleh karena itu, tumbuhan
sesegera mungkin dikeringkan diudara terbuka tanpa menggunakan
panas tinggi. Setelah kering, bahan bisa disimpan lama sebelum dilakukan
ekstraksi.
Ekstraksi merupakan tahap awal pada jalur isolasi metabolit
sekunder dari tumbuhan obat. Ekstraksi dapat dibagi menjadi beberapa
golongan tergantung dari beberapa keadaan yang menyertainya.
Ditinjau dari suhu, ekstraksi dibagi menjadi dua golongan, yaitu
ekstraksi dingin dan ekstraksi panas. Ekstraksi dingin misalnya maserasi
dan perkolasi. Ekstraksi dingin dilakukan terhadap bahan tumbuhan yang
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 21
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
mengandung senyawa yang bersifat termolabil. Metode ini memerlukan
waktu yang relatif lebih lama bila dibandingkan dengan ekstraksi panas.
Ekstraksi panas misalnya dengan cara infus, dekok, refluks, dan
menggunakan alat soxhlet.
Ditinjau dari banyaknya ulangan proses, ekstraksi dibagi menjadi
dua golongan pula, yaitu ekstraksi satu kali, misalnya maserasi dan
ekstraksi berulang kali, misalnya dengan alat soxhlet. Dalam hal ini
efektivitas proses ekstraksi akan ditentukan oleh banyaknya pengulangan
proses ekstraksi. Ekstraksi berulang akan lebih efektif dibanding dengan
ekstraksi satu kali, sesuai dengan perumusan sebagai berikut :
Wn = Jumlah zat yang belum terekstraksi Wo = Jumlah zat mula-mula K = Koefisien partisi zat V = Volume awal S = Volume larutan pengekstraksi n = Jumlah pengulangan ekstraksi
Persamaan di atas umumnya digunakan untuk ekstraksi cair-cair,
namun untuk ekstraksi padat-cair secara umum persamaan tersebut juga
dapat diterapkan.
Ditinjau dari penggunaan pelarut, metode ekstraksi terdiri atas
metode yang menggunakan pelarut seperti maserasi, perkolasi, soxhlet,
refluks, infus, dekok dan digesti dan metode ekstraksi tanpa pelarut
misalnya destilasi uap yaitu pemisahan berdasarkan perbedaan titik uap.
Terdapat beberapa metode ekstraksi lainnya misalnya ekstraksi dengan
karbondioksida superkritik, ekstraksi ultrasonik dan ekstraksi energi
listrik.
Cara ekstraksi yang tepat tergantung pada jaringan tumbuhan,
kadar air dan golongan senyawa yang akan diisolasi. Pada umumnya
diperlukan mematikan jaringan tumbuhan terlebih dahulu dengan etanol
mendidih supaya tidak terjadi oksidasi enzimatis atau hidrolisis. Etanol
merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi tahap awal dan dapat
digunakan untuk menghilangkan klorofil yang terdapat pada simplisia,
misalnya daun yang berwarna hijau. Pada ekstraksi pertama klorofil akan
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 22
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
tertarik dan pada ekstraksi selanjutnya dengan etanol diharapkan
simplisia telah bebas dari klorofil.
Berdasarkan pengertian bahwa ekstraksi adalah metode penarikan
metabolit sekunder dari tumbuhan atau bagian tumbuhan dengan pelarut
yang sesuai, maka dalam pemilihan pelarut pengekstraksi berlaku prinsip:
polar loves polar, nonpolar loves nonpolar, artinya bila kita akan
mengekstraksi senyawa polar, harus digunakan pelarut polar dan apabila
kita akan mengekstraksi senyawa nonpolar, maka harus digunakan
pelarut nonpolar. Namun pada prakteknya ekstraksi dilakukan dengan
menggunakan pelarut dalam gradasi kepolaran, mulai dari nonpolar ke
polar atau dari polar ke nonpolar. Contoh pelarut polar adalah air,
metanol, etanol, pelarut semi polar adalah aseton, etil asetat, kloroform
dan pelarut nonpolar adalah n-heksana, eter minyak tanah, toluen,
benzene. Pelarut-pelarut nonpolar benzena, kloroform dan karbon
tetraklorida sekarang jarang digunakan, karena sifatnya hepatotoksik atau
karsinogenik. Pelarut metanol merupakan pelarut yang baik daripada
etanol tetapi kini dihindari karena memiliki sifat toksik akut dan kronik.
Untuk memperoleh ekstrak total, pelarut yang digunakan dipilih yang
dapat melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung
dalam simplisia tanaman obat. Campuran pelarut alkohol-air merupakan
campuran yang baik untuk ekstraksi awal dan diperbolehkan menurut
peraturan . Faktor utama untuk mempertimbangkan pemilihan cairan
pernyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja/proses dengan cairan
tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan keamanan.
Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan penguap vakum putar
pada tekanan rendah (rotavapor=rotary evaporator) hingga diperoleh
ekstrak kental. Terhadap ekstrak kental dilakukan pemeriksaan kualitas
ekstrak yang meliputi parameter kimia dan fisika seperti organoleptik,
pola kromatogram (lapis tipis dan dinamolisis), kadar air, dan bobot jenis
ekstrak.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 23
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
PROSEDUR EKSTRAKSI
1. MASERASI
Bagian dasar maserator dilapisi dengan kapas sebagai penyaring.
Kemudian dimasukkan sebanyak 250 gram serbuk simplisia ke dalam
maserator. Tambahkan pelarut etanol 70% atau 95% secukupnya dan
biarkan selama kira-kira 10 menit agar terjadi proses pembasahan
simplisia, kemudian ditambahkan pelarut etanol sampai seluruh
serbuk simplisia terendam. Didiamkan selama 24 jam sambil sesekali
diaduk. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian. Ekstraksi diulangi
sampai ekstrak cair yang diperoleh hampir tidak berwarna. Ukur
volume ekstrak cair yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan
rotavapor pada suhu 30-40 oC sehingga diperoleh ekstrak kental.
2. EKSTRAKSI DENGAN ALAT SOXHLET
Tuangkan 250 mL pelarut etanol 95% ke dalam labu alas bulat
atau sampai kurang lebih 1/2-2/3 bagian volume labu dan
ditambahkan batu didih. Serbuk simplisia sebanyak 50 gram disiapkan
dalam kertas saring whatman dan dimasukkan ke dalam tabung
Soxhlet. Pasang alat soxhlet sesuai tempatnya dan tambahkan 50 mL
pelarut dari bagian atas tabung soxhlet untuk pembasahan simplisia
dan nyalakan heating mantle sampai suhu mencapai titik didih
pelarut. Ekstraksi simplisia sampai tetesan pelarut hampir tidak
berwarna. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan
rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental.
3. EKSTRAKSI DENGAN CARA REFLUKS
Sebanyak 50 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, tambahkan kedalamnya pelarut etanol 95% sebanyak 250
ml. Pasangkan kondensor dengan alat refluks dan nyalakan heating
mantle sampai suhu titik didih pelarut. Ekstraksi dilakukan sampai
tetesan pelarut hampir tidak berwarna. Kemudian ekstrak yang
diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak
kental.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 24
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
PEMERIKSAAN PARAMETER EKSTRAK:
Pemeriksaan parameter ekstrak perlu dilakukan untuk mengetahui
kualitas ekstrak dilihat dari sifat fisik dan kandungan kimianya.
Parameter yang diperiksa adalah sebagai berikut :
1. Organoleptik Ekstrak
Pemeriksaan menggunakan panca indera untuk mendiskripsikan
bentuk, warna, bau dan rasa dari ekstrak yang diperoleh.
2. Rendemen Ekstrak
Rendemen dapat ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :
%
Untuk menetapkan rendemen ekstrak, sejumlah tertentu ekstrak
kental dalam cawan penguap ditimbang kemudian diuapkan di atas
penangas air dengan temperatur 40-50C sampai bobot tetap.
Tentukan berat ekstrak setelah penguapan dengan mengurangkan
dengan bobot cawan kosong, kemudian hitung rendemen ekstrak (%
b/b) sesuai dengan rumus di atas.
3. Bobot Jenis Ekstrak
Penetapan bobot jenis ekstrak dapat dilakukan sebagai berikut.
Ditimbang piknometer dengan volume tertentu dalam keadaan
kosong. Kemudian piknometer diisi penuh dengan air dan ditimbang
ulang. Kerapatan air dapat ditetapkan. Kemudian piknometer
dikosongkan dan diisi penuh dengan ekstrak, lalu ditimbang. Melalui
berat ekstrak yang mempunyai volume tertentu, dapat ditetapkan
kerapatan ekstrak. Bobot jenis ekstrak ditetapkan dengan rumus
sebagai berikut :
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 25
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
4. Kadar Air Ekstrak
Penetapan kadar air ekstrak dapat dilakukan dengan beberapa
cara misalnya dengan titrasi langsung atau tidak langsung (pereaksi
Karl-Fischer), destilasi atau gravimetri. Pada praktikum ini akan
dilakukan penetapan kadar air dengan destilasi menggunakan destilasi
toluene.
Prosedur :
Ke dalam labu bersih dan kering dimasukkan sejumlah ekstrak
kental yang telah ditimbang seksama kemudian tambahkan 200 ml
toluene, hubungkan alat. Tuangkan toluene ke dalam labu penerima
melalui alat pendingin. Panaskan labu hati-hati selama 15 menit.
Setelah toluen mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2
tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian naikkan
kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air
tersuling, biarkan tabung penerima mendingin hingga suhu kamar.
Setelah air dan toluene memisah sempurna, baca volume air. Hitung
kadar air dalam % v/b
5. Pola Kromatogram Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan dengan fasa diam silika
gel GF 254 dan fasa gerak/pengembang kombinasi pelarut dengan
perbandingan yang cocok. Untuk memperoleh perbandingan
pengembang yang optimal, dapat diperoleh dari literatur atau data-
data penelitian atau mencoba dengan perbandingan pelarut polar,
semipolar atau non polar yang umum.
Prosedur :
Pelat silika gel disiapkan dengan ukuran tertentu kemudian
ekstrak cair ditutulkan pada garis awal dengan menggunakan pipa
kapiler, biarkan beberapa saat hingga pelarutnya menguap. Pelat
silika kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang
sebelumnya telah dijenuhkan dengan cairan pengembang. Proses
kromatografi dihentikan sampai cairan pengembang sampai ke garis
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 26
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
depan. Amati pola kromatogram dibawah lampu UV 254 dan 366 nm
dan hitung Rf setiap bercak yang teramati. Penampak bercak dapat
juga menggunakan asam sulfat 10% dalam metanol.
6. Pola Dinamolisis
Dinamolisis dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut. Kertas
saring Whatman diameter 10 cm, titik pusatnya dilubangi, kemudian
dipasang sumbu yang terbuat dari kertas saring. Kertas saring
bersumbu ini kemudian ditutupkan pada cawan petri yang berisi
maserat/ekstrak cair. Biarkan terjadi proses difusi sirkular selama
kurang lebih 10 menit. Pola dinamolisis diamati.
PUSTAKA
Harborne, J.B. 1973. Phytochemical Methods , A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. Chapmann and Hall. London, 1-32.
Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan
Obat. Dirjen POM. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. 9-17. Depkes RI. 1980. Materia Medika Indonesia, jilid IV. 154-157
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 27
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
LEMBAR KERJA 2 PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN
PRAKTIKUM 2 : Ektraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia
Tumbuhan Obat
NAMA MAHASISWA : .............................................................
NPM : .............................................................
KELOMPOK : .............................................................
NAMA SIMPLISIA : .............................................................
METODE EKSTRAKSI : .............................................................
HASIL PERCOBAAN :
1. Organoleptik Ekstrak
Bentuk : ....................
Warna : ....................
Bau : ....................
Rasa : ....................
2. Rendemen Ekstrak
Volume ekstrak kental : ................. mL
Berat cawan kosong : ................. g
Berat cawan + ekstrak : ................. g
Berat cawan+ekstrak setelah penguapan : ................. g
Berat simplisia awal : ................. g
Rendemen ekstrak : ................. % b/b
3. Bobot Jenis Ekstrak
Berat piknometer kosong : ................. g
Berat piknometer + air : ................. g
Berat air : ................. g
Volume piknometer : ................. ml
Kerapatan air : ................. g/mL
Berat piknometer + ekstrak : ................. g
Volume piknometer : ................. mL
Berat ekstrak : ................. g
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 28
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
Kerapatan ekstrak : ................. g/mL
Bobot jenis ekstrak : .................
4. Kadar Air Ekstrak
Berat ekstrak uji : ................. g
Volume air : ................. mL
Kadar air : ................. % v/b
5. Pola Kromatogram Lapis Tipis
No.bercak Rf
PENGAMATAN
Sinar
tampak UV 254 nm
UV 366
nm H2SO4 10%
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 29
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 2
6. Pola Dinamolisis
Keterangan :
Diameter 1 : ........ cm ; warna .........................
Diameter 2 : ........ cm ; warna .........................
Diameter 3 : ........ cm ; warna .........................
Diameter 4 : ........ cm ; warna .........................
Diameter 5 : ........ cm ; warna .........................
Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan
Hari/Tanggal :
( )
Hari/Tanggal :
( )
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 30
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
MODUL PRAKTIKUM 3
Metode Pemisahan Estrak
TUJUAN PERCOBAAN
Melakukan pemisahan metabolit sekunder dari ekstrak atau
fraksinasi tumbuhan obat dengan metode ekstraksi cair-cair (ECC) dan
fast chromatography.
TUJUAN INSTRUKSIONAL
Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan
mampu melakukan pemisahan metabolit sekunder dari ekstrak tumbuhan
obat dengan berbagai metode pemisahan.
TEORI
Pada sistem pemisahan selalu berhubungan dengan tiga hal, yaitu
sampel dan dua pelarut yang saling tidak bercampur satu sama lain.
Sampel akan terpartisi atau terdistribusi ke dalam kedua pelarut dan
pemisahan akan berakhir setelah terjadi kesetimbangan. Ada tiga macam
penggolongan metode pemisahan yang didasarkan pada jenis kedua
pelarut, jenis dari pelarut pertama (initial phase), dan pelarut kedua
(second phase). Pada masing-masing metode pemisahan kedua pelarut
mempunyai nama yang berlainan. Sebagai contoh nama pelarut-pelarut
tersebut diperlihatkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Nama Pelarut pada Beberapa Metode Pemisahan
Metode
Pemisahan Pelarut I Pelarut II
Kromatografi Fase diam Fase gerak
ECC Rafinat Ekstraktan
Dialisis Renetat Difusat
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 31
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
Pada pengerjaan pemisahan setelah selesai selalu didiamkan sampai
terjadi pemisahan sempurna, perbandingan konsentrasi sampel
(komponen) pada kedua pelarut menjadi konstan dan dapat diekspresikan
sebagai konstanta kesetimbangan yang dinyatakan dengan koefisien
distribusi (KD) atau koefisien partisi (Kp). Jika terdapat dua macam
sampel (A dan B) dan kedua pelarut (1 dan 2), maka :
a. Untuk sampel A :
=! ! " ....................................(1)
! # ! #"
b. Untuk sampel B :
=!!" ....................................(2)
! # ! #"
Jika sampel (komponen) hanya satu, maka berlaku rumus sebagai
berikut.
= $ %$ %"
....................................(3)
[A] = menunjukkan konsentrasi molar komponen
Persamaan di atas merupakan persamaan yang sederhana dan
hanya berlaku kalau sampel (komponen) terdapat dalam satu bentuk.
Untuk perhitungan koefisien partisi yang akurat, persamaan di atas ditulis
sebagai berikut.
" $ % $ %" "
....................................(4)
di mana = koefisien aktivitas
Persamaan (4) dapat dituliskan juga sebagai berikut :
$ %$ %" ' ()
.' (") ."
....................................(5)
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 32
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
Dimana :
WA = berat A dalam gram MWA = BM sampel A V = Volume pelarut
Apabila BM A diabaikan, maka :
= $ %"$ %"
....................................(6)
(WA)1/(WA)2 = perbandingan berat A dalam pelarut 1 dan pelarut 2,
disebut perbandingan partisi atau faktor kapasitas, diberi simbol k dan
merupakan perbandingan molekul, maka
= , ", " ....................................(7)
Perbandingan volume pelarut disebut , jadi
- ./.0 ....................................(8)
Kp = k ....................................(9)
Persamaan (9) ini merupakan persamaan hubungan fundamental
teori kesetimbangan pada metode pemisahan.
EKSTRAKSI CAIR-CAIR (ECC)
Ekstraksi cair-cair merupakan metode pemisahan yang sangat
populer, yang menggunakan dua pelarut yang tidak bercampur satu
sama lain, yang disebut raffinate dan extractant. Pada pemisahan sampel
Q, maka sampel ini akan terpartisi ke dalam rafinat dan ekstraktan dan
persamaan-persamaan yang berlaku adalah sebagai berikut :
= 122 = "
3 ....................................(10)
=122 =
" ....................................(11)
4 .5.5678.9
006:; ................................(12)
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 33
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
dan untuk sampel yang tidak terekstraksi:
1 @ 4 1 @ .5.5678.9 .5678.91.5.5678.9
78.9.5678.9 =>
=>60 ............(13)
Kalau kedua volume pelarut sama, = 1, persamaan 12 dan 13
menjadi :
4 07860 ................................(14) dan
1 @ 4 787860 ................................(15)
Prosedur :
Sebanyak 1 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan
metode maserasi atau soxhlet dilarutkan dalam 100 ml air kemudian
dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambah n-heksana sama
banyak dengan pelarut pertama (100 ml), didiamkan. Kemudian dikocok,
sesekali udara di dalam corong pisah dikeluarkan, lalu dikocok lagi dan
didiamkan sampai kedua pelarut terpisah sempurna. Pemisahan diulang
sampai diperoleh fraksi n-heksana yang hampir tidak berwarna. Fraksi n-
heksana dan fraksi air dipisahkan. Pada fraksi air kemudian ditambahkan
pelarut etil asetat 100 ml dan dikocok seperti prosedur diatas. Fraksi n-
heksana, etil asetat dan air kemudian diuapkan dan dihitung rendemen
masing-masing fraksi.
FAST CHROMATOGRAPHY
Kromatografi dipercepat atau Fast Chromatography merupakan
metode kromatografi kolom yang dimodifikasi dengan cara pengurangan
tekanan melalui penghisapan dengan kompresor. Akibat pengurangan
tekanan ini kecepatan aliran pelarut (eluen) dalam kolom akan
meningkat dengan pesat. Hal ini merupakan solusi untuk mengatasi
lamanya waktu yang dibutuhkan pada kromatografi kolom konvensional.
Seperti halnya kromatografi konvensional, pemisahan komponen
pada kromatografi dipercepat dilakukan atas dasar perbedaan migrasi
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 34
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
diferensial melalui kolom yang berisi fasa diam. Ekstrak yang akan
dipisahkan ditempatkan di bagian atas penjerap dalam kolom, kemudian
dielusi dengan pelarut yang bertindak sebagai fasa gerak. Di dalam
kolom, komponen-komponen akan terpisah sebagai pita-pita yang pada
elusi seterusnya akan keluar meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi
komponen yang terpisah. Larutan fraksi komponen yang keluar kolom
ditampung sebagai fraksi (disebut eluat atau efluen) untuk kemudian
dianalisis lebih lanjut.
Kecepatan perpindahan masing-masing komponen dalam kolom
ditentukan oleh kombinasi beberapa faktor yang mengatur karakterisasi
sistem adsorpsi dan partisi. Pemisahan dalam kolom adsorpsi tergantung
pada antar aksi antara permukaan penjerap, komponen yang dipisahkan,
serta sistem pelarut elusi. Pemisahan dalam kolom partisi merupakan
proses yang menyangkut partisi komponen dalam fasa gerak dan fasa
diam yang berupa lapisan tipis pada zat pendukung hidrofilik.
Pemilihan sistem penjerap untuk kolom kromatografi cepat dan
pemilihan sistem pelarut elusi dapat dilakukan dengan bantuan metode
kromatografi lapis tipis. Data kromatografi lapis tipis sebagai acuan
dalam pemilihan sistem penjerap dan sistem pelarut elusi.
Pengembangan sistem kromatografi lapis tipis sebagai model untuk
teknik kromatografi kolom memerlukan perhatian pada nilai Rf atau hRf
komponen yang dipisahkan. Komponen yang dapat dipisahkan dengan
baik melalui metode kromatografi cepat adalah komponen yang
mempunyai nilai hRf 20-30 pada sistem kromatografi lapis tipis. Makin
besar nilai hRf pada sistem kromatografi lapis tipis makin buruk hasil
pemisahan dengan sistem kromatografi cepat atau kromatografi kolom
konvensional.
Seperti halnya pada kromatografi lapis tipis, pada kromatogafi
kolom, baik kromatografi kolom konvensional maupun kromatografi
dipercepat, jenis atau tipe penjerap yang digunakan merupakan faktor
penting yang menentukan keberhasilan suatu pemisahan. Namun dari
berbagai jenis dan tipe penjerap dengan segala perbedaan dan sifat-sifat
fisikokimianya, alumina dan silika gel G merupakan penjerap yang umum
untuk pengerjaan kromatografi kolom, termasuk kromatografi kolom
dipercepat.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 35
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
Prosedur :
Kolom diisi dengan 50 gram silika gel, sehingga dari tinggi
kolom terisi silika gel, kemudian vakum dijalankan dan permukaan silika
gel ditekan dengan batang pengaduk yang bersalut hingga menjadi padat
dan rapat. Setelah itu dimasukkan pelarut yang kepolarannya paling
rendah untuk mencoba apakah kolom telah sempurna. Jika kolom
sempurna, pelarut tersebut akan turun secara horizontal. Disamping itu
ekstrak ditimbang sebanyak 2 gram dan ditambahkan silika gel dengan
berat yang sama dengan ekstrak. Kemudian silika gel yang tersalut
ekstrak tersebut digerus hingga homogen dan halus kemudian diangin-
anginkan beberapa saat agar campuran silika gel dan ekstrak yang akan
dimasukkan kedalam kolom dalam keadaan kering. Setelah itu campuran
ekstrak dan silika gel dimasukkan dalam kolom dan diratakan kemudian
dilapisi dengan kertas saring. Pelarut dimasukkan dan vakum dijalankan
hinggga pelarut mengelusi komponen kimia dan kering didalam kolom,
setelah kering vakum dimatikan. Selanjutnya dimasukkan pelarut lain
yang tingkat kepolarannya lebih tinggi dari pelarut pertama dan vakum
dijalankan kembali. Begitu seterusnya hingga pelarut yang digunakan itu
memiliki tingkat kepolaran yang tinggi yang dapat mengelusi semua
komponen kimia dalam ekstrak. Hasil fraksi ditampung dalam botol 150
mL kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan KLT.
PUSTAKA
Miller, J.M. 1975. Separation Methods in Chemical Analysis. John Wiley & Sons : New York. 1-9.
Gritter, R.J.,Bobbitt, J.M., Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan ke-2, Terj.: Dr. Kosasih P. Penerbit ITB : Bandung. 1-18, 89-96.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 36
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
LEMBAR KERJA 3A PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN
PRAKTIKUM 3A : Metode Pemisahan Ekstrak
NAMA MAHASISWA : ............................................................
NPM : ............................................................
KELOMPOK : ............................................................
NAMA SIMPLISIA : ............................................................
METODE PEMISAHAN : EKSTRAKSI CAIR-CAIR
PROSEDUR :
I. EKSTRAKSI CAIR-CAIR (ECC)
1. Timbang 1 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi
dengan metode maserasia tau soxhlet kemudian dilarutkan dalam
100 mL aquades. Cara melarutkannya adalah kepada ekstrak
ditambahkan sedikit demi sedikit aquades sampai ekstrak
tercampur homogen
2. Masukkan larutan ekstrak ke dalam corong pisah dan tambahkan
pelarut kedua (n-heksana) sama banyak dengan pelarut pertama
3. Kocok larutan dalam corong pisah dengan seksama sambil
sesekali udara dalam corong dikeluarkan
4. Diamkan larutan dalam corong pisah sampai kedua pelarut
terpisah sempurna dan pisahkan lapisan n-heksana.
5. Ulangi proses pengocokan sampai diperoleh fraksi n-heksana
yang hampir tidak berwarna (3x)
6. Lapisan airdalam corong pisah kemudian dikocok kembali dengan
pelarut etil asetat dengan cara yang sama seperti dengan pelarut
n-heksana.
II. Analisis kromatografi lapis tipis ekstrak dan fraksi-fraksi
Fraksi-fraksi dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis,
penjerap silika gel G atau silika gel GF 254, pengembang pelarut
campuran n-heksana dan etil asetat (7 : 3) atau disesuaikan dengan
pustaka, penampak bercak visual atau sinar ultraviolet 254 nm
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 37
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
HASIL PERCOBAAN :
Pola kromatogram ekstrak dan fraksi-fraksi:
Penjerap : ................................
Pengembang : ................................
Penampak bercak : ................................
Ekstrak Etanol Fraksi n-heksan Fraksi etil asetat Fraksi Air
Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna
Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan
Hari/Tanggal :
( )
Hari/Tanggal :
( )
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 38
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
LEMBAR KERJA 3B PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN
PRAKTIKUM 3B : Metode Pemisahan Ekstrak
NAMA MAHASISWA : ............................................................
NPM : ............................................................
KELOMPOK : ............................................................
NAMA SIMPLISIA : ............................................................
METODE PEMISAHAN : FAST CHROMATOGRAPHY
PROSEDUR :
1. Kolom untuk kromatografi cepat disiapkan. Bagian alasnya dilapisi
kertas saring, kemudian ke dalamnya dimasukkan penjerap hinga
batas tertentu. Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat
dalam kolom, karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau
ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk
pada proses pemisahan.
2. Setelah kolom didiamkan sambil direndam dengan eluen
(pengkondisian kolom), ekstrak yang akan dipisahkan ditempatkan
diatas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas
seluruh permukaan penjerap. Setelah itu dilakukan proses elusi
dengan campuran pelarut berbagai perbandingan. Elusi dipercepat
dengan cara penghisapan melalui pompa vakum.
3. Eluen diganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan
berbeda dengan volume eluen yang sama dengan volume eluen pada
proses pertama. Pengerjaan dilakukan berulang seperti proses
pertama. Fraksi yang keluar kolom ditampung dan digunakan untuk
analisis lanjutan.
Komposisi larutan eluen adalah sebagai berikut:
No n-Heksana
(mL)
Etil Asetat
(mL)
1 100 0 2 90 10 3 80 20 4 70 30 5 60 40 6 50 50 7 40 60
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 39
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
8 30 70 9 20 80 10 10 90 11 0 100
4. Analisis kromatografi lapis tipis fraksi-fraksi
Fraksi-fraksi dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis,
penjerap silika gel G atau silika gel GF 254, pelarut campuran n-
heksana dan etil asetat (4:1) atau disesuaikan dengan pustaka,
penampak bercak visual atau sinar ultraviolet 254 nm.
HASIL PERCOBAAN :
I. DATA FRAKSI :
Fraksi Warna Fraksi Warna
1 7
2 8
3 9
4 10
5 11
6 12
II. DATA Rf :
Penjerap : .....................................
Pengembang : .....................................
Penampak bercak : .....................................
Fraksi Rf Fraksi Rf
1 7
2 8
3 9
4 10
5 11
6 12
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 40
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 3
POLA KROMATOGRAM : KESIMPULAN :
Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan
Hari/Tanggal :
( )
Hari/Tanggal :
( )
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 41
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
MODUL PRAKTIKUM 4
Metode Pemurnian Fraksi
TUJUAN PERCOBAAN
Melakukan pemurnian fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasipada
praktikum 3 sehingga dapat memisahkan suatu senyawa/bercak/isolat
dengan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif atau Kromatografi
Kolom.
TUJUAN INSTRUKSIONAL
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu memahami
dan mampu melakukan pemurnian fraksi sehingga diperoleh suatu isolat
dengan berbagai metode kromatografi.
TEORI
Pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memisahkan suatu komponen
dari komponen lainnya yang sama-sama terkandung dalam suatu fraksi.
Terdapat beberapa metode untuk melakukan pemisahan komponen dan
biasanya dilakukan dengan satu atau beberapa kombinasi teknik
kromatografi. Teknik kromatografi yang biasa digunakan adalah
kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi cair kinerja
tinggi dan kromatografi gas cair.
KLT (Kromatografi Lapis Tipis) merupakan salah satu teknik
kromatografi, yaitu suatu teknik atau metode pemisahan / pemurnian
senyawa kimia berdasarkan pada perbedaan koefisien partisi senyawa
dalam fasa diam dan fasa gerak, atau berdasarkan daya adsorpsi
senyawa pada adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Fasa diam
adalah fasa yang terikat pada pendukung, sedangkan fasa gerak adalah
fasa yang bergerak melalui fasa diam.
Senyawa yang akan dipisahkan ikut bergerak bersama fasa gerak.
Selama senyawa bergerak terjadi proses partisi komponen di antara fasa
gerak dan fasa diam, atau terjadi proses adsorpsi senyawa oleh adsorben
yang bertindak sebagai fasa diam. Akibat adanya perbedaan koefisien
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 42
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
partisi dan / atau afinitas adsorpsi, terjadilah perbedaan kecepatan
gerakan senyawa-senyawa yang menyebabkan terjadinya pemisahan.
Berdasarkan jenis fasa gerak dan fasa diam, kromatografi dapat
dibedakan atas berbagai tipe sebagai berikut :
FasaGerak FasaDiam Tipe
Kromatografi
Cairan Padatan Kr. Cair-Padat
Gas Padatan Kr. Gas-Padat
Cairan Cairan Kr. Cair-Cair
Gas Cairan Kr. Gas-Cair
Selain itu, penggolongan kromatografi juga dapat dilakukan
berdasar pada jenis fasa geraknya saja, berdasarkan mekanisme
pemisahan, berdasarkan jenis pendukung, atau berdasarkan proses
pengembangannya.
Penggolonggan berdasarkan fasa gerak memberikan dua tipe
kromatografi sebagai berikut :
Fasa
Gerak
Tipe
Kromatografi DasarPemisahan
Gas Kr. Gas Keatsirian dan kestabilan termal
senyawa
Cairan Kr. Cair Proses partisi atau adsorpsi
Penggunaan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan :
Mekanisme
Pemisahan Tipe Kromatografi
Adsorpsi Kr. Adsorpsi
Partisi Kr. Partisi
Pertukaran Ion Kr. Pertukaran Ion
Perbedaan Ukuran
Partikel
Kr. Saringan Gel
Kr. Eksklusi Molekular
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 43
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah
sebagai berikut :
JenisPendukung Tipe Kromatografi
Kertas Kr. Kertas
Kaca/Lempeng
logam tipis
Kr. Lapis Tipis (KLT)
Kolom Kr. Kolom
Fast Chromatography
Berdasarkan arah pengembangannya kromatografi dapat dibedakan
atas beberapa tipe, yaitu :
Arah Pengembangan TipeKromatografi
Horizontal Kr. Horizontal
Vertikal Menurun Kr. VertikalMenurun
Vertikal Menaik Kr. VertikalMenaik
Sirkular Kr. Sirkular
Dua Arah TegakLurus Kr. Dua Arah
Pada kromatografi dibedakan istilah pengembangan dan elusi.
Istilah pengembangan digunakan untuk kromatografi datar yang fasa
geraknya berjalan melalui fasa diam tanpa terjadi pengeluaran senyawa
dari fasa diamnya. Istilah ini digunakan pada kromatografi datar seperti
kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Istilah elusi
digunakan pada kromatografi yang fasa geraknya melalui fasa diam
sambil membawa senyawa keluar dari fasa diam. Istilah ini digunakan
pada kromatografi kolom.
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu tipe dari kromatografi
datar, dengan fasa diam berupa adsorben yang melekat pada pendukung
berupa lempeng kaca atau logam tipis.Penjerap yang berbeda-beda
dapat disaputkan pada pelat kaca atau penyangga lain, seperti silika gel,
alumunium oksida,celite, kalisium hidroksida, damar penukar ion,
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 44
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
magnesium sulfat, poliamida, sephadex, polifenilpirolidon, selulosa atau
campuran dua atau lebih bahan diatas.
Pemisahan pada KLT dapat berlangsung melalui dua mekanisme,
yaitu mekanisme adsorpsi dan mekanisme partisi. Bertitik tolak dari
kedua mekanisme tersebut, pada KLT selain polaritas sistem yang
merupakan penentu keberhasilan pemisahan, pemilihan sistem adsorpsi,
sistem partisi, serta pelarut merupakan faktor-faktor yang harus
diperhatikan.
Selain pemilihan pelarut yang berdasar pada falsafah polar loves
polar, adsorben merupakan faktor yang harus diperhatikan untuk
keberhasilan pemisahan pada metode KLT. Berbagai adsorben dapat
digunakan pada KLT, namun yang paling umum digunakan adalah silika
gel, alumina, kieselguhr (tanah diatomae), dan selulosa. Pemisahan
adsorben untuk suatu pemisahan KLT selain mempertimbangkan sifat
kimia senyawa sifat kimia adsorben juga harus diperhatikan tingkat /
derajat aktif adsorbennya. Menurut Brockmann, derajat aktif adsorben ini
dapat dilihat dari kandungan air dalam adsorben tersebut. Adsorben
dengan kandungan air paling rendah merupakan adsorben yang
mempunyai derajat aktif tertinggi dan dinyatakan sebagai adsorben
dengan derajat aktif I, sedangkan adsorben dengan derajat aktif
terendah dinyatakan sebagai adsorben derajataktif V. Adsorben derajat
aktif 1 dapat ditingkatkan derajat aktifnya dengan cara memanaskan
adsorben tersebut pada suhu 105o C dalam waktu tertentu. Proses
tersebut dikenal dengan sebutan pengaktifan adsorben.
Proses pengembangan pada KLT umumnya dibedakan atas
pengembangan satu kali dan pengembangan berulang. Metode
pengembangan berulang ini merupakan modifikasi dari pengembangan
biasa, yaitu kromatogram dikembangkan dengan suatu fasa gerak,
kemudian diangkat dan dikeringkan tanpa pemanasan. Setelah itu
kromatogram dikembangkan dengan fasa gerak yang sama. Banyaknya
pengulangan proses pengembangan yang optimal untuk memperoleh
pemisahan yang baik dinyatakan oleh Thomas dengan persamaan :
AB8C 1
ln1 @ FG
Atau :
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 45
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
AB8C 1
2,303log1 @ FG
Nilai Rf merupakan ukuran relatif letak suatu bercak senyawa dalam
kromatogram terhadap garis akhir pergerakan fasa gerak.
FG NOPOQROASTUVWXYZ[\WARO]ONOPOQROASTUVWXYZ[GO\OSWPOQ
Berbeda dengan kromatografi kertas, keterulangan
(reproduksibilitas) nilai Rf pada KLT sangat tidak dapat diharapkan
karena berbagai faktor penyebab seperti misalnya derajat aktif adsorben,
kejenuhan tabung pengembang, kondisi pengembangan, homogenitas
adsorben, suhu, dan lain-lain.
Selain pengembangan satu arah (menaik atau menurun, tetapi
umumnya menaik), KLT juga dapat dikembangkan dalam dua arah yang
saling tegak lurus dengan fasa gerak yang sama atau berbeda.
Pengembangan seperti itu dikenal dengan sebutan KLT dua arah.
Sebagai pendeteksi bercak pada kromatogram dapat dilakukan
dengan visual untuk komponen yang berwarna, sinar UV 254 nm dan 366
nm, pereaksi penampak bercak seperti uap iodium,asam sulfat pekat
dalam etanol, asam sulfat kromat, ninhidrin dalam butanol, asam difenil
borat, vanillin sulfat, dragendorff, dan sebagainya.
KLT PREPARATIF
Kromatografi lapis tipis preparatif dimaksudkan untuk memisahkan
senyawa dalam jumlah gram. Pelat dapat dipersiapkan lebih tebal (0,5
2 mm). Sampel diteteskan ke pelat dengan alat syringe membentuk
suatu pita (band). Pendeteksian senyawa tidak boleh merusak senyawa.
Pita yang akan dipisahkan dapat dikerok dan dilarutkan dalam pelarut
untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan.
Cara pembuatan pelat Silika gel pada penyangga kaca :
Bersihkan dulu kaca yang sudah diatur di atas alat Desaga dengan
aseton, supaya bebas dari lemak. Buat bubur Silika gel 25 g dalam 50
ml air suling dan dikocok kuat dalam labu erlenmeyer. Tuangkan semua
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 46
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
bubur ke dalam tabung desaga lalu cepat-cepat dibalik diatas kaca
pertama, kemudian segera diratakan pada kaca berikutnya sampai kaca
terakhir. Diamkan lapisan silika pada pelat hingga mengering pada suhu
kamar kira-kira 10-20 menit, lalu pelat dikeringkan dalam oven dengan
suhu 110-120 C selama 1-2 jam.
KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi kolom biasanya digunakan untuk memisahkan
komponen dalam jumlah lebih besar (gram). Mempersiapkan kolom
harus dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom kemas yang
serba sama (homogen). Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca
masir, maka kita harus menyumbat kolom dengan segumpal kaca wool
atau kapas. Sumbat ini harus terendam dengan pelarut pengelusi
setinggi 10 cm. Selanjutnya penjerap dijadikan bubur dalam gelas piala
menggunakan pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam
kolom dan tidak terputus-putus, untuk mencegah terbentuknya lapisan.
Setelah itu penjerap dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dikeluarkan
melalui keran. Pada poliamid dianjurkan kemasan direndam dulu selama
satu jam, supaya mengembang. Langkah pertama pada kromatografi
kolom ialah menempatkan larutan cuplikan pada kolom sedemikian
rupasehingga terbentuk pita yang siap untuk dielusi. Untuk mencapai
iitu, cuplikan harus dilarutkan dalam pelarut yang volumenya sesedikit
mungkin. Pelarut yang dipakai harus sama dengan pelarut pengelusi,
dan sebaiknya pelarut yang kepolarannya paling rendah, walaupun hal ini
tidak selalu dapat dilaksanakan berhubung dengan kelarutannya.
Menempatkan larutan pekat pada kolom harus hati-hati supaya kemasan
kolom tidak terganggu, dan untuk ini dianjurkan menggunakan pipet.
Cuplikan dibiarkan meresap ke dalam kolom, baru proses kromatografi
dimulai.
Jika cuplikan tidak dapat melarutdalam eluen, maka dapat
digunakan cara penjerapan. Cuplikan dilarutkan ke dalam sedikit pelarut
sembarang yang cocok, dan dicampur dengan sedikit penjerap. Lalu
penjerap dikeringkan dan ditaburkan di atas kolom semerata mungkin
sebagai serbuk.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 47
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
Gambar. Kromatografi Kolom
PUSTAKA
Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting A.E. 1991. Introduction of Chromatography (Pengantar kromatografi), terjemahan Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung.
Hostettmann, K, Hostettman M. 1995. Preparative Chromatography
Techniques (Cara Kromatografi Preparatif). terjemahan Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB. Bandung.
Moelyono MW. 1996. Pengantar Kromatografi. Laboratorium
Farmakognosi Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. GajahMadaUniversity
Press. Yogyakarta. Stahl, E. 1973. Drug Analysis by Chromatography and Microscopy :
A Practical Supplement to Pharmacopeias. Ann Arbor Science Publ. Michigan.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 48
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
LEMBAR KERJA 4A PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN
PRAKTIKUM 4 : Metode Pemurnian Fraksi (KLT Preparatif)
NAMA MAHASISWA : ............................................................
NPM : ............................................................
KELOMPOK : ............................................................
NAMA SIMPLISIA : ............................................................
PROSEDUR KLT PREPARATIF :
1. Pelat kaca dibersihkan dengan aseton dan disusun diatas alat
Desaga.
2. Bubur silika gel dibuat dengan cara mencampurkan 25 gram silika gel
dengan 50 mL aquades dalam Erlenmeyer, kocok kuat-kuat sampai
tercampur homogen
3. Tuangkan semua bubur silika gel ke dalam alat tabung Desaga dan
segera dibalik bubur silika gel sehingga berada diatas kaca, kemudian
segera diratakan pada kaca berikutnya sampai dengan kaca terakhir
4. Biarkan lapisan silika gel mengering pada suhu kamar selama 10-20
menit lalu dipanaskan di dalam oven dengan suhu 110-120C selama
1-2 jam
5. Setelah kering pelat dapat digunakan untuk KLT preparatif.
Caranya: sejumlah fraksi dilarutkan dalam larutan pengembang yang
telah disiapkan dan tutulkan cuplikan secara berderet sehingga
membentuk pita sebagai garis awal pengembangan. Keringkan di
udara beberapa saat.
6. Pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan larutan
pengembang dan lakukan kromatografi sampai tanda batas
7. Amati pita yang terbentuk secara visual atau dengan sinar UV, kerok
salah satu pita yang terbentuk dan saring hasil kerokan dengan
pelarut pengembang yang digunakan.
8. Lakukan evaluasi terhadap isolat dengan Kromatografi Lapis Tipis.
HASIL PERCOBAAN :
Data analisis kromatografi lapis tipis preparatif :
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 49
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
Penjerap : ...................................................
Pengembang : ...................................................
Penampak bercak : ...................................................
Jumlah pita yang terbentuk : ..................................................
No. pita yang dikerok : ...................................................
Kromatogram Isolat :
Kesimpulan :
Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan
Hari/Tanggal :
( )
Hari/Tanggal :
( )
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 50
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
LEMBAR KERJA 4B PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN
PRAKTIKUM 4 : Metode Pemurnian Fraksi (Kromatografi Kolom)
NAMA MAHASISWA : ............................................................
NPM : ............................................................
KELOMPOK : ............................................................
NAMA SIMPLISIA : ............................................................
PROSEDUR KROMATOGRAFI KOLOM :
1. Larutan pengelusi disiapkan dengan perbandingan yang telah
ditentukan
2. Kolom kromatografi dengan diameter 1 cm disiapkan. Bagian
alasnya dilapisi kapasdan masukkan eluen setinggi kira-kira 10 cm.
3. Penjerap silika gel ditimbang seksama dan dicampurkan dengan
eluen secukupnya hingga dihasilkan bubur silika yang homogen
4. Bubur silika dituangkan ke dalam kolom perlahan-lahan dan tidak
terputus sambil kolom diketuk-ketuk agar penjerap mampat.
Kelebihan eluen dalam kolom dikeluarkan dengan membuka keran
kolom. Perhatikan keserbasamaan penjerap dalam kolom, karena
adanya rongga udara atau ketidakserbasamaan penjerap akan
berpengaruh buruk pada proses pemisahan.
5. Kolom kemudian dielusi dengan larutan pengelusi hingga diperoleh
kolom yang stabil.
6. Cuplikan fraksi yang akan dipisahkan ditimbang sebanyak 1/20 dari
berat silika dan dimasukkan dalam kolom dengan cara kering yaitu :
Cuplikan dikeringkan dengan sedikit silika dan gerus hingga
homogen. Sampel dimasukkan hati-hati diatas penjerap membentuk
lapisan tipis merata.
7. Lakukan elusi dengan perlahan sehingga terjadi pemisahan yang baik
dan terbentuk pita-pita dalam kolom. Eluat ditampung setiap 5 ml ke
dalam vial.
8. Lakukan evaluasi isolat dengan kromatografi lapis tipis.
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 51
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 4
HASIL PERCOBAAN :
Data analisis kromatografi Kolom:
Penjerap : ............................................................
Eluen : ............................................................
Berat Silika : ............................................................
Berat cuplikan : ............................................................
Jumlah fraksi : ............................................................
Kromatogram fraksi :
Kesimpulan :
Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan
Hari/Tanggal :
( )
Hari/Tanggal :
( )
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 52
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
MODUL PRAKTIKUM 5
MODUL PRAKTIKUM 5
Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri
TUJUAN PERCOBAAN
Melakukan isolasi minyak atsiri dengan cara destilasi air, destilasi uap dan
air, enfleurasi, dan pemerasan, serta melakukan penetapan kadar minyak
atsirinya menggunakan alat destilasi Stahl.
TUJUAN INSTRUKSIONAL
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu melakukan
isolasi minyak atsiri dari suatu simplisia dengan cara destilasi air,
destilasi uap dan air, enfleurasi, dan pengepresan, serta melakukan
penetapan kadar minyak atsirinya menggunakan alat destilasi Stahl.
TEORI
Minyak atsiri merupakan suatu lipophilic mixtures yang mudah
menguap, yang pada umumnya diperoleh dengan cara destilasi uap dari
bagian-bagian suatu tumbuhan. Minyak atsiri mempunyai bau yang khas
dan tersusun oleh suatu susunan senyawa kimia yang kompleks yang
terdiri atas puluhan hingga ratusan komponen. Sifat umum dari minyak
atsiri adalah mudah menguap, berbau aromatik, bila masih segar
umumnya tidak berwarna atau kekuning-kuningan yang berubah menjadi
gelap pada pendiaman, tidak mengeruhkan air, optis aktif, mempunyai
indeks bias tinggi. Minyak atsiri yang diperoleh dengan cara destilasi bila
diteteskan pada kertas saring, tetesan tersebut tidak akan meninggalkan
bekas seperti bintik lemak.
Secara kimia umumnya minyak atsiri terdiri atas komponen-
komponen terpenoid, umumnya monoterpen dan seskuiterpen sebagai
penyusun utama. Selain itu terdapat berbagai komponen lain yang
merupakan komponen minor, yang terdiri atas senyawa-senyawa kimia
alifatik, aromatik, turunan benzena, dan lain-lain. Pada umumnya
komponen minyak atsiri golongan mono dan seskuiterpen merupakan
senyawa kimia turunan isopren C5H8. Monoterpen tersusun atas 2 unit
-
PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 53
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS