Pembuatan Medium Ms

BORANG No Dokumen FO-UGM-BI-07-13LAPORAN PRAKTIKUM Berlaku Sejak 03 Maret 2008

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGIRevisi 00Halaman -

PROPOSAL

PRAKTIKUM TEKNIK KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

PEMBUATAN MEDIUM MURASHIGE & SKOOG (MS, 1962)

Nama : Safira Zata Yumni

NIM : 11/316729/BI/08770

Gol : C (Kamis/12.50-14.50)

Asisten :

FAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2015



BAB I

PENDAHULUAN

PEMBUATAN MEDIUM MURASHIGE & SKOOG (MS, 1962)

A. Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan teknik menumbuhkembangkan bagian

tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara

in vitro yang dicirikan oleh kondisi kultur yang aseptik, penggunaan

medium kultur buatan dengan kandungan nutrien lengkap dan zat pengatur

tumbuh, serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya

terkontrol (Rahardja 1989). Bagian tanaman yang akan dikulturkan disebut

eksplan. Jadi eksplan dapat berupa mata tunas, anthera, batang, daun dan

akar yang masih muda dan terdiri dari sel-sel meristematis, yang mana sel-

selnya masih aktif membelah-belah dan apabila dikulturkan pada medium

tumbuh yang sesuai secara in vitro, maka eksplan tersebut akan tumbuh

dan berkembang biak menjadi banyak (Nugroho dan Sugito, 2004).

Dilihat dari pengertian di atas, konsep kultur jaringan adalah

memanfaatkan kemampuan sel tumbuhan untuk totipotensi. Namun, untuk

proses inisiasi tumbuh dari mulai sel, jaringan, atau hanya suatu bagian

organ tertentu, setiap tumbuhan akan membutuhkan nutrien yang berbeda

dari kondisi tumbuh ketika masih dalam kondisi tumbuhan utuh atau biji.

Nutrien untuk tumbuh dalam melakukan kultur jaringan didapatkan dari

medium buatan dengan kadar nutrien yang telah disesuaikan. Medium

buatan dasar yang paling banyak digunakan adalah Medium Murashige &

Skoog, 1962. Medium ini adalah medium dasar dengan komposisi unsur,

nutrien, garam, dan ion paling lengkap dibandingkan medium dasar yang

lain. Selain itu, sumber N pada medium ini ada dalam 2 bentuk yaitu

amonium dan nitrat sehingga dapat diserap oleh berbagai jenis tumbuhan

dalam rentang pH yang luas. Medium lain seperti WPM, Gamborg, White,

dan lain-lain sebenarnya adalah modifikasi dari medium Muroshige &



Skoog yang telah disesuaikan dengan kebutuhan khusus untuk kelompok

tumbuhan tertentu. Jadi pada dasarnya hampir semua medium untuk kultur

jaringan tumbuhan adalah pengembangan dari Muroshige & Skoog.

Bagi orang yang sedang mempelajari kultur jaringan tumbuhan,

mengetahui medium yang tepat bagi eksplan yang akan ditumbuhkan

adalah hal yang krusial karena medium adalah salah satu penentu utama

keberhasilan pertumbuhan eksplan. Terutama medium Muroshige &

Skoog, 1962 yang merupakan dasar dari hampir semua medium. Eksplan

yang belum diketahui kebutuhan khusus untuk mediumnya, biasanya

diawal kebanyakan akan ditumbuhan dalam medium ini. Karena itulah

pada percobaan kali ini, akan dipelajari cara membuat medium Muroshige

& Skoog dengan proses yang aseptis.

B. Permasalahan Ilmiah

Dalam melakukan kultur jaringan, seseorang harus mampu

menentukan medium yang tepat bagi eksplan yang akan ditumbuhkan.

Namun apabila belum diketahui kebutuhan khusus eksplan tersebut,

biasanya akan digunakan medium Muroshige & Skoog (MS). Oleh karena

itu, peneliti ataupun praktisi yang bekerja dengan kultur jaringan harus

mengetahi cara pembuatan medium ini. Dari pernyataan tersebut, maka

dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut ;

1. Bagaimanakah cara pembuatan medium MS yang benar secara aseptis

dan bebas kontaminan?

2. Apa saja yang mempengaruhi keberhasilan pembuatan medium MS?

C. Tujuan

Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk meningkatkan

pemahaman dalam melakukan pembuatan medium Murashige & Skoog

(MS) secara tepat dan aseptis. Selain itu juga untuk mempelajari faktor-

faktor yang mempengaruhi keberhasilan pembuatan medium MS.



BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

(Isi tinjauan pustaka adalah pengertian dan fungsi medium dalam kultur in vitro

serta macam2 medium, kemudian mengerucut ke medium MS, sejarah dan

komponen penyusun juga fungsinya, setelah itu mengarah pada modifikasi yang

mungkin dilakukan terhadap medium MS sesuai dengan kebutuhan, contoh: MS +

ZPT tertentu, jangan lupa tambahkan tujuannya. Kemudian teknik pembuatan

medium yang tepat dan bagaimana menjaga kondisi steril, misal menggunakan

autoklaf, bagaimana prinsip kerjanya.)

Tanaman dalam kultur bersifat heterotrof, yaitu tidak dapat mensintesis

suatu senyawa untuk memenuhi kebutuhan karbonnya sendiri. Karena ituah untuk

iniasiasi awal tumbuhnya eksplan dibutuhkan medium dengan komposisi nutrien

tertentu. Medium merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur.

Medium untuk pertumbuhan kultur dapat berupa medium padat dan medium cair.

Medium padat biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian

diinduksi menjadi tanaman lengkap, sedangkan medium cair biasanya digunakan

untuk kultur sel. Komponen yang penting dalam suatu medium adalah senyawa

anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen organik

(Yuwono, 2008). Medium dasar Murashige Skoog (MS) yang digunakan pada

percobaan ini termasuk medium kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap

dibandingkan medium dasar lainnya, walaupun demikian perlu ditambah

suplemen seperti air kelapa untuk mendorong pertumbuhan jaringan, akan tetapi

pada percobaan ini tidak dilakukan penambahan air kelapa. Keistimewaan

medium MS adalah kandungan nitrat, kalium, dan amoniumnya yang tinggi.

Selain itu, sumber N ada 2 bentuk yaitu dari amonium dan nitrat (Wetter dan

Constabel, 1991).

Senyawa anorganik yang penting untuk pertumbuhan dan perkembangan

tumbuhan ada yang mikro dan makro. Umumnya medium mengandung senyawa

anorganik makro nitrat dan potassium dengan konsentrasi 25 mM. Senyawa

essensial lain yang penting adalah ammonium namun konsentrasi yang diperlukan



lebih rendah dari nitrat. Unsur makro lain yang penting adalah kalsium, sulfat, dan

magnesium dengan konsentrasi 1-3 mM. Unsur mikro yang dibutuhkan adalah

iodine (I), boron (B), mangan (Mn), zinc (Zn), molybdenium (Mo), tembaga (Cu),

kobalt (Co), dan besi (Fe) (Yuwono, 2008).

Salah satu komposisi dalam medium adalah vitamin. Vitamin yang banyak

digunakan adalah thiamin, piridoxin, dan asam nikotinat. sedangkan suplemen

organik yang biasa digunakan adalah asam amino, peptone, ekstrak malt, dan

ekstrak khamir. Zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam medium tergantung

kebutuhan kultur. Hal-hal lain yang penting dalam medium adalah komposisi

agar, pengaturan pH, dan air (Yuwono, 2008). Dalam membuat medium kultur

dari komposisi larutan baku MS dilakukan dengan hanya melarutkan dalam

sejumlah tertentu aquades yang kualitasnya memenuhi persyaratan, lalu pH-nya

diatur, dimasukkan dalam botol-botol kultur, kemudian disterilkan. (Wetherell,

1982). pH diatur dari kisaran 5,6 sampai 5,8 dengan 1N KOH atau 1N HCl.

Pengaturan pH ini bertujuan agar menyediakan PH yang cocok untuk

pertumbuhan eksplan. Apabila pH kurang dari 5 atau lebih dari 7 akan

menghambat pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Hal ini terkait dengan

pengaruhnya pada ketersediaan unsur hara yang terlarut.

Komposisi medium yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman

yang akan diperbanyak. Medium yang digunakan biasanya terdiri dari garam

mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti

agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi,

baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan

yang dilakukan. Zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam medium MS adalah

auksin (IAA) dan sitokinin (kinetin). Kedua homon ini mempengaruhi

pertumbuhan akar, tunas, dan kalus berdasarkan keseimbangan konsentrasi dari

kedua ZPT tersebut yang terkandung dalam medium. Pada konsentrasi yang

hampir tepat sama antara auksin dan sitokinin akan menghasilkan kalus. Apabila

sitokinin lebih besar dari auksin akan menginduksi tunas, sedangkan konsentrasi

auksin lebih besar dari sitokinin akan menginduksi perakaran yang lebi cepat

(Trigiano and Gray, 2000).



BAB III

METODE

(Metode disesuaikan dengan apa yang dikerjakan saat praktikum, cara kerja

dibuat dalam bentuk skematis, untuk larutan stok, cara kerja tetap dibuat

skema sesuai dengan buku petunjuk praktikum TKJT namun dimasukkan

dalam lampiran karena tidak dilakukan)

A. Alat

Peralatan yang digunakan dalam praktikum Teknik Kultur Jaringan

Tumbuhan Acara I yakni pembuatan medium MS (Murshige & Skoog)

antara lain : Erlenmeyer 1000 mL, gelas piala 600 mL, gelas ukur 1000

mL. Erlenmeyer 100 mL, dan 50 mL, atau (botol infus dan botol saus).

Pipet, Pengaduk, Hotplate,Magnetig stirer, Autoclave dan Timbangan

analitik.

B. Bahan

Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini antara lain tabel

formula dan bahan bahan kimia untuk medium MS sebagai berikut :

Tabel 1. Formula Medium Murashige&Skoog

Bahan Stock Untuk 1L mediumMakronutrien mg/LNH4NO3 1.650KNO3 1.900CaCl22H2O 440MgSO47H2O 370KH2PO4 170Besi Mg/200 mL (40X) ambil 5mL stockNa2EDTA 1.492 (37,3)FeSO44H2O 1.112 (27,8)Mikonutrien mg/100 mL (100X) ambil 1mL stockMnSO4H2O 2.230 (22,3)ZnSO44H2O 860 (8,6)H3BO3 620 (6,2)KI 83 (0,83)NaMoO4 2H2O 25 (0,25)CuSO4 5H2O 2,5 (0,025)



CoCl2 6H2O 2,5 (0,025)Vitamin mg/200mL (50X) ambil 4 mL stockGlycine 100 (2)Nicotinic acid 25 (0,5)Pyridoxine-HCl 25 (0,5)Thiamine-HCl 5 (0,1)Zat Pengatur TumbuhBA (1-5)MNAA (1-5)M2,4-D (1-10)ppmMyo-Inositol 100 mgSukrosa 30.000 mgAgar 8000-10.000 mgpH 5,6-6,3

Selain itu juga dibutuhkan kertas indkator universal pH, HCl 1N dan atau KOH

1N. Kertas aluminium foil, kertas timbang, tissue label dan alat tulis untuk

mencatat.

B. Cara Kerja

1. Pembuatan larutan Stock untuk medium MS

a) Stock besi (IRON)

Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg

Fe2SO4.7H2O. Kedua bahan kemudian dilarutkan dalam 75 mL

aquades secara terpisah. Larutan Na2EDTA dipanaskan sampai

hampir mendidih., kemudian dimasukkan larutan Fe2SO4.7H2O

sedikit demi sedikit sambil diaduk ( dengan magnetic stirer ).

Kedua larutan akan tercampur dan berwarna kuning emas, jika

larutan keruh ditambahkan beberapa tetes HCl 1N lalu dipanaskan.

Dibiarkanmendingin pada suhu kamar, dan tambahkan aquades

sampai volume menjadi 200 mL. Kemudian masukkan dalam botol

khusus berwarna gelap dan diberi label, dan disipan di dalam

kulkas. Untuk membuat 1L medium dibutuhkan 5mL larutan stock

besi.

b) Stock Mikronutrien



Bahan kimia mikronutrien ditimbang dengan menggunakan timbangan

analitik masing masing seberat :

Setelah ditimbang satu persatu bahan dimasukkan kedalam gelas

piala 200mL yang berisi aquades kurang lebih 80mL. Aduk segera

setelah bahan dimasukkan, agar tidak terjadi endapan (presipitat),

dan dapat menggunakan magnetic stirer. Setelah itu aquades

ditambahkan kedalam larutan yang sudah jadi hingga volume

menjadi 100 mL. Larutan stock dimasukkan kedalam botol khusus,

ditutup rapat diberi label dan disimpan di dalam lemari es. Untuk

membuat medium MS 1L dibutuhan 1 mL stock mikronutrien.

c) Stock Vitamin

Pertama bahan bahan berikut ini ditimbang dengan timbangan analitik

seberat :

Bahan dilarutkan satu persatu dalam gelas piala 600 mL yang berii

aquades steril kira kira 150 mL. Setelah itu tambahkan lagi

aquades steril sampai volume mencapai 200 mL. Laritan stock

MnSO4H2O 2.230ZnSO44H2O 860H3BO3 620KI 83NaMoO4 2H2O 25CuSO4 5H2O 2,5CoCl2 6H2O 2,5

Glycine 100Nicotinic acid 25Pyridoxine-HCl 25Thiamine-HCl 5



vitamin yang sudah jadi dimasukkan kedalam botol khusus, di

tutup dengan rapat diberi label dan disimpan di lemari es. Untuk

membuat 1 mL medium MS dibutuhkan 4 ml stock vitamin.

d) Stock Zat Pengatur Tumbuh

Stock zat pengatur tumbuh biasanya dibuat dengan

kepekatan 1mM.

- Stock NAA

Pertama, bahan NAA sebanyak 18,62 mg ditimbang dan

dituangkan kedalam gelas piala 100 mL yang telah berisi aquades

steril sebanyak 70 mL. Bahan diaduk hingga homogen dan

diteteskan larutan KOH 1 N dengan hati hati sampai larutan jernih.

Larutan dipindahkan kedalam labu takar 100 mL dan ditambahkan

aquades hingga volume menjadi 100 mL. Stock NAA dimasukkan

dalam botol khusus, ditutup rapat, diberi label dan dismpan di

dalam lemari es.

- Stock BA

Ba ditimbang seberat 22,52 mg dan dimasukkan kedalam

gelas piala 100mL yang telah berisi aquades kira kira 70 mL.

Bahan diaduk hingga homogen dan diteteskan larutan KOH 1 N

dengan hati hati sampai larutan jernih. Larutan dipindahkan

kedalam labu takar 100 mL dan ditambahkan aquades hingga

volume menjadi 100 mL. Stock BA dimasukkan dalam botol

khusus, ditutup rapat, diberi label dan dismpan di dalam lemari es.

- Stock 2,4D

Bahan ditimbang sebanyak 50 mg dan dimasukkan kedalam

gelas piala 100mL yang telah berisi aquades kira kira 70 mL.

Bahan diaduk hingga homogen dan diteteskan larutan KOH 1 N

dengan hati hati sampai larutan jernih. Larutan dipindahkan

kedalam labu takar 100 mL dan ditambahkan aquades hingga

volume menjadi 100 mL. Stock BA dimasukkan dalam botol

khusus, ditutup rapat, diberi label dan dismpan di dalam lemari es.



2. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 Liter

Disiapkan elenmeyer 1000 mL yang berisi aquades 500mL. Setiap

komponen bahan ditimbang sesuai tabel dan dilarutkan satu peratu, untuk

memperepat pelarutan dapat dibantu dengan magnetic stirer. Dimasukkan

5 mL larutan stock besi, 1 mL larutan stock Mikronutrien, 4 mL larutan

stock vtamin. Setelah itu timbang 100 mg Myo-Inositol dan dimasukkan

dalam erlenmeyer dan dilarutkan. Tibang 30 g sukrosa dan dilautkan

bersama. Kemudian zat pengatur tumbuh diasukkan sesuai kebutuhan, dan

ditambahkan aquades hingga mencapai colume 1000 mL. Ukur Ph

menjadi 5,6-6,3 dengan menambhkan HCL atau KOH. Setelah itu agar

ditimbang seberat 8 g masukkan dalam erlenmeyer dan dipanaskan sambir

diaduk perlahan sampai larut. Dalam keadaan cair medium dibagi kedalam

20 mL/botol. Tutup rapat botol menggunakan aluminium foil dan diberi

label sesuai dengan perlakuan. Medium yang sudah siap kemudian

disterilisasi ke dalam autoclave suhu 121C selama 15 menit dengan

tekana 15 psi (1 atm). Medium steril selanjutnya disimpan di ruang

penyimpanan dan siap digunakan.

DAFTAR PUSTAKA (dapus diatas tahun 2005 akan ada nilai bonus)

Marlina N. 2004. Teknik Modifikasi Medium Murashige dan Skoog (MS) untuk Konservasi In Vitro Mawar (Rossa spp.). Buletin Teknik Pertanian. 9(1):4-6. (apakah disitasi? )

Nugroho A dan Sugito H. 2004. Teknik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya: Jakarta



Rahardja PC. 1989. Kultur Jaringan: Teknik Perbanyakan Tanaman secara Modern. Penebar Swadaya: Jakarta.

Trigiano, RN and Gray DJ. 2000. Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises. Boca Raton: CRC Press.

Yuwono T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada Press.

Wetter LR and Constabel F. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Diterjemahkan oleh Widianto MB. Bandung: ITB Press.

Wetherell, DF. 1982. Pengantar Propagasi Secara in vitro Kultur Jaringan Tanaman. Edisi Indonesia. IKIP Semarang Press. Semarang.

Pembuatan Medium Ms

Documents

Transcript of Pembuatan Medium Ms