Post on 27-Dec-2019
Laporan Perbanyakan Vegetatif
PERBANYAKAN VEGETATIF TANAMAN DENGAN TEKNIK KULTUR
JARINGAN
Oleh,
Prekdi S. Berutu NIM : 160301034
Mata Kuliah : Perbanyakan Vegetatif
Dosen Pengampu : Yenni Marnita, SP., MP.
PROGRAM STUDY AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SAMUDRA
2018
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa yang atas
rahmat-nya maka penulis dapat menyelesaikan penyusunan laporan tentang
“Perbanyakan Vegetatif Tanaman dengan Teknik Kultur Jaringan ”.
Penulisan laporan adalah salah satu tugas mata kuliah Perbanyakan Vegetatif
di Universitas Samudra. Dalam penulisan laporan ini penulis merasa masih banyak
kekurangan-kekurangan baik pada teknis penulisan maupun materi, mengingat akan
kemampuan yang di miliki penulis. Untuk itu kritik dan saran dari semua pihak sangat
penulis harapkan demi penyempurnaan pembuatan laporan ini.
Dalam penulisan laporan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang
tak terhinga kepada pihak-pihak yang membantu dalam menyelesaikan laporan ini,
khususnya kepada Ibu dosen dan Asisten Praktikum yang telah memberikan materi,
sehingga memberikan modal awal buat penulisan laporan ini.
Semoga materi ini dapat bermanfaat dan menjadi sumbangan pemikiran bagi
pihak yang membutuhkan, khususnya bagi penulis sehinga tujuan yang di harapkan
dapat tercapai.
Langsa, 18 Desember 2018
Penulis
ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR............................................................................................. i
DAFTAR ISI............................................................................................................ ii
BAB I PENDAHULUAN........................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang...................................................................................... 1
1.2 Tujuan Praktikum ................................................................................ 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 3
2.1 Laboratorium Kultur Jaringan TUmbuhan ...................................... 3
2.2 Kultur Jaringan Tumbuhan ................................................................ 4
2.3 Prinsip Kultur Jaringan ....................................................................... 5
2.4 Landasan Kultur Jaringan Tumbuhan............................................... 5
2.5 Manfaat dan Syarat Kultur Jaringan Tumbuhan ............................. 6
2.6 Pelaksanaan Kultur Jaringan Tumbuhan.......................................... 7
2.7 Penggolongan Media Kultur Jaringan................................................ 9
2.8 Metode Sterilisasi .................................................................................. 11
BAB III METODELOGI PRAKTIKUM ............................................................. 14
3.1 Waktu dan Tempat ............................................................................... 14
3.2 Bahan dan Alat...................................................................................... 14
3.3 Prosedur Kerja ...................................................................................... 16
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 25
4.1 Induksi Kalus Wortel............................................................................ 25
4.2 Induksi Embrionik Somatis Kacang Tanah ....................................... 27
BAB V PENUTUP................................................................................................... 29
5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 29
5.2 Saran ...................................................................................................... 29
DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................. 30
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu contohnya
adalah dengan perbanyakan secara vegetatif. Cara perbanyakan vegetatif umumnya
akan menghasilkan tanaman yang lebih cepat tumbuh. Dapat tumbuhnya bagian
terkecil dari tumbuhan menjadi individu baru karena tumbuhan memiliki sifat mampu
untuk tumbuh menjadi tanaman yang sempurna bila disekitar lingkungan tersebut
sesuai. Sifat tumbuhan inilah yang kemudian mencetuskan suatu metode perbanyakan
tumbuhan secara vegetatif, yaitu dengan kultur jaringan tumbuhan.
Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara
vegetatif. Kultur jaringan tertua dilakukan pada biji anggrek dengan tujuan untuk
mengecambahkannya dalam media yang kaya nutrisi karena biji dari anggrek tidak
mempunyai cadangan makanan. Kultur jaringan terus berkembang dari mengkulturkan
biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus berkembang hingga mampu
mengkulturkan satu sel dari tanaman. Penggunaan kultur jaringan mempunyai
kelebihan, yaitu mampu memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan
dalam waktu yang relatifr singkat.
Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman
seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta
menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari
kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan.
Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik
seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman
lengkap. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur
jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh.
Kultur jaringan sering dijadikan salah satu solusi sebagai metode perbanyakan
tanaman dan juga dapat digunakan sebagai suatu metode penyimpanan plasma nutfah
2
yang tidak membutuhkan tempat yang besar. Keberhasilan dari kultur jaringan sangat
bergantung dari ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur.
Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman.
Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan
unsur hara. Sehingga, pembuatan larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting
untuk diketahui sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan.
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dalam praktikum ini adalah :
1. Mahasiswa dapat mengetahui fasilitas dan persyaratan yang dibutuhkan untuk
Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman.
2. Mahaiswa dapat membuat media tanam untuk kultur jaringan tanaman.
3. Mahasiswa mampu melakukan teknik aseptik dan induksi kalus dari eksplan
tanaman.
4. Mahasiswa dapat mengetahui tentang kultur embriosomatik dalam kultur
jaringan.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan
Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan terdiri dari ruangan-ruangan yang
dipisahkan berdasarkan fungsinya, yaitu ruang persiapan (preparation area), ruang
penanaman (transfer area), ruang pertumbuhan (growing area). Seberapapun luasnya
laboratorium, ketiga ruang tersebut harus ada. Ketiga ruang di atas juga harus terpisah
dari kebun bibit dan green house untuk menghindari masuknya kontaminasi ke dalam
ruang kultur. Kebersihan lantai, meja dan kursi harus terus dijaga secara intensif
(Hartman dkk, 1997).
1. Ruang Persiapan (preparation area)
Ruang persiapan merupakan ruangan yang mempunyai 3 fungsi dasar
yaitu untuk membersihkan alat-alat (alat-alat gelas seperti petri, botol, dll),
persiapan dan sterilisasi media, dan penyimpanan alat-alat gelas. Sebuah bak
untuk mencuci yang dilengkapi dengan kran untuk aliran air mengalir juga
diperlukan untuk membersihkan alat-alat berbahan gelas. Selain itu diperlukan
meja yang permukaanya dilapisi dengan bahan yang mudah dibersihkan.
Peralatan selanjutnya yang digunakan dalam ruang preparasi adalah
lemari es untuk menyimpan larutan stok dan beberapa media, timbangan
analitik, autoclave, pH meter, magnetic stirrer, destilator (Hartmann dkk.,
1997). Selain alat di atas, ruangan ini juga dengan alat-alat seperti Hot plate
dengan magnetic stirer,Oven, pH meter , kompor gas, labu takar, gelas piala,
erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scalpel
2. Ruangi Penanaman (Transfer area)
Ruang penanaman merupakan ruang yang digunakan untuk isolasi,
inokulasi dan subkultur (penjarangan) pada kondisi steril yang di dalamnya
terdapat lemari kaca atau kabinet yang disebut Laminar Airflow (LAF).
Laminar Airflow ini digunakan untuk pemotongan eksplan, melakukan
penanaman dan subkultur. Akan tetapi jika tidak ada LAF yang memadai, tahap
4
isolasi (pemotongan eksplan) dapat dilakukan di antara kertas saring steril.
Sangat dianjurkan untuk menggunakan jas laboratorium yang bersih selama
tahap persiapan dan mensterilkan tangan dengan alkohol 96% (Pierik, 1987).
Alat-alat seperti scalpel, gunting dan alat-alat inokulasi lainnya harus
disterilkan dengan alkohol 96% dan dilanjutkan dengan pemanasan di atas api
bunsen. Lampu ultraviolet (UV) juga digunakan untuk mensterilkan ruang,
sebelum LAF digunakan.
Pemotongan eksplan juga dilakukan di dalam LAF yang kemudian
dilanjutkan dengan beberapa tahapan sterilisasi sebelum ditanam pada media
kultur. Selama inokulasi atau penanaman, botol yang berisi media padat pada
prinsipnya pada kondisi horisontal, hal ini dilakukan untuk mengurangi
kontaminasi, terutama ketika tidak bekerja dalam LAF.
Subkultur atau tahap penjarangan juga dilakukan dalam LAF, dan
merupakan tahapan yang perlu dilakukan pada metode kultur jaringan. Ada
beberapa alasan perlu dilakukannya subkultur, diantaranya yaitu nutrisi media
yang semakin lama semakin berkurang, munculnya browning atau media agar
menjadi kecoklatan karena jaringan tanaman kadang mengeluarkan senyawa
toksik, atau eksplan membutuhkan tahap perkembangan lebih lanjut.
3. Ruang pertumbuhan atau Inkubasi (Growing area)
Growing area merupakan ruang pertumbuhan atau ruang penyimpanan
hasil kultur pada kondisi cahaya dan temperatur yang terkontrol. Ruang
pertumbuhan ini terdiri dari rak-rak yang biasanya terbuat dari kaca dan digunakan
untuk meletakkan botol-botol kultur setelah proses penanamanan pada ruang
isolasi di dalam LAF. Rak-rak yang digunakan untuk inkubasi dilengkapi dengan
lampu neon di atasnya sebagai sumber cahaya. Sedangkan ruang pertumbuhan
dalam kultur jaringan dilengkapi dengan Air conditioner (AC) untuk mengontrol
suhu ruang.
2.2 Kultur Jaringan Tumbuhan
Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi
bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril,
5
ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam
kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbayak diri dan
beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Dasar teori yang digunakan adalah teori
totipotensi yang ditulis oleh Schleiden dan Schwann, yang menyatakan bahwa teori
totipotensi adalah bagian tanaman yang hidup mempunyai totipotensi, kalau
dibudidayakan di dalam media yang sesuai, akan dapat tumbuh dan berkembang
menjadi tanaman yang sempurna, artinya dapat bereproduksi, berkembang biak secara
normal melalui biji atau spora (Yuniastuti, 2008).
2.3 Prinsip Kultur Jaringan
Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara
vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik
kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium
dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro.
Dikatakan in vitro (bahasa Latin), berarti "di dalam kaca" karena jaringan
tersebut dibiakkan di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Teori
dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap
bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas
jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil
ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya (Gunawan, 1987).
2.4 Landasan Kultur Jaringan Tumbuhan
Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman,
yaitu:
1. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan
berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan
sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang
pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel.
Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang
mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.
6
2. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke
kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru
yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi
organ baru.
3. Kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan untuk
tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu. Cantohnya embrioagenikali
kompeten cel adalah kemampuan untuk berkembang menjadi embrio funsional
penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak
mempunyai kemampuan.
2.5 Manfaat dan Syarat Kultur Jaringan Tumbuhan
Keuntungan kultur jaringan adalah:
1. Perbanyakan massal
2. Tidak tergantung musim
3. Mendapatkan tanaman yang unggul
4. Mudah ditransportasi
5. Dapat menyimpan plasma nutfah
6. Mendapatkan bahan sekunder pada waktu yang relatif cepat
Tumbuhan yang memerlukan kultur jaringan adalah:
1. Tumbuhan yang perkecambahannya rendah
2. Tumbuhan hibrida
3. Tumbuhan tidak berbiji
4. Tumbuhan yang sulit berbiji
Kegunaan kultur jaringan adalah:
1. Perbanyakan klon yang mempunyai sifat unggul
2. Menghemat waktu yang relatif singkat
3. Perbaikan mutu dengan mengubah sifat genetisnya
4. Mendapatkan tanaman yang toleran.
5. Mendapatkan tanaman yang bebas virus.
7
2.6 Pelaksanaan Kultur Jaringan Tumbuhan
Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan
pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan
tersendiri. Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu
istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang
umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang
artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.
Pekerjaan kultur jaringan meliputi:
1. Persiapan media,
2. Isolasi bahan tanam (eksplan),
3. Sterilisasi eksplan,
4. Inokulasi eksplan,
5. Aklimatisasi, dan
6. Usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang.
Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:
1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau
seedling.
2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya
menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian
daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.
3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan
(sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan
eksplannya.
4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan
media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan
menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan
yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.
5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas
bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada
media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya
8
kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi. somatik atau
fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).
6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman,
yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen
(kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid
(Santoso, 2001).
Pelaksanaan kultur jaringan memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung
kehidupan jaringan yang dibiakkan. Pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan
membutuhkan nutrisi. Nutrisi ini harus tersedia dalam jumlah cukup dan seimbang,
antara satu dengan yang lain. Nutrisi diambil tumbuhan dari dalam tanah dan udara.
Unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tumbuhan dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat-
zat organic (C, H, O, dan N) dan garam anorganik (Fe2+. Ca2+, dan lain-lain).
Tumbuhan memerlukan makronutrien dan mikronutrien dalam tumbuh dan
berkembangnya. Makronutrien adalah nutrien berupa nutrisi mineral yang diperlukan
tumbuhan dalam konsentrasi yang relatif banyak (sebagai unsur hara utama), yaitu C,
H, O, P, K, N, S, Ca, Fe, Mg.
Adapun mikronutrien adalah nutrien berupa nutrisi mineral yang diperlukan
tumbuhan dalam konsentrasi yang relatif sedikit (unsur hara pelengkap), yaitu Mn, Mo,
Zn, Cu, B, Cl. Makronutrien dan mikronutrien ini merupakan unsur essensial, karena
kehadirannya tidak dapat digantikan oleh unsur lain. Yang paling esensial adalah
wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh
dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh
menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan
memperbanyak dirinya. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan
kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral,
vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula,
dan lain-lain.
9
2.7 Penggolongan Media Kultur Jaringan Tumbuhan
Ada tiga penggolongan media tumbuh, yaitu media padat, media setengah
padat, dan media cair.
1. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar, gelatine, agarosa,
dan gelrite. Alasan digunakannya media padat adalah eksplan tidak tahan
terhadap air yang berlebih, eksplan kecil, mudah terlihat, dan bila kesplan
berupa kalus, tidak mudah pecah. Jumlah padatan yang diperlukan antara 7-11
gr per liter atau konsentrasi antara 0,6-10%. Jenis-jenis pemadat agar adalah
agar (bakto agar atau agar bahan kue), gelrite, silika gel, dan gelatin. Bahan
pemadat agar terbuat dari ganggang merah, mengandung polisakarida dan
umum digunakan untuk pemadat media, mudah didapat serta murah.
Kekurangan dari media padat adalah adanya kemungkinan pemadat
mengandung zat penghambat pertumbuhan, nutrisi terpolarisasi di permukaan
bawah yang tersentuh media, sehinggga terjadi polarisasi nutrisi, mudah
teroksidasi senyawa fenolik dari eksudat sehingga menyebabkaneksplan
berwarna coklat (browning).
2. Media setengah padat atau semi padat dilakukan pada hampir semua kultur
dengan menggunakan agar atau gelrite. Gel ini menjadi pendukung fisikuntuk
eksplan dan meningkatkan aerasi pada media. Gelrite adalah produk sintetik
yang memiliki keuntungan gel yang lebih jernih dibandingkan agar yang agak
keruh (dari ekstrak rumput laut). Gel ini membuat pengamatan kontaminan atau
perkembangan akar lebih mudah. Gel in juga memiliki kondisi fisik dan kimia
yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan
media.
3. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang
atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Media ini seringkali
digunakan untuk kultur kalus atau sel, dimana jaringan harus dibenamkan pada
media untuk menghindari kekeringan. Penggoyangan pada media perlu
dilakukan untuk mendapatkam aerasi dan distribusi larutan hara yang merata.
Macam-macam cara dalam menggunakan media cair adalah (1) melalui
10
stationer (metode dari Heller), yaitu penyimpanan eksplan pada kertas yang
meresap yang dicelupkan pada media cair. Dapat digunakan untukmengkultur
jaringan yang tidak banyak menggunakan air, antara lain eksplan apeks atau
meristem. (2) melalui cara yang diputar, antara lain rotasi, putaran peridok, dan
shacking. Keuntungan memakai media cair adalah dapat memperluas hubungan
eksplan dengan media, terhindar dari polaritas nutrisi, meningkatkan respirasi,
melarutkan senyawa racun.
Bahan-bahan yang diperlukan dan biasa digunakan dalam metode kultur
jaringan adalah media MS (Murashige and Skoog), yang terdiri dari makronutrien,
mikronutrien, vitamin, iron, zat pengatur tumbuh (ZPT), myoinositol, sukrosa dan agar.
Bahan-bahan seperti makronutrien, mikronutrien, vitamin, zpt, dan iron biasanya
dibuat dalam bentuk larutan stok (media yang lebih pekat), sehingga pada saat akan
membuat media, cukup mengambil larutan stok yang sudah dibuat. Pembuatan stok
bertujuan untuk mempermudah dibandingkan setiap kali membuat media harus
menimbang (Edhi Sandra, 2013). Pada pembuatan stok media, pemberian label pada
botol larutan stok juga jangan sampai lupa dan harus benar agar mempermudah pada
saat akan membuat media kultur. Selain media kultur jaringan, ada beberapa bahan
yang digunakan untuk sterilisasi eksplan, diantaranya adalah detergen, alkohol, clorox,
aquadest steril, dan spiritus yang dapat digunakan untuk sterilisasi permukaan LAF
atau untuk cairan dalam bunsen.
Media MS merupakan media kultur jaringan yang banyak digunakan untuk
mengkulturkan berbagai jenis tanaman, karena media ini mengandung unsur hara
makro dan mikro yang lebih lengkap dibandingkan penemu-penemu sebelumnya.
Setelah penemuan media MS, banyak berkembang modifikasi-modifikasi media untuk
tujuan tertentu, contoh media Nitsch & Nitsch (1969) untuk kultur anther dan media
SH (Schenk & Hidebrant) untuk kultur kalus monokotil dan dikotil (Edhi Sandra,
2013). Media VW (Vacin & Went) dan media organik yang digunakan untuk
perbanyakan anggrek, serta media WPM (Woody Plant Media) untuk tanaman
berkayu, atau tanaman perdu atau pohon berkayu.
Berikut disajikan tabel larutan stok dalam pembuatan media :
11
Tabel 1. Formulasi media MS (Murashige dan Skoog) dan pengelompokan senyawa
kimia dalam pembuatan larutan stok.
Nama Stok Senyawa dalamlarutan stok
Konsentrasidalam media MS(mg/l)
Konsentrasidalam larutanstok (mg/l)
Volume larutanyang dibutuhkan perliter media (ml)
Stok A NH4NO3 1.650 165.000 10Stok B KNO3 1.900 190.000 10Stok C KH2PO4
H3BO3
KlNa2NOO4.2H2OCoCl2.2H2O
1706,20,830,25O,025
17.0006.200
8325
2,5
10
Stok D CaCl2.2H2O 440 44.000 10Stok E MgSO4.&H2O
MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O
37016,19
8,60,025
37.0001.690
8602,5
10
Stok F FeSO4.7H2ONa3EDTA.2H2O
27,837,3
2.7803.730
10
Mio-Inositol 100 10.000 10Vitamin Thiamin
NiacinPyridoxinGlycin
0,10,50,52
100500500
2000
10
Sukrosa 30.000 Tidak dibuatlarutan stok
ZPT BANAAIAA2,4-DPicloram
SesuaiKebutuhan
100100100100100
Sesuai Kebutuhan
Agar 7.000-8.000 Tidak dibuatlarutan stok
2.8 Metode Sterilisasi
Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda
dari segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi
adalah tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan. Sterilisasi ini meliputi
sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi
eksplan.
12
1. Sterilisasi Ruang
Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang
digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini biasanya tidak terlalu
besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan
dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang
dibasahi dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang
ruang inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi
ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta
dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).
2. Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet)
Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan
laminar sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol
70%. Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga dinyalakan
selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar. Hal
serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi. Laminar
harus tetap dijaga kebersihannya.
3. Sterilisasi Alat dan Media
Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat
disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave
pada temperatur 121oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi
bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel selain
disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api bunsen.
Botol-botol yang akan disterilisasi sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau
plastik dan diikat dengan karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30
menit.
4. Sterilisasi Eksplan
Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat
berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan,
misalnya : daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung
pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya,
13
umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan),
musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi
eksplan adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan
eksplannya (Edhi Sandra, 2013).
Pada metode kultur jaringan untuk perbanyakan anggrek, eksplan yang
digunakan adalah biji anggrek yang berasal dari buah anggrek yang sudah tua dan
belum pecah. Kondisi buah yang masih muda atau buah tua yang sudah pecah akan
berbeda tehnik sterilisasinya. Buah anggrek yang sudah tua dan belum pecah,
sterilisasinya dengan cara membakar buah di atas api bunsen, edangkan sterilisasi buah
anggrek yang tua dan sudah pecah dilakukan dengan klorox. Setelah disterilisasi, buah
disayat secara aseptik dan diambil bijinya untuk ditanam di media kultur (Edhi Sandra,
2013).
14
BAB III
METODELOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Perbanyakan Vegetatif dengan Cara kultur jaringan (Invitro)
dilaksanakan pada hari Sabtu tanggal 1 Desember 2018 pukul 09.00 WIB s/d selesai di
Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala, Banda
Aceh.
3.2 Bahan dan Alat
1. Alat
Alat dalam ruang persiapan yaitu :
1. Hot plate
2. Timbangan analitik
3. pH meter
4. Refrigerator, Freezer
5. Alat penyuling air (Destilator)
6. Tempat mencuci peralatan kultur
7. Tempat penyimpanan glassware, bahan kimia
8. Autoklaf
9. Sumber gas/kompor
10. Meja
Alat dalam ruang transfer :
1. Laminar air flow kabinet
2. Shaker (pennggojok)
3. Lampu spiritus
4. Pinset dan Scalpel
Alat dalam ruang inkubasi
1. Rak yang dilengkapi timer dengan pengontrol waktu dan temperatur
2. Inkubator untuk kultur gelap
3. Orbital Shakers
15
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
1. Air akuades
2. Hara makro (N, P, K, Ca, Mg dan S) dan mikro (Fe, Cu, Mn, B, Mo dan Co)
3. Gula
4. Vitamin, asam amino, dan bahan organik
5. Zat Pengatur Tumbuh
6. Suplemen berupa bahan-bahan alami
7. Agar
Larutan stok yang digunakan sebagai bahan untuk membuat media yaitu :
Nama Stok Senyawa dalamlarutan stok
Konsentrasidalam media MS(mg/l)
Konsentrasidalam larutanstok (mg/l)
Volume larutanyang dibutuhkan perliter media (ml)
Stok A NH4NO3 1.650 165.000 10Stok B KNO3 1.900 190.000 10Stok C KH2PO4
H3BO3
KlNa2NOO4.2H2OCoCl2.2H2O
1706,20,830,25O,025
17.0006.200
8325
2,5
10
Stok D CaCl2.2H2O 440 44.000 10Stok E MgSO4.&H2O
MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O
37016,19
8,60,025
37.0001.690
8602,5
10
Stok F FeSO4.7H2ONa3EDTA.2H2O
27,837,3
2.7803.730
10
Mio-Inositol 100 10.000 10Vitamin Thiamin
NiacinPyridoxinGlycin
0,10,50,52
100500500
2000
10
Sukrosa 30.000 Tidak dibuatlarutan stok
ZPT BANAAIAA2,4-DPicloram
SesuaiKebutuhan
100100100100100
Sesuai Kebutuhan
16
Agar 7.000-8.000 Tidak dibuatlarutan stok
3.3 Prosedur Kerja
1. Pembuatan media : 1 liter media untuk inisiasi kalus
1) Tuangkan air aquades ke dalam erlenmeyer berukuran 1000 ml, sebanyak 500
ml
2) Masukkan ke dalamnya :
a. Masing-masing stok MS (A, B, C, D, E, F, Vitamin dam mio-inositol) sebanyak
10 ml
b. 30 gr gula, tambahkan aquades sampai volume menjadi 800 ml
17
3) Tambahkan zat pengatur tumbuh sesuai kebutuhan
4) Cukupkan volume larutan masing-masing beaker menjadi 1000 ml (gunakan
gelas ukur)
5) Atur Ph 5,7-5,8 dengan KOH atau HCl
6) Tambahkan 8 gr agar. Masak sambil diaduk, sampai agarnya larut dan berwarna
bening.
18
7) Bagi kedalam botol-botol kultur yang sudah disterilkan
8) Autoklaf pada tekanan 15 psi, temperatur 121 0C selama 15 menit.
19
9) Inkibasikan dalam ruang inkubator, tunggu 2-5 hari sebelum dilakukan
penanaman.
2. Menyiapkan Ekspalan dan Penanaman Wortel
1) Akar wortel yang tidak catat dicuci dalam air mengalir untuk menghilangkan
kotoran pada permukaan akar
2) Potong kedua bagian ujungnya, buat potongan akar menjadi ukuran 6-10 cm
lalu masukkan ke dalam erlenmeyer
20
3) Di dalam laminar air flow, rendam potongan akar tersebut dengan larutan
alkohol 70 % selama 5 menit sambil dikocok.
4) Buang larutan alkohol dan bilas dengan aquades steril. Kemudian masukkan
larutan bayclin 20 %. Rendam selama 15-25 menit sambil dikocok.
5) Buang larutan bayclin, kemudian bilas dengan akuades steril 3-5 kali
6) Dengan menggunakan pinset, angkat potongan akar dan simpan di atas cawat
petri yang diberi alas kertas saring steril
7) Potong melintang akar setebal 3-5 mm, kemudian buat potongan eksplan ± 5 x
5 mm. Pastikan jaringan kambium (bagian dalam akar) menjadi bagian
potongan eksplan.
21
8) Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada media induksi kalus yang sudah
disiapkan. Setiap botol kultur berisi 5 potongan eksplan.
9) Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan gelap.
10) Letakkan botol-botol kultur yang telah berisi eksplan tersebut dalam ruang
inkubasi dengan intensitas cahaya 0 dan suhu 20-40 0C.
11) Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu. Jika terjadi
kontaminasi keluarkan botol kultur dari ruang inkubasi, buang semua yang
22
terkontaminasi dan bersihkan botol agar bisa digunakan untuk percobaan yang
lain.
3. Menyiapkan Eksplan dan Penanaman Kacang Tanah
1) Pilih benih kacang tanah yang sama ukurannya
2) Siapkan larutan pemutih bayclin 100 %, masukkan ke dalam botol yang telah
disterilkan dan tambahkan 3 tetes tween 20
3) Masukkan semua alat yang diperlukan untuk penanaman dan letakkan dalam
laminar air flow cabinet (bunsen, pinset, pisau, petridish, air steril untuk
mencuci eksplan, media dan larutan pemutih).
4) Rendam kacang tanah dalam larutan pemutih tadi sambil dikocok selama 3-4
menit (pekerjaan ini dilakukan di dalam laminar air flow cabinet entkas)
23
5) Buang larutan pemutih dan cuci bersih dengan air steril sebanyak 3-4 kali.
6) Ambil 1 kacang tanah letakkan dalam petridish steril yang sudah disiapkan.
Belah benih kacang dan pisahkan leaflet dari embrionya (setiap kacang tanah
ada 8 potongan leaflet)
7) Tanam leaflet pada media C dan D
24
8) Letakkan botol-botol kultur yang telah berisi eksplan leaflet tersebut dalam
ruang inkubasi dengan intensitas cahaya 0 dan suhu 20-24 0C
9) Lakukan pengamatan setiap 3 hari, jika terjadi kontaminasi keluarkan botol
kultur dari ruang inkubasi, buang semua yang terkotaminasi dan bersihkan
botol agar bisa digunakan untuk percobaan yang lain.
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Induksi Kalus Wortel
Pada pengamatan setelah satu minggu pengkulturan, semua kultur terdapat
kontaminasi, baik itu dari bakteri maupun dari jamur. Hanya 4 kultur yang mengalami
respon berupa pembesaran volume eksplan. Data hasil pengamatan dapat di lihat pada
table hasil pengamatan minggu pertama. Pada minggu kedua setelah pengamatan,
kultur yang mengalami respon berupa pembesaran meningkat total sebanyak 7 kultur.
Namun pada kultur no 14 tidak mengalami respon pertumbuhan lagi. Data pengamatan
minggu kedua dapat dilihat pada table hasil pengamatan minggu kedua.
Tabel hasil pengamatan minggu pertama
26
Tabel hasil pengamatan minggu kedua
Penyebab terjadinya kontaminasi pada eksplan yang ditanam, kemungkinan
besar disebabkan oleh praktikan yang tidak hati-hati, tidak teliti, dan kurang steril pada
saat penanam, sehingga bakteri dan spora jamur yang menempel pada baju, tangan,
udara bahkan lingkungan sekitar sporanya masuk ke dalam media. Bakteri dan spora
jamur dapat tumbuh dengan baik pada media kultur jaringan karena mengandung
nutrisi baik makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan glukosa. Media yang
terkontaminasi jamur ditandai adanya perubahan warna pada media menjadi hitam dan
putih serta muncul serabut-serabut seperti jamur atau kapang (Idrianto, 2002).
Selain disebabkan oleh praktikan, penyebab yang lainnya yaitu bagian dari
tanaman yang digunakan. Pada praktikum kultur kalus wortel, bagian yang digunakan
yaitu bagian umbi. apabila kultur tidak dicuci bersih pada saat pencucian masih
terdapat mikroorganisme tanah yang tertinggal di bagian tersebut.
Proses sterilisasi yang terlalu singkat ataupun terlalu lama. Umbi wortel yang
disterilisasi terlalu singkat kemungkinan terjadi kontaminasi cukup besar, karena
mikroorganisme yang berkembang pada umbi wortel tersebut kemungkinan masih
hidup. Sedangkan proses strerilisasi yang terlalu lama mengakibatkan jaringan
27
tanaman menjadi mati sehingga eksplan tidak dapat tumbuh dan berkembang dengan
baik.
5.2 Induksi Embrionik Somatis Kacang Tanah
Sebelum dilakukan seleksi in vitro, induksi kalus embriogenik dilakukan untuk
mendapatkan populasi kalus embriogenik. Seleksi in vitro dilakukan pada jaringan
mutan yang berasal dari benih kacang tanah. Benih kacang tanah hasil panen dikupas
dari polong dan disterilkan dengan perendaman dalam larutan NaOCl (Clorox) 25%
selama 20 menit. Benih kacang tanah yang telah steril selanjutnya dibilas dengan
aquades steril. Poros embrio diisolasi dari benih kacang tanah steril dan diambil leaflet
sebagai sumber eksplan.
Media induksi ES terdiri atas media dasar MS (Murashige dan Skoog, 1962),
vitamin B5 (Gamborg et al. 1968), gula sukrosa (30 g/L), agar-agar (8 g/L), dan zat
pengatur tumbuh (auksin 16–20 M). Media diatur dengan pH 5,6 sebelum sterilisasi.
Setelah agaragar larut dalam media dengan pemanasan, media dituangkan dalam botol
kultur dan ditutup dengan plastik. Media yang telah disiapkan disterilkan dengan
pemanasan autoklaf.
Setiap empat minggu sekali, eksplan yang ditanam dipindahkan ke media
regenerasi yang masih segar untuk menjamin tersedianya nutrisi yang diperlukan bagi
perkembangan jaringan eksplan. Sub-kultur eksplan dilakukan terus menerus sampai
terbentuknya ES primer. Kultur yang ditanam diinkubasikan dalam ruang kultur
dengan temperatur yang diatur konstan 24 0C siang dan malam. Ruangan dijaga dalam
kondisi gelap selama 24 jam.
Pembentukan ES sekunder dapat dilakukan dengan menanam ES primer dalam
media regenerasi. Untuk menginduksi pebentukan ES sekunder, eksplan ES primer
yang didapat dari percobaan sebelumnya ditanam lebih lanjut dalam media regenerasi
embrio somatic sekunder. Media induksi regenerasi embrio somatik sekunder
menggunakan media yang sama dengan media induksi ES primer. Eksplan ES primer
ditanam dalam media induksi sebanyak 5 kalus embriogenik per botol. Eksplan embrio
somatik primer disubkultur dalam media yang sama yang masih segar dan sub-kultur
28
dilakukan terus-menerus sampai terbentuk kalus embriogenik. Kalus embriogenik dan
embrio somatik sekunder yang didapat selanjutnya diisolasi dan ditanam kembali
dalam media induksi yang masih segar selama beberapa periode sub-kultur. Kalus
embriogenik disubkultur secara terus menerus untuk membentuk embrio somatik
sekunder dan variasi somaklonal. Induksi variasi somaklonal diantara embrio somatik
sekunder dilakukan selama 3–4 periode sub-kultur dalam media induksi.
29
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
1. Umbi wortel digunakan sebagai media kultur jaringan, karena merupakan
bagian tanaman yang berfungsi untuk melanjutkan kelangsungan hidup
tanaman budidaya secara vegetatif.
2. Biji kacang tanah dipilih dalam praktikum ini sebagai salah satu bahan induksi
embrionik somatis pada kultur jaringan.
3. Faktor lingkungan media pertumbuhan berpengaruh terhadap pertumbuhan
kalus dalam kultur jaringan.
4. Pembuatan media dalam kultur jaringan dibuat lima hari sebelum penanaman
eksplan.
5. Ruangan dalam laboratorium kultur jaringan dimulai dari ruang persiapan,
ruang transfer dan ruang inkubasi.
5.2 Saran
Sterilisasi dilakukan secara profesional sesuai kaidah yang berlaku dalam kegiatan
praktikum yang benar. Tidak hanya peralatan dan bahan tanaman, namun juga keadaan
praktikan. Dalam melakukan kegiatan kultur jaringan, harus berhati-hati dalam
mempersiapkan bahan tanam agar eksplan tidak rusak dan kontam. Hendaknya benar-benar
memilih eksplan yang baik agar penanaman bisa berhasil semua.
30
DAFTAR PUSTAKA
Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPBPress.
Endang G. Lestari. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan Tanamanmelalui Kultur Jaringan. Jurnal Biogen 7 (1):63-68
Gunawan,L.W. 1987. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium KulturJaringan PAU Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. PlantPropagation: Principle And Practices. Sixth Ed.
Indrianto, A. 2002. Bahan Ajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Yogyakarta: FakultasBiologi Universitas Gadjah Mada.
Pierik, R.M.L. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers.Dordrecht.The Netherlands.
Santoso, Untung dan F. Nursandi, 2001. Kultur Jaringan Tanaman. Unibraw Press.Malang.
Yuniastuti, Endang. 2008. Buku Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan. UNS Press.Surakarta.