Afandi, 2009 Jurusan pendidikan Biologi, FPMIPA UPI

Makalah, Tidak Diterbitkan, Mei 2009

Implikasi Dari Penggunaan 16s rRNA Dalam Perkembangan Ekologi Mikroba Terkini

Oleh :

Atep Setya T. AFANDI1

1Jurusanpendidikan Biologi, Fakultas pendidikan matematika dan ilmu pengetahuan alam, Universitas pendidikan indonesia, mit_afandi@yahoo.com, Bandung Indonesia

Citation :Afandi, A.S.T. (2009) Implikasi Dari Penggunaan 16s rRNA Dalam Perkembangan Ekologi Mikroba Terkini. Makalah Jurusan

pendidikan Biologi, FPMIPA UPI : Tidak diterbitkan

PENDAHULUANEkologi Mikoba atau yang disebut sebagai mikrobiologi lingkungan (Behrens, 2003) merupakan ilmu yang menghubungkan semua cabang dari mikrobiologi (Brenner, Krieg dan Stanley, 2004a). Penelitian tentang ekologi mikroba merupakan aspek penting―dan telah berhasil dibuktikan―dalam berbagai aplikasi yang berhubungan dengan keberadaan mikroba di alam bebas serta berbagai interksinya yang terjadi (Brenner, Krieg dan Stanley, 2004a, Siering & Giorse, 1997a). Berbagai penyakit yang disebabkan oleh mikroba baru ditemukan pada awal tahun 1980an, seperti Lyme, ehrlichosis dan berkembang kembalinya berbagai penyakit lama seperti cholera, tuberculosis memberikan kesempatan kepada ilmu ekologi mikroba―yang sebelumnya pada abad ke-19 didominasi oleh mikrobiologi kultur―untuk lebih berkembang dalam dunia mikrobiologi dalam usaha kontrol penyebaran penyakit oleh mikroba patogen (Brenner, Krieg dan Stanley 2004a).

Perkembangan ekologi mikroba dewasa ini sudah sangat pesat dengan hadirnya aspek molekuler sebagai alat yang digunakan berbagai pebelitiannya. Hal ini memberikan dampak besar pada berbagai aspek seperti pengetahuan tentang kelimpahan, keanekaragaman, dan fungsi prokariota (Case, 2007). Selain itu, secara umum perkembangan penelitian tentang gen ini membawa revolusi permanen pada ilmu ekologi mikroba (Case, 2007; Brenner, Krieg dan Stanley, 2004a; Acinas, 2004; Cllaridge, 2004) serta dalam dunia evolusi dan Taksonomi (Acinas, 2007). Dewasa ini, terdapat beberapa prosedur molekuler dalam bidang yang banyak dikembangkan dalam bidang ekologi mikroba, yaitu antara lain Clone library, Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) (Behrens, 2003), dan Fingerprinting Method seperti Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

(DGGE) dan Terminal Restriction Fragmen Leght Polymorphism (T-RFLP) analysis. Namun, dari setiap metode tersebut mengukur aspek spesifik yang berbeda (keanekaragaman, deteksi in situ, dan dinamisasi komunitas) dari komunitas mikroba (Case, 2007), sehingga masih memberikan terlalu banyak pilihan prosedur untuk menguji aspek ekologis dari mikroba. Namun, sekarang semua aspek ekologis dari mikroba tersebut dapat dicakup oleh aplikasi dari satu gen yang dinamakan gen 16S rRNA.

Dewasa ni diketahui, berbagai keunggulan yang dimiliki oleh gen 16S rRNA, seperti daerah distribusi dengan sequens universal (universal distribution) dan sequens konservatif (conservative sequence) yang sangat beranekaragam (Brenner,Krieg dan Stanley 2004a; Cosby, 2003 & Dahlӧf, 2000 dalam Case, 2007) menjadikan gen ini sebagai alat yang sangat kuat dalam analisis ekologis (Brenner, Krieg dan Stanley 2001a). Secara khusus sekarang, aplikasi 16S rRNA menjadi prosedur standar dalam penentuan hubungan filogenetik, penaksiran keanekaragaman, serta deteksi dan kuantifikasi populasi yang khusus (Head, 1998; Hills, 1990 dalam Acinas, 2004). Merujuk pada berbagai perkembangan dari aplikasi 16S rRNA dalam bidang Ekologi Mikroba seperti yang ungkapkan diatas, yang ternyata belum sepenuhnya diketahui secara luas, maka sebuah kajian deskriptif tentang aplikasi serta berbagai implikasi yang diberikan dari 16S rRNA dalam bidang ekologi mikroba terkini sangat diperlukan.

Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk memberikan gambaran tentang implikasi penggunaan 16S rRNA dalam bidang ekologi mikroba terkini.Manfaat yang diharapkan dari penulisan makah ini adalah penulisan makalah ini adalah dapat memberikan gambaran tentang

1

Afandi, 2009 Jurusan pendidikan Biologi, FPMIPA UPI

implikasi penggunaan 16S rRNA dalam bidang ekologi mikroba terkini yang kedepannya diharapkan dapat menjadi informasi awal―gambaran singkat―dalam aplikasi 16S rRNA. Metode penulisan yang digunakan adalah dengan kajian pustaka dari buku dan jurnal serta dari pustaka online, berupa artikel ilmiah dan journal penelitian online.

APLIKASI GEN 16s rRNAPandangan pertama yang memberikan landasan aplikasi 16S rRNA ini diungkapkan oleh Pauling dan Zuckerlandl yang mengusulkan penggunaan gen sebagai penujuk arah untuk menguraikan hubungan filogenetik (Zuckerkandl & Pauling, 1965). Selanjutnya, gen 16S rRNA pertama kali diusulkan bentuk aplikasinya oleh Whoese (Brenner,Krieg dan Stanley 2004a; Case 2007 ) dan Fox (Case, 2007) pada tahun 1980an sebagai dasar definisi yang dikemukakannya tentang tiga domain kehidupan (Case, 2007). Gen 16S rRNA merupakan gen yang berada di DNA yang sering disebut juga gen sub unit kecil (small sub unit) (Cllaridge,2004). Pada aplikasinya, penggunaan gen 16S rRNA ini dapat dipaparkans secara singkat berikut ini: DNA diekstrak dari populasi campuran mikroba dan kemudian primer―primer 16―memisahkan semua bagian 16S rRNA gen (rDNA) yang kemudian diperbanyak dengan menggunakan polymerase Chain reaction (PCR), hasil yang di dapat dari rDNA kemudian diklon dan disequens. Perbedaan klon 16S rDNA kemudian dapat dianalisis secara filogenetik dengan membandingkannya dengan database dari 16S rRNA yang telah diketahui. Dalam hal yang lain, hasil yang diperoleh dapat menjadi sensus semikuantitatif―tanpa mengkultur mikroba―dari analsis komunitas dari orgaisme yang ada dari populasi campuran tersebut.

Pada aplikasi analisis komunitas seperti yang diungkapkan diatas terdapat prosedur yang bias yang mana dalam melaksanakan tahap penelitian dan interpretasi data sebaiknya dilakukan secara hati-hati (Wilson, 1997; von Wintzingerode et al., 1997; Polz and Cavanaugh, 1998; Suzuki et al., 1998 dalam Brenner,Krieg dan Stanley 2004a). Sebagai contoh jika terdapat DNA dari satu spesies yang ada dalam suatu populasi campuran mikroba tidak terekstrak maka hasil analsisis komunitas tidak bisa dikatan sebagai sensus (Brenner,Krieg dan Stanley 2004a).

Aplikasi bentuk lain dari 16S rRNA ini dapat juga dipadukan dengan prosedur molekular lain seperti Fluorocence In Situ Hybridization (FISH) dengan rNA-target probe oliginucleotida. Penggunaan teknik ini umum untuk pengamatan langsung dari saru sel dalam aplikasi dan mikrobiologi lingkungan (Behrens, 2003; Marisol, 2007). Prosedur ini baik digunakan untuk menentukan seberapa baik sebuah analisis komunitas 16S rRNA untuk menggambarkan komposisi yang aktual komunitas mikrobial (Behrens, 2003; Brenner, Krieg dan Stanley 2004a). Pada bentuk lain kombinasi prosedur molekuler dari 16S rRNA dapat dikombinasikan juga dengan teknik Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) dan Thermal Gradient Gel Electrophoresis Technique yang memisahkan 116S rRNA dari hasil PCR dari nilai mol% G+C (Muyzer dan Smalla, 1998 dalam Brenner, Krieg dan Stanley 2004a). Pada bagian lain perkembangan aplikasi 16S rRNA ini seperti dikembangkannya software IDNS Smartgenes pada analisis filogenetik atau perbandingan hasil sequens suatu mikroba dengan data base yang sudah ada. Software IDNS Smartgenes membantu analsis sequens bagian 16S rRNA dari berbagai kelompok bakteri dalam bidang mikrobiologi klinik (Simon, Croff & Petti 2006).

2

Gambar 2.1. (a)&(b)Struktur tiga dimensional 16S rRNA, (b) Alur Proses Analsis komunitas dengan16S rRNA dan menggunakan Rstriction Fragmen Leght Polymorphism (RFLP). (Sumber Gambar : (a) wikipedia, online enccyclopedia, www.wikipedia.com, (b) Behrens et all, 2003, (c) Brenner,Krieg dan Stanley 2004a).

(a) (b)

(c)

Afandi, 2009 Jurusan pendidikan Biologi, FPMIPA UPI

Pada pembahasan bidang-bidang yang telah mengalami “ekspansi” aplikasi 16S rRNA seperti yang telah diungkapkan sebelumnya pada prinsipnya berdasar pada penentuan hubungan filogenetik. Dari bidang taksonomik ini, kemudian berkembang ke bidang-bidang lain daintaranya adalah bidang klinik yang membutuhkan kejelasan jenis patogen mikrobial (Cllaridge, 2004; Rodicio dan Mendiozoa, 2006) seperti pengenalan Bacterial hinzii sebagai penyebab penyakit Septicemia (Kattar, et all, 2000), Pengenalan Bacillus antrachis penyebab penyakit Anthrax (Sacchi, 2002) serta di bidang ekologi mikroba seperti pengenalan Cyanobacteria palnktonic, bakteri pengurang sulfat, serta pendeteksian bakteri pelapis besi dan magnesium (Knut, R. et all, 2000; Loy A., et all., 2002; Siering, P.L. & Ghiorse,W.C., 1997b).

IMPLIKASI TAKSONOMIK APLIKASI 16s rRNA

Sebelum membahas bagaimana berbagai implikasi yang lebih banyak dalam bidanng ekologi mikroba alangkah lebih baiknya kita melihat dampak yang aplikassi 16S rRNA dalam penentuan dan hubungan filogenetik yang merupakan prinsip utama pengaplikasisan, sebelum nantinya secara lebih luas terbagi berdasarkan bidang-bidang yang lebih spesifik. Dari data GenBank, yag merupakan kumpulan data terbesar sequens nukleotida saat ini diketahui terdapat sekitar 90.000 sequens mikroba (Brenner,Krieg dan Stanley 2004b) yang memperlihatkan jumlah strain atau sub sepesies yang ada saat ini. Jumlah ini terbagi kedalam 1600 yang diketahui dengan 416 genus (Hogg, 2005).

Perkembangan metode sequens sebagai bentuk analsis keanekaragaman taksonomik mikroba yang terus diteliti memperlihatkan kemajuan yang sangat pesat, dengan kisaran kurang lebih penemuan satu juta pasangan basa DNA pertahun dari sebuah laboratorium kecil (Cllaridge, 2004). Adapun dalam penentuan hubungan filogenetik dalam mikroba yang sekarang banyak dilakukan adalah analissis sequens 16S rRNA dengan jumlah Base pair (bp) yang bisa mencapai 1550. Base pair ini terssusun dari region variabel dan terkonservasi. Perbandingan dari daerah variabel digunakan sebagai petunjuk perbandingan taksonomi (Chen,1989 & Relman, 1999 dalam Cllaridge, 2004). Dalam proses praktisnya analisis sequens yang biasa digunakan bisa dengan 500-bp yang dianggap lebih praktis (Cllaridge, 2004) atau dengan keseluruhan 1500-bp (Cllaridge, 2004; Brenner,Krieg dan Stanley 2004b).

IMPLIKASI PENGGUNAAN GEN RRNA DALAM BIDANG EKOLOGI MIKROBA

Kemajuan taksonomik mikroba seperti yang diungkapkan diatas memberikan dampak yang besar terhadap keadaan keanekaragaman mikroba yang diketahui sekarang―dengan taksiran 90.000 jenis sequens 16S rRNA―termasuk juga kedalam bidang ekologi mikroba. dalam ekologi mikroba klasik yang sudah dikembangkan selama abad ke-20, yang mencakup beberapa aspek utama diantaranya pengukuran aktifitas, pengukuran biomassa, mikroskopi dan teknik kultivasi (Atlas & Bratha, 1993 dalam Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a). Dalam prktisnya, penerapan berbagai aspek utama tersebut kepada prokariota memiliki banyak sekali keterbatasan yang disebebkan karena ukurannya yang kecil serta kompleksitas lingkungan (Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a). Berbagai kemajuan prosedur dengan masuknya mikroba molekuler seperti yang diungkapkan sebelumnya dalam BAB makalah ini telah memberikan revolusi besar pada berbagai aspek ekologi mikroba. dalam hal ini akan dijelaskan dalam poin-poin berikut ini.

1. Prospek Perkembangan Keanekaragaman Mikroba akan terbuka lebar.

3

Gambar 3.1. Sebuah pohon filogenetik yang universal yang memperlihatkan tiga domain utama keolmpok makhluk hidup berdasarkan analisis sequens 16S rRNA (sumber gambar, Cllaridge, 2004).

Afandi, 2009 Jurusan pendidikan Biologi, FPMIPA UPI

Perkembangan taksonomik mikroba dengan ditandai terdatanya sebanyak 90.000 sequens 16S rRNA merupakan gambaran besar semakin terbuka lebarnya pintu keanekaragaman prokariota (Acinas, 2003; Case, 2007). Penelitian tentang ekologi molekuler dengan menggunkan 16S rRNA telah membawa banyak cabang baru level filum dari filogenetik prokariotik yang diambil langsung dari habitat aslinya, yang mana hanya beberapa atau tidak sama sekali dari organisme tersebut pernah dikultur (Cllridge, 2004; Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a). Beberapa filum yang sudah ada pun telah banyak dilakukan perbandingan yang mendalam dengan filum-filum prokariota lain yang telah dikaraktegorisasi dengan baik, berdasarkan jumlah dan keannekaragaman sequens. Dari sisi ekologi khususnya ekologi mikroba, hasil ini sanngat bermanfaat sebagai permulaan yang manjanjikan. Tantangan yang sebenarnya―dalam dunia ekologi mikroba―adalah dalam menentukan bagaimana mikroba tersebut berinteraksi satu sama lain di lingkungannnya (Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a).

2. Perkembangan Aplikasi Kombinasi 16S rRNA dengan prosedur Prosedur Molekuler Lainnya akan memberikan Banyak kemudahan dalam berbagai penelitian ekologi Mikroba.

Penggunaan 16S RNA memang tidak dipungkiri memiliki keterbatasan untuk mencakup aspek yang sangat spesifik dalam berbagai kebutuhan dalam penelitian ekologi mikroba namun, secara umum hal ini bisa diantisipasi dengan inovasi-inovasi kombinasi prosedur molekuler lain dengan 16S r RNA. Kombinasi FISH dan Probe dari gen 16S rRNA sangat berguna seperti dalam pengamatan langsung dari sau sel dalam aplikasi dan mikrobiologi lingkungan (Siering, 1997a). dengan berbagai perkembangan teknologi yang juga pesat bukan tidak mungkin berbagai kombinasi prosedur molekuler akan sangat memberikan kemudahan dalam berbagai penelitian ekologi mikroba kedepannya. 3. Tantangan Spesies yang Belum Terkultur

dalam Studi Ekologi MikrobaAplikasi 16S rRNA ternyata memberikan tantangan baru bagi ilmu ekologi mikroba untuk menemukan spesies-spesies beru tersebut di lingkungan yang asli. Seperti yang telah dipaparkan aplikasi penentuan taksonomik mikroba dengan 16S rRNA meekstrak DNA dari sel aslinya, sehingga pada kenyataannya ketika informasi tentang spesies tersebut dalam sequens telah diketahui namun spesies tersebut belum pernah dikultur atau dalam artian belum diketahui spesies aslinya. Terkait hal ini, Howard Gest, 1999 (dalam Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a)

menamakan spesies-spesies ini sebagai “virtual bacteria”. Pada beberapa kasus hal ni menjadi kontroversi, namun secara umum hal yang masih tetap jadi tantangan adalah, penelitian lebih lanjut untuk mengkultur “virtual bacteria”.

4

Gambar 3.2. (a) Gambaran tentang perkembangan cabang filogenetik mikroba. pohon filogenetik Chenarchaeal (Archaea) yang memperlihatkan adanya dua sequens baru (Konarchaea) yang diperkirakan tergabung dalam domain Archaea ini. (b) Tantangan Baru spesies belum terkultur. Diagram yang memperlihatkan persentase relatif spesies dari berbagai filum terpilih. (Sumber Gambar (a), (b), Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a)

(a)

(b)

Afandi, 2009 Jurusan pendidikan Biologi, FPMIPA UPI

Pada prospek kedepannya aplikasi 16S rRNA ini, dengan berbagai teori bentuk kehidupan mikroba yang sebelumnya telah dikemukakan dalam ekologi mikroba klasik akan sangat mungkin untuk didebat pada kemudian hari dengan berbagai perkembangan aplikasi gen 16S rRNA yang terus semakin berkembang.

KESIMPULANPerkembangan ekologi molekuler telah membawa revolusi yang sangat pesat dalam berbagai bidang mikrobiologi termasuk ekologi mikroba. salah satu aspek yang mangalami kemajuan yang sangat pesat adalah prosedur penelitian yang dikembangkan dengan menggunakan 16S rRNA yang telah menjadi standar determinasi baru yang sangat kuat dalam dunia mikroba termasuk ekologi mikroba. beberapa implikasi yang kemudian muncul dengan teknik determinasi revolusioner ini adalah prospek biodiversitas mikroba yang sangat besar untu terus berkembang, berbgai prosedur kombinasi 16S rRNA yang telah terbukti dapat memberikan kemudahan-kemudahan dalam penelitian ekologi mikroba, dan tantangan baru untuk mengkultur berbagai spesies baru dengan sequens-sequens yang telah diketahui dengan aplikasi 16S rRNA ini.

REKOMENDASIDalam makalah ini kajian mengenai aplikasi 16S rRNA serta berbagai analisis teknisnya belum

disampaikan secara mendalam, penulis merekomendasikan untuk kajian ini bisa dilihat di Bergey The Sysyematic and determinative Bacteriology, yang merupakan buku revoolusioner yang memaparkan taksonomi mikroba bersasarkan analisis sequens 16S rRNA.

DAFTAR PUSTAKABehrens, S. (2003) Is the In Situ Accessibility of the 16S rRNA of Escherichia coli for Cy3-Labeled Oligonucleotide Probes Predicted by a Three-Dimensional Structure Model of the 30S Ribosomal Subunit?, Journal of Applied and Environmental Microbiology, 69(8) 4935–4941.

Brenner, D. J., Krieg, N. R. & Staley, J. T. (ed.) (2004a) Bergey Systemathic Bacteriology: Vol. II The Proteobacteria, Part A: An Introductory Essay (Second ed.).New York : Springer

Brenner, D. J., Krieg, N. R. & Staley, J. T. (ed.) (2004b) Bergey Systemathic Bacteriology: Vol. II The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria (Second ed.).New York : Springer

Castillo, Marisol et all. (2007) Application of 16S rRNA gene-targetted fluorescence in situ hybridization and restriction fragment length polymorphism to study porcine microbiota along the gastrointestinal tract in response to different sources of dietary fibre, Journal of Microbiology Ecology, 59( 1),138-146.

Case, R.J. (2007) Use of 16S rRNA and rpoB Genes as Molecular Markers For Microbial Ecology Studies, Journal of A pplied and Environmental Microbiology, 73(1), 278–288.

Clarridge J. E. (2004) Impact Of 16S r RNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria On Clinical Microbiology And Infectious Diseases, Journal of Clinical Microbiology Reviews,17 (4), 840–862.

Hoog, S. (2005) Esential Microbiology. Wert Sussex : John Willey and Sons Publlisher

Liu, Y. et all. ( _____ ) Design of Vibrio 16S rRNA gene specific primers and their application in the analysis of seawater Vibrio community, Journal of Ocean University of China, 5 (2)157-164.

Rodicio, R., M. & Mendoza C. (2006) Identification of bacteria through 16S rRNA sequencing: principles, methods and applications in clinical microbiology. [online]:http;//www.cab.org//(28 Juni 2009)

Rudi, Knut. (2000) Application of sequence-specific labeled 16S rRNA gene oligonucleotide probes for genetic profiling of cyanobacterial abundance and diversity by array hybridization, Journal of Applied and Environmental Microbiology,__(__)___.

Sacchi, C. T. et all. (2002) Sequencing of 16S rRNA Gene: A Rapid Tool for Identification of Bacillus anthracis ,In Emerging Infectious Diseases. [online]: http://www.highbeam,com/reseach/s.html (28 Juni 2009)

Siering, P.L., Ghiorse, W.C. (1997b) Development and application of 16S rRNA-targeted probes for detection of iron- and manganese-oxidizing sheathed bacteria in environmental

5

(a)

(b)

Gambar 3.3. Penggunaan Kombinasi FISH dan 16Sr RNA, dalam mpemindaian bakteri Lephitotrix dischophora dapat memebrikan gambaran jelas bakteri penambar beri dan magnesium ini (ditunjukan dengan panah), dan jika dibandingkan dengan teknik pewarnaan yang tidak memberikan gambaran jelas untuk menemukan materi tersebut (Sumber gambar :Brenner,Krieg dan Stanley, 2004a.)

(b)

Afandi, 2009 Jurusan pendidikan Biologi, FPMIPA UPI

samples, Journal of Applied and Environmental Microbiology,__(__)___.

Siering, P. L. & Ghiorse W. C. (1997a) Development and Application of 16S rRNA-Targeted Probes for Detection of Iron- and Manganese-Oxidizing Sheathed Bacteria in Environmental Sample, Journal of Applied and Environmental Microbiology, 63(2) 644–651.

Simmon, K. E., Croft, A. C., & Petti C. A. (2006) Application of smartgene IDNS software to partial 16S rRNA gene sequences for a diverse group of bacteria in a clinical laboratory, Journal of clinical microbiology, 44(12), 4400-4406

Watson, J. D. et all. (2004) Molecular Biology of The Gene (fifth ed.).San Fransisco: Benjamin Cummings Publishing

Wikipedia, free Encyclopedia (2009) 16S r RNA [omline]:http://www.wikipedia.com/16SrRNA.gif (28 Juni 2009)

Zuckerkandl, E., & Pauling, L. (1965). Molecules as Documents of Evolutionary History, Journal of Theory Biology, 8 ( _ ), 357–366.

6