i

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PROBIOTIK YANG

BERASAL DARI USUS ITIK PEDAGING Anas domesticus

ANASTIAWAN

H411 10 259

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

ii

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PROBIOTIK YANG

BERASAL DARI USUS ITIK PEDAGING Anas domesticus

Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Biologi

pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Hasanuddin

ANASTIAWAN

H411 10 259

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

iii

HALAMAN PENGESAHAN

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PROBIOTIK YANG

BERASAL DARI USUS ITIK PEDAGING Anas domesticus

Disususn dan diajukan oleh

ANASTIAWAN

H411 10 259

Disetujui oleh :

Pembimbing Utama

Dra. Hj. Risco G. Budji, M.S.

NIP. 195002161979032001

Pembimbing Pertama Pembimbing Kedua

Dr. Sartini, M. Si., Apt. Dr. Zaraswati Dwyana, M. Si.

NIP. 19611111 1987032001 NIP. 196512091990082001

Makassar, Januari 2014

iv

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillahi rabbil’alamin segala puji dan syukur penulis panjatkan

kehadirat Allah SWT. Karena hanya dengan hidayah dan berkah-Nya yang selalu

diberikan kepada hambanya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari Saluran

Pencernaan Itik Pedaging Anas domesticus” dapat selesai dengan baik. Skripsi ini

merupakan salah satu syarat dalam menyelesaikan pendidikan di Jurusan Biologi,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin

Makassar. Tak lupa pula kami kirimkan shalawat dan salam kepada junjungan kita

Nabi Muhammad SAW., keluarga, dan para sahabatnya yang telah membimbing

kita ke jalan kebenaran sehingga kita bisa tetap berada di jalan-Nya.

Atas bantuan, doa dan semangat dari berbagai pihak sehingga penulis

dapat menyelesaikan skripsi ini. Secara khusus dan istimewa skripsi ini

didedikasikan sebagai wujud rasa terima kasih penulis yang tak terhingga kepada

kedua orang tua penulis yakni, H. M. Alwi dan Hj. Nursiah yang telah merawat,

membesarkan, mendukung dan memotivasi diri penulis untuk menuntut ilmu dan

doa dari mereka yang tak henti-hentinya diberikan untuk penulis.

Kepada Dra. Hj. Risco G. Budji, MS. selaku Pembimbing Utama, Dr. Sartini,

M. Si., Apt. selaku Pembimbing Pertama, dan Dr. Zaraswati Dwyana, M. Si.

selaku Pembimbing Kedua, penulis menghaturkan banyak ucapan terima kasih

yang sedalam-dalamnya atas segala bantuan yang beliau-beliau berikan baik

berupa kritik, saran, maupun motivasi yang membantu penulis selama proses

v

penulisan skripsi ini sampai selesai. Tanpa beliau-beliau penulis tidak akan dapat

menyelesaikan skripsi ini. Terima kasih sekali lagi.

Penulis juga mengucapkan terima kasih serta penghargaan yang tulus,

kepada :

Bapak Prof. Dr. H. Hanapi Usman, MS. selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, bererta staf

pegawainya.

Bapak Dr. Eddy Soekendarsi, M.Sc. selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin.

Bapak/Ibu Dosen dan pegawai Jurusan Biologi yang senantiasa membantu

penulis sehingga dapat mencapai gelar sarjana.

Bapak Drs. Asadi Abdullah, M. Si. Selaku Penasehat Akademik (PA), yang

senantiasa memberikan arahan kepada penulis sedari penulis memulai

studinya sampai selesai.

Kepada seluruh Tim Penguji, yang senantiasa meluangkan waktunya untuk

memberikan waktunya untuk memberikan kritik dan saran yang tentunya

sangat bermanfaat bagi penulis.

Kepada saudara dan saudariku tercinta Biologi Unhas Angkatan 2010, terima

kasih banyak telah menemani penulis dari Maba sampai Sarjana.

Terima kasih pula kepada rekan penelitianku Aulia Insani yang telah rela

berbagi suka dan duka serta pertolongan yang diberikan selama ini.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa skripsi ini masih jauh dari

kesempurnaan. Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat

diharapkan demi kesempurnaan penulisan mendatang. Penulis berharap semoga

vi

sksripsi ini dapat berguna bagi kita semua, bagi perkembangan dunia sains dan

teknologi. Sekali lagi terima kasih.

Makassar, Desember 2013

Penulis

vii

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik

yang Berasal dari Usus Itik Pedaging Anas domesticus”. Penelitian ini bertujuan

untuk mengetahui karakter bakteri probiotik yang diisolasi dari usus itik pedaging

Anas domesticus. Isolasi bakteri probiotik dilakukan dengan menggunakan

medium MRSA (Man Rogosa Sharpe Agar) yang ditambahkan CaCO3 1%.

Kemampuan sebagai bakteri probiotik diperoleh dengan melakukan uji ketahanan

terhadap pH rendah dan garam empedu. Karakteristik bakteri dilakukan melalui

uji makroskopik dengan mengamati bentuk koloni, uji mikroskopik dilakukan

dengan pewarnaan Gram, uji fisiologis meliputi uji ketahanan terhadap temperatur

dan uji-uji biokimia seperti uji motilitas, uji MR-VP, uji katalase dan uji TSIA,

serta uji daya hambat terhadap bakteri patogen dengan menggunakan bakteri

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Hasil yang diperoleh terdapat

delapan isolat bakteri probiotik, 6 isolat bersifat gram positif dan 2 isolat bersifat

gram negatif, berbentuk batang dan bulat, mampu tumbuh pada medium yang

memiliki pH2,5-3 dan medium yang mengandung garam empedu sintetik 1% dan

5%, temperatur pertumbuhan 15OC dan 45

OC, serta optimum pada temperatur

37OC. kedelapan isolat bersifat non motil, positif terhadap uji MR, positif dan

negatif terhadap uji VP, bersifat katalase negatif, dan mampu memfermentasi

karbohidrat pada medium TSIA. Dari hasil uji daya hambat didapatkan bahwa

semua isolat memiliki kemampuan menghasilkan antimikroba yang bersifat

bakteriosida terhadap pertumbuhan bakteri E.coli dan S. aureus.

Kata Kunci : Probiotik, itik pedaging Anas domesticus, usus itik pedaging

viii

ABSTRACT

The research about “The Isolation and Characterization of Probiotic

Bacteria which Is Taken From Intestines of the broiler duck Anas domesticus” has

been done. This research aimed to is get the characters of those bacteria. Probiotic

bacteria was isolated by using a medium MRSA (Man Rogosa Sharpe Agar)

which is added with CaCO3 1%. To get the ability as probiotic bacteria by using a

few test such as the ability in low pH and mineral compound of bile. The

characteristic of bacteria can be observe by macroscopic test for the colony form,

the microscopoc test by using the Gram staining, the physiological test was using

temperature ability, biochemichal tests for motility test, MR-VP test, catalase test,

and TSIA test. The test of inhibitory growth of pathogen bacterial was used

Escherchia coli and Staphylococcus aureus. The result shows that eight isolates of

probiotic bacteria are 6 isolates Gram positive and 2 isolates Gram negative, rod

and round shape. They were able to grow on a medium which has a pH between

2,5 and 3 and a medium of 1% and 5% synthetic mineral compound of bile,

growth temperature 15OC and 45

OC (optimum at 37

OC). The eight isolates are

non motil, positive at MR test, positive and negative at VP test, catalase negative

and be able to fermented carbohydrates in the TSIA medium. From the result of

the inhibitory power test show that all isolates have the ability to produce

antimicrobial that are bacteriosida against bacterial growth of E.coli and S.

aureus.

Keywords : Probiotic, broiler duck Anas domesticus, intestines of broiler duck.

ix

DAFTAR ISI

Halaman

Halaman Judul.................................................................................................. i

Lembar pengesahan........................................................................................ iii

Kata Pengantar................................................................................................. iv

Abstrak.............................................................................................................. vii

Abstract............................................................................................................. viii

Daftar Isi........................................................................................................... ix

Daftar Tabel..................................................................................................... xi

Daftar Gambar.................................................................................................. xii

Daftar Lampiran............................................................................................... xiii

BAB I PENDAHULUAN............................................................................... 1

I.1 Latar Belakang................................................................................. 1

I.2 Tujuan Penelitian.............................................................................. 3

I.3 Manfaat Penelitian............................................................................. 3

I.4 Waktu dan Tempat Penelitian............................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA.................................................................... 4

II.1 Bakteri Probiotik............................................................................... 4

II.2 Manfaat Bakteri Probiotik.............................................................. 6

II.3 Jenis-jenis Bakteri Probiotik............................................................. 8

II.4 Kriteria Bakteri Probiotik................................................................. 9

II.5 Mekanisme Kerja Probiotik............................................................. 11

II.6 Studi Keamanan Probiotik............................................................... 11

x

II.7 Sumber Isolat.................................................................................. 14

II.8 Manfaat Probiotik pada Ternak........................................................ 15

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 17

III.1 Alat............................................................................................... 17

III.2 Bahan............................................................................................... 17

III.3 Prosedur Kerja................................................................................. 17

III.3.1 Sterilisasi Alat dan Medium......................................................... 17

III.3.2 Pengambilan Sampel.................................................................... 18

III.3.3 Pembuatan Medium................................................................... 18

III.3.4 Isolasi Bakteri Probiotik............................................................... 20

III.3.5 Tahap Pemurnian Kultur Bakteri................................................. 20

III.3.6 Pengamatan Morfologi................................................................. 21

III.3.7 Pembuatan Stok Bakteri............................................................... 21

III.3.8 Uji Probiotik................................................................................. 22

III.3.9 Uji Fisiologis Probiotik................................................................ 22

III.3.10 Uji Biokimia............................................................................... 23

III.3.11 Uji Daya Hambat Terhadap Bakteri Patogen............................. 24

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................ 26

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.......................................................... 47

V.1 Kesimpulan..................................................................................... 47

V.2 Saran................................................................................................. 47

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................. 48

xi

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Morfologi Koloni Isolat Bakteri Probiotik yang Diperoleh .................. 27

2. Hasil Pengecatan Gram dan Karakteristik Isolat Berdasarkan

Pertumbuhan Isolat pada Kondisi pH, Garam Empedu, dan Suhu

yang Berbeda .........................................................................................

29

3. Hasil Uji TSIA, MR-VP, Motilitas, dan Katalase ................................. 39

4. Identifikasi Hasil Fermentasi Bakteri pada Medium TSIA .................. 42

5. Hasil Pengukuran Zona Bening pada Uji Daya Hambat ....................... 44

6. Hasil Karakterisasi Bakteri Probiotik BAL........................................... 70

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Isolat Bakteri A-H Hasil Isolasi Bakteri Probiotik dari Saluran

Pencernaan Itik Pedaging ...............................................................

26

2. Hasil Pengamatan Pengecatan Gram dengan Perbesaran 100x10.. 28

3. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Keasaman (pH)........................... 31

(1) MRSB degan pH 2,5.................................................................. 31

(2) MRSB dengan pH 3................................................................... 31

4. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Garam Empedu........................... 33

(1) MRSB + Garam Empedu Sintetik 1%....................................... 33

(2) MRSB + Garam Empedu Sintetik 5%....................................... 33

5. Hasil Uji Temperatur/Suhu ............................................................ 35

(a) Inkubasi Pada Suhu 37OC ......................................................... 35

(b) Inkubasi Pada Suhu 45OC.......................................................... 35

(c) Inkubasi Pada Suhu 15OC.......................................................... 35

6. Hasil Uji MR (Methyl Red) ............................................................ 37

7. Hasil Uji VP (Voges Preskauer) .................................................... 38

8. Hasil Uji Motilitas .......................................................................... 40

9. Hasil Uji Katalase .......................................................................... 41

10. Hasil Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) ...................................... 43

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema Kerja Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal

dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging Anas domesticus .....................

54

2. Skema Kerja Isolasi Bakteri Probiotik ................................................. 55

3. Skema Kerja Pengecatan Gram ............................................................ 56

4. Skema Kerja Uji Motilitas .................................................................... 57

5. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Keasaman (pH) ........................ 58

6. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu ........................ 59

7. Skema Kerja Uji Ketahanan Temperatur ............................................. 60

8. Skema Kerja Uji MR (Methyl Red) ...................................................... 61

9. Skema Kerja Uji VP (Voges Preskauer) .............................................. 62

10. Skema Kerja Uji Katalase .................................................................... 63

11. Skema kerja uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) .................................. 64

12. Skema Kerja Uji Daya Hambat ............................................................ 65

13. Uji Daya Hambat .................................................................................. 66

14. Pemurnian Isolat BAL dengan Metode Kuadran ................................. 67

15. Foto Prosedur Kerja .............................................................................. 68

16. Hasil Karakterisasi Bakteri Probiotik.................................................... 70

1

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Seiring dengan meningkatnya jumlah penduduk, maka kebutuhan daging

di Indonesia tiap tahun mengalami peningkatan. Kebutuhan konsumsi daging di

Indonesia pada tahun 2000 berkisar 1,6 juta ton. Peningkatan kebutuhan daging

ini merangsang para ahli di bidang peternakan untuk berusaha meningkatkan

produktivitas ternak. Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas ternak

yang sekarang sedang berkembang yaitu dengan memperbaiki pakan ternak

menggunakan mikroorganisme seperti probiotik (Gunawan dan Sundari, 2003).

Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang bila dikonsumsi dapat

meningkatkan kesehatan manusia ataupun ternak dengan cara menyeimbangkan

mikroflora dalam saluran pencernaan jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup.

Probiotik mempunyai kemampuan untuk menurunkan kadar kolesterol serum darah

(Kusumawati et al., 2003). Salah satu kelompok bakteri yang berperan sebagai

probiotik adalah bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat (BAL) sering digunakan

sebagai kultur probiotik dalam produk-produk fermentasi susu atau produk

olahannya, fermentasi daging dan fermentasi buah atau sayuran

Salah satu jenis ternak yang diduga memiliki BAL pada ususnya adalah

itik Anas domesticus sehingga tingkat kesehatan itik tergolong baik. Itik Anas

domesticus mampu mempertahankan produksi telur lebih lama dibandingkan

ayam, tingkat kematiannya kecil, tahan terhadap penyakit, dan pada penggunaan

kualitas pakan yang rendah itik masih dapat berproduksi. Komoditas unggulan

dari itik adalah daging dan telur. Konsumsi per kapita telur itik pada tahun 2005

2

sebesar 0,73 kg/tahun, sedangkan konsumsi per kapita daging itik hanya 0,05

kg/tahun (Ditjennak, 2006).

Namun bagi beberapa orang, itik relatif mahal dan berukuran kecil bila

dibandingkan dengan ayam. Kandungan kolesterol itik juga tinggi, maka dari itu

orang cenderung lebih memilih daging ayam. Sebenarnya itik memiliki

keunggulan tersendiri yaitu kandungan vitamin lebih banyak dibandingkan daging

ayam. Untuk memperbaiki gizi dan kualitas itik, maka salah satu cara yang dapat

ditempuh adalah dengan menggunakan probiotik seperi BAL (Sari, 2012), karena

BAL dapat meningkatkan pertumbuhan dan efesiensi pakan ternak dengan

menyerap lebih banyak nutrisi pakan tanpa terbuang percuma melalui tinja. BAL

juga menyeimbangkan populasi mikrobia pada saluran pencernaan ternak,

mengendalikan mikroorganisme patogen pada tubuh inang dan lingkungan dan

menstimulasi imunitas inang (Surono, 2004). Probiotik seperti BAL juga

mempunyai kemampuan untuk menurunkan kadar kolesterol serum darah ternak

disebabkan karena kemampuannya menghasilkan enzim bile salt hydrolase

(BSH) (Kusumawati et al., 2003).

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri gram-positif yang

mampu mengubah karbohidrat menjadi asam laktat (Nettles dan Barefoot, 1993).

Bakteri asam laktat (BAL) hidup di saluran pencernaan ternak. Keberadaan

bakteri probiotik tersebut masih sangat kurang khususnya di usus halus, sehingga

penyerapan sari makanan menjadi kurang maksimal. Jadi untuk menambahkan

jumlah bakteri probiotik seperti BAL pada usus biasanya bakteri probiotik

tersebut diisolasi dari usus ternak itu sendiri agar didapatkan bakteri probiotik

yang benar-benar cocok dan sesuai dengan sistem pencernaan ternak tersebut

3

namun tidak semua jenis bakteri usus merupakan bakteri probiotik BAL (Sari,

2012).

Berdasarkan uraian tersebut di atas maka telah dilakukan penelitian

tentang isolasi dan karakterisasi bakteri probiotik yang berasal dari saluran

pencernaan itik pedaging Anas domesticus yang bisa membantu meningkatkan

produktivitas itik pedaging.

I.2 Tujuan penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui karakter bakteri

probiotik yang diisolasi dari usus itik pedaging Anas domesticus.

I.3 Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terhadap

penelitian-penelitian selanjutnya tentang pemanfaatan bakteri probiotik dari usus

itik pedaging Anas domesticus pada industri peternakan itik.

I.4 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus - Oktober 2013 di

Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin. Pengambilan sampel pada

peternakan itik lokal di Lembang Loe Kecamatan Binamu Kabupaten Jeneponto.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Bakteri Probiotik

Konsep tentang probiotik berawal dari penemuan Parker (1974) yang

selanjutnya mendifinisikan probiotik sebagai organisme dan senyawa yang dapat

menyeimbangkan mikroflora saluran pencernaan. Akan tetapi definisi ini

dipandang terlalu luas oleh Fuller (1986) karena meliputi biakan, sel serta

metabolit mikroba sehingga di dalamnya akan termasuk juga preparat antibiotika.

Ducluzeau et al. (1991) menyatakan bahwa definisi probiotik ialah

mikroorganisme hidup dalam bentuk kering yang mengandung media biakan serta

produk hasil metabolisme mikroorganisme tersebut. Probiotik mengandung

bakteria gram positif dan gram negatif, yeast serta jamur. Mencermati adanya

perbedaan dalam definisi probiotik yang cukup luas maka definisi yang sesuai

untuk probiotik sebaiknya diarahkan pada tujuan serta manfaatnya yaitu untuk

upaya manipulasi mikroflora saluran pencernaan untuk tujuan peningkatan

kondisi kesehatan serta produktivitas penerima probiotik.

Lilly dan Stillwell memperkenalkan istilah "probiotik" pada tahun 1965

untuk nama bahan yang dihasilkan oleh mikroba yang mendorong pertumbuhan

mikroba lain (FAO/WHO, 2001). Probiotik merupakan organisme hidup yang

mampu memberikan efek yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila

dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002;

ISAPP, 2009) dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora intestinal pada saat

masuk dalam saluran pencernaan (Shitandi et al., 2007; Dommels et al., 2009;

Weichselbaum, 2009).

5

Probiotik didefinisikan sebagai kultur hidup satu macam mikroba atau

lebih yang diberikan pada manusia atau hewan untuk mikroflora pencernaan

(Havenaaret al., 1992 dalam Sari, 2012). Jenis mikroba tersebut harus sudah

dinyatakan sebagai yang aman digunakan sebagai bahan pakan atau pangan.

Penggunaan probiotik pada ternak telah dilaporkan berfungsi sebagai: (i) zat

pemacu tumbuh, (ii) meningkatkan konversi pakan, (iii) kontrol kesehatan atau

pencegahan mikroba patogen terutama untuk ternak usia muda, dan (iv) pengurai

faktor antinutrisi seperti antitripsin (Havenaaret al., 1992 dalam Sari, 2012).

Bakteri probiotik atau bakteri baik adalah bakteri asam laktat yang hidup

di dalam usus, bersimbiosis dengan mikroflora usus yang mampu melawan

bakteri patogen di dalam usus, oleh karena itu pemberian probiotik dapat

berpengaruh menguntungkan bagi kesehatan. Sebagian besar jenis bakteri pada

probiotik berasal dari Lactobacillus atau Bifidobacterium. Dua golongan bakteri

ini mampu memperpanjang massa simpan produk dan secara alami melindungi

usus manusia (Saxelin, 1997). Bakteri ini sering dimanfaatkan untuk industri

makanan seperti yoghurt, keju, sauerkraut, acar, bir, anggur (minuman), cuka,

kimchi, cokelat dan makanan fermentasi lainnya (Khedid et al., 2006).

Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup non-patogenik,

yang jika dikonsumsi dalam jumlah tertentu akan memberikan efek

menguntungkan bagi inang (host) (FAO/WHO, 2001). Probiotik merupakan

bakteri-bakteri yang secara tradisional telah lama digunakan dalam bentuk

makanan, mengandung baik bakteri hidup, bakteri mati maupun metabolitnya

yang dalam kurun waktu lama terbukti aman.

6

Karakterisasi bakteri asam laktat yang dapat digolongkan ke dalam bakteri

probiotik adalah diketahui sebagai materi yang tidak berbahaya, dapat hidup

selama dilakukan proses dan penyimpanan, memiliki efek antagonis terhadap

bakteri patogen, toleran terhadap asam lambung, getah pankreas dan cairan

empedu serta mampu melindungi epitelium inangnya (Mac Farland dan

Cummings 2002; Begley et al., 2005, dalam Vélez, 2007).

Menurut Food and Agriculture Organization/World Health Organization

(FAO/WHO) (2001), idealnya strain probiotik seharusnya tidak hanya mampu

bertahan melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk

berkembang biak dalam saluran pencernaan, tahan terhadap cairan lambung dan

cairan empedu dalam jalur makanan yang memungkinkan untuk bertahan hidup

melintasi saluran pencernaan dan terkena paparan empedu. Selain itu probiotik

juga harus mampu menempel pada sel epitel usus, mampu membentuk kolonisasi

pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan zat anti mikroba (bakteriosin),

dan memberikan pengaruh yang menguntungkan inangnya. Syarat lainnya adalah

tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi. Strain probiotik juga harus tahan

dan tetap hidup selama proses pengolahan makanan dan penyimpanan, mudah

diaplikasikan pada produk makanan, dan tahan terhadap proses psikokimia pada

makanan (Prado et al., 2008).

II.2 Manfaat Bakteri Probiotik

Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek yang

menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup

(FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki

keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan

(Shitandi et al., 2007; Dommels et al., 2009; Weichselbaum, 2009).

7

Probiotik umumnya dari golongan bakteri asam laktat (BAL), khususnya

genus Lactobacillus dan Bifidobacterium yang merupakan bagian dari flora

normal pada saluran pencernaan (Sujaya et al. 2008). Lactobacillus merupakan

probiotik yang dapat memberikan efek yang menguntungkan seperti menstimulasi

sistem kekebalan (immune) tubuh (Isolauri et al., 2001) dan menurunkan kadar

kolesterol (Pereira et al., 2003; Yulinery et al., 2006; Belviso et al., 2009; Lee et

al., 2010).

Probiotik dapat memproduksi bakteriosin untuk melawan patogen yang

bersifat selektif hanya terhadap beberapa strain patogen. Probiotik juga

memproduksi asam laktat, asam asetat, hidrogen peroksida, laktoperoksidase,

lipopolisakarida, dan beberapa antimikrobial lainnya. Probiotik juga

menghasilkan sejumlah nutrisi penting dalam sistem imun dan metabolisme host,

seperti vitamin B (Asam Pantotenat), pyridoksin, niasin, asam folat, kobalamin,

dan biotin serta antioksidan penting seperti vitamin K (Adams, 2009).

Manfaat probiotik bagi inangnya dapat melalui mekanisme fungsi yaitu

fungsi protektif, yaitu kemampuannya untuk menghambat patogen dalam saluran

pencernaan. Terbentuknya kolonisasi probiotik dalam saluran pencernaan,

mengakibatkan kompetisi nutrisi dan lokasi adhesi (penempelan) antara probiotik

dan bakteri lain, khususnya patogen. Pertumbuhan probiotik juga akan

menghasilkan berbagai komponen anti bakteri (asam organik, hidrogen peroksida,

dan bakteriosin yang mampu menekan pertumbuhan patogen) (Collado et al.,

2009). Probiotik memberikan efek fisiologis seperti antikolesterol, antihipertensi,

intoleran laktosa, anti karsinogenik, gangguan saluran pencernaan serta alergi.

Dengan memperhatikan kesehatan inangnya penambahan probiotik harus

8

memperhatikan konsentrasi antara 107 – 10

11 CFU/g per hari untuk manusia dan

107-10

9/g per hari untuk binatang, sehingga dapat berperan untuk menurunkan

kadar kolesterol (Ooi dan Min-Tze, 2010).

Sejumlah peneliti juga mengungkapkan beberapa pengaruh positif

probiotik yaitu sebagai berikut (Tensiska, 2008) :

1) Meningkatkan ketahanan terhadap penyakit infeksi terutama infeksi usus dan

diare;

2) Menurunkan tekanan darah/ antihipertensi;

3) Menurunkan konsentrasi kolesterol serum darah;

4) Mengurangi reaksi lactose intolerance;

5) Mempengaruhi respon imun;

6) Menurunkan resiko terjadinya tumor dan kanker kolon, dan

7) Bersifat antimutagenik serta bersifat antikarsinogenik

II.3 Jenis-jenis Bakteri Probiotik

Menurut Leeson dan Summers (1996) probiotik diklasifikasikan dalam

dua tipe, yaitu kultur mikrobial hidup, sebagai contoh adalah probiotik “starbio”

yang berasal dari lambung sapi dan produk mikrobial fermentasi, contohnya

adalah kultur yeast (Saccharomyces cerevisiae), Aspergilllus niger, A. oryzae dan

Lactobacillus acidophilus. Salah satu bakteri yang berperan sebagai probiotik

adalah bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat (BAL) sering digunakan sebagai

kultur probiotik dalam produk-produk fermentasi susu atau produk olahannya,

fermentasi daging dan fermentasi buah atau sayuran.

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri gram-positif yang

mampu mengubah karbohidrat menjadi asam laktat. Genus bakteri yang tergolong

9

kepada BAL adalah Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Propionibakterium (Nettles dan

Barefoot, 1993).

Dari sekian banyak mikroorganisme, Lactobacillus dan Bifidobacterium

merupakan mikroflora normal usus yang paling utama, merupakan mikroba yang

paling banyak berperan menjaga kesehatan fungsi saluran cerna, sehingga kedua

genus ini paling banyak digunakan dalam pengembangan produk probiotik.

Lactobacillus dan Bifidobacterium merupakan probiotik yang tahan terhadap

asam lambung, cairan empedu, mampu menempel pada dinding saluran cerna

sehingga melindungi mukosa saluran cerna, dan mampu menghasilkan zat yang

berpotensi sebagai antimikroba. Kedua mikroba ini sering juga disebut bakteri

asam laktat (LAB – lactic acid bacteria) karena mampu melakukan proses

fermentasi membentuk asam laktat pada usus besar (Simadibrata, 2010).

II.4 Kriteria Bakteri Probiotik

Karakterisasi bakteri asam laktat yang dapat digolongkan ke dalam bakteri

probiotik adalah diketahui sebagai materi yang tidak berbahaya, dapat hidup

selama dilakukan proses dan penyimpanan, memiliki efek antagonis terhadap

bakteri patogen, toleran terhadap asam lambung, getah pankreas dan cairan

empedu serta mampu melindungi epitelium inangnya (Mac Farland dan

Cummings 2002; Begley et al., 2005; Vesterlund et al., 2005, dalam Vélez, 2007).

Ketika bakteri probiotik termakan, maka bakteri pertama kali akan

menghadapi keasaman lambung. Bakteri asam laktat tidak hanya tumbuh dengan

lambat pada pH rendah, tetapi kerusakan akibat asam dan hilangnya viabilitas

juga dapat terjadi pada sel bakteri yang terpapar pada pH rendah. Tiap galur

10

memiliki ketahanan yang berbeda terhadap asam atau pH rendah. Contohnya pada

penelitian yang dilakukan adalah, sebanyak 20 isolat yang berasal dari galur yang

berbeda-beda memiliki ketahanan yang berbeda-beda pada pH 2,5 selama 90

menit. Keseluruhan isolat yang diteliti ternyata mampu hidup di pH 2,5 namun

isolat yang berasal dari galur feses bayi dan air kelapa penurunan populasinya

lebih rendah daripada isolat yang berasal dari keju, tape dan moromi kecap

(Surono, 2004).

Bakteri yang mampu bertahan pada kondisi keasaman lambung akan

dialirkan menuju ke usus bagian atas dimana pada usus, bakteri akan menghadapi

tekanan yang berhubungan dengan ketersediaan O2 yang rendah, garam empedu

dan persaingan dengan mikrobiota (mikroorganisme lainnya yang terdapat di

dalam usus). Garam empedu yang terdapat di dalam usus disintesis di dalam hati

dengan cara mengkonjugasi steroid heterosiklik yang berasal dari kolesterol dan

disalurkan ke usus melalui usus dua belas jari. Garam empedu kemudian akan

diserap kembali dari ileum bagian bawah dan kembali ke hati untuk disekresikan

lagi ke empedu. Lamanya bakteri di dalam usus sekitar 4-6 jam. Bakteri yang

telah melewati garam empedu harus mampu mengkolonisasi pada saluran usus

bagian bawah agar dapat dikatakan bakteri probiotik (Surono, 2004).

Seperti halnya ketahanan terhadap asam, semua mikroba yang berhasil

hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang ditambah 0,3% ox gall, dinyatakan

bersifat tahan terhadap garam empedu. Konsentrasi garam empedu sebesar 0,3%

merupakan konsentrasi yang kritikal, nilai yang cukup tinggi untuk melakukan

seleksi terhadap isolat yang resisten terhadap garam empedu.

11

II.5 Mekanisme Kerja Probiotik

Mekanisme probiotik melindungi atau memperbaiki kondisi inangnya

antara lain dengan menghambat pertumbuhan bakteri patogen melalui beberapa

cara antara lain dengan (Simadibrata, 2010):

1. Memproduksi substansi-substansi penghambat. Probiotik mampu memproduksi

zat-zat penghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun negatif. Zat-zat

ini termasuk asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, reuterin

yang mampu menghambat tidak hanya bakteri hidup namun juga produksi

toksin.

2. Menghambat perlekatan bakteri patogen dengan berkompetisi di tempat

perlekatan permukaan mukosa saluran cerna diduga juga merupakan salah satu

cara probiotik menghambat invasi dari bakteri patogen.

3. Kompetisi nutrisi. Bakteri-bakteri yang menguntungkan (probiotik) akan

berkompetisi dengan bakteri patogen dalam hal memperebutkan nutrisi dalam

saluran cerna.

II.6 Studi Keamanan Probiotik

Aspek keamanan dan fungsional menjadi pertimbangan utama dalam

proses seleksi mikroba probiotik. Aspek keamanan seperti : menyehatkan saluran

pencernaan), bersifat non patogen, dan tahan terhadap antibiotik. Aspek

fungsional seperti kemampuan hidup dan tahan dalam saluran pencernaan, dapat

diaplikasikan pada dunia industri, dan tidak menimbulkan aroma yang

menyimpang pada makanan (Saarela et al., 2000; Prado et al., 2008).

Bakteri asam laktat termasuk mikroorganisme yang aman jika

ditambahkan dalam pangan karena sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan

12

toksik, maka disebut food grade microorganism atau dikenal sebagai

mikroorganisme yang Generally Recognized As Safe (GRAS) yaitu

mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan, bahkan beberapa jenis

bakteri tersebut berguna bagi kesehatan. BAL bermanfaat untuk peningkatan

kualitas higiene dan keamanan pangan melalui penghambatan secara alami

terhadap flora berbahaya yang bersifat patogen (Kusmiati dan Malik, 2002).

Senyawa yang dihasilkan oleh BAL diantaranya adalah asam organik,

suatu peptida yang bersifat antimikroba, berbagai jenis vitamin, asam folat serta

senyawa flavor. BAL juga menurunkan pH lingkungannya dan mengeksresikan

senyawa yang mampu menghambat mikroorganisme patogen seperti H2O2,

diasetil, CO2, asetaldehid, d-isomer, asam asam amino dan bakteriosin (Surono,

2004).

Konsumsi probiotik biasanya diaplikasikan pada pembuatan produk

pangan olahan seperti; yogurt, keju, minuman penyegar, es krim, yakult, permen

dan yogurt beku (Senok, 2009; Granato et al., 2010). Jumlah minimal strain

probiotik yang ada dalam produk makanan adalah sebesar 106 CFU/g atau jumlah

strain probiotik yang harus dikonsumsi setiap hari sekitar 108 CFU/g, dengan

tujuan untuk mengimbangi kemungkinan penurunan jumlah bakteri probiotik pada

saat berada dalam jalur pencernaan (Shah, 2007).

Keamanan dan kemanjuran probiotik sangat ditentukan oleh karakter dan

jumlah bakteri yang digunakan. Oleh karena itu, dalam menilai keamanan dan

kemanjuran suatu produk probiotik beberapa faktor harus diperhatikan

diantaranya sifat-sifat bakteri yang akan digunakan seperti kemampuan bakteri

terus hidup (viability) selama proses produksi, ketika bakteri berada dalam produk

13

(carrier), ketika berada dalam saluran pencernaan dan ketika dalam penyimpanan

(bakteri mudah mengalami degradasi oleh panas, cahaya, kelembapan, dan

oksigen. Oleh karena itu, produk probiotik biasanya harus disimpan di pendingin

untuk dijaga agar bakteri tetap hidup dan aktif). Sifat bakteri lainnya yang harus

diperhatikan adalah sifat ketahanannya terhadap antibiotik dan tidak memiliki

sifat virulen (dapat menyebabkan penyakit) (Tensiska, 2008).

Jumlah bakteri juga sangat penting diperhatikan karena berhubungan

dengan kemanjuran produk probiotik bersangkutan dan juga untuk mencegah agar

tidak terjadi “over dosis” meskipun belum ada laporan mengenai efek samping

negatif probiotik dalam konsentrasi tinggi. Kelebihan probiotik di dalam tubuh

biasanya dapat dikeluarkan melalui tinja. Efek samping probiotik, jika terjadi,

cenderung ringan dan bersifat digestif (seperti buang angin dan kembung). Efek

yang lebih serius bisa saja terjadi. Secara teoritis probiotik dapat menyebabkan

infeksi yang membutuhkan perawatan antibiotik, aktivitas metabolik yang tidak

sehat, stimulasi sistem kekebalan tubuh berlebihan, dan transfer gen (penyisipan

material genetik ke dalam sel) (Tensiska, 2008).

Tak sembarang bakteri bisa digunakan sebagai probiotik. Ada beberapa

persyaratan yang harus dipenuhi, diantaranya punya aktivitas antimikroba dan

antikarsinogenik, mampu berkoloni dalam saluran pencernaan serta mampu

meningkatkan penyerapan usus. Beberapa jenis probiotik yang sering digunakan

adalah Bifidobacterium brevis, B. infantis, B. longu, Lactobacillus acidopholus,L.

bulgaricus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, dan Streptococcusthermophilus.

Di pasaran probiotik ini dijual dalam bentuk susu dan foodsupplement (Tensiska,

2008).

14

Kesimpulannya, harus dipastikan bahwa mikroorganisme probiotik tidak

meningkatkan daya serap usus yang dapat merangsang alergi pada makanan dan

menyebabkan kondisi radang lokal maupun sistemik pada sistem pencernaan. Ini

merupakan keterangan penting untuk strain-strain yang diberikan untuk terapi

(Tensiska, 2008).

II.7 Sumber Isolat

Usus besar mengandung mikroorganisme, suatu komponen yang kompleks

dan mempunyai kegiatan metabolisme yang bermacam-macam. Fungsi utamanya

adalah menampung energi dari karbohidrat yang tidak tercerna di bagian usus, hal

ini dapat dimungkinkan oleh karena kemampuan fermentasi dan absorpsi

mikroorganisme terhadap karbohidrat yang tidak terserap oleh dinding usus,

sehingga mikroorganisme berperan dalam fermentasi karbohidrat.

Mikroorganisme juga mempunyai peranan dalam sintesis vitamin B dan vitamin

K, dan metabolisme asam-asam empedu, sterol dan xenobiotic. Mikroorganisme

dalam usus sangat responsif terhadap diet karbohidrat yang dapat difermentasi,

misalnya polisakarida nonstarch, resistant starch dan oligosakarida. Adanya

bahan tersebut bakteri akan tumbuh subur dan dapat mensintesis 15 gram

biomassa yang disekresikan lewat tinja yang mengandung 1 gram Nitrogen

bakterial. Begitupun dengan usus pada ternak, dimana terdapat mikroorganisme

yang dapat mempermudah proses penyerapan nutrisi makanan ternak (Tensiska,

2008).

Pada usus besar koloni bakteri sangat tinggi tetapi pada usus halus/kecil

jumlah mikroflora hanya sedikit sehingga efek pertahanan terhadap patogenpun

15

sangat terbatas. Hal tersebut menjadi alasan kenapa sebagian target infeksi virus

dan bakteri adalah usus halus (Tensiska, 2008).

II.8 Manfaat Probiotik pada Ternak

Daging itik Anas domesticus mengandung lemak yang cukup tinggi yaitu

17% (Samudra dan Arif, 2008) dan kolesterol itik mencapai 50 mg/dl (Setiabudi,

2011). Selain itu, permasalahan yang dihadapi pada usaha produksi daging itik

adalah tidak efisiennya dalam memanfaatkan pakan (Sinurat et al., 1993),

sehingga biaya produksi menjadi tinggi. Biaya produksi kira-kira 50% lebih tinggi

dibanding dengan ayam potong, yang disebabkan rasio konversi pakan yang tidak

sebaik seperti pada ayam potong (Yeong, 1994). Untuk mencapai bobot badan

antara 1100 – 1200 g diperlukan waktu 10 minggu dengan konversi pakan 4,19 –

6,02 (Sinurat et al., 1993; Iskandar et al., 1995).

Efisiensi penggunaan pakan dapat dilakukan dengan pemberian bahan

imbuhan (feed additive) atau zat pemacu tumbuh (growth promotant).

Pencampuran feed additive ini dimaksudkan untuk meningkatkan daya simpan

ransum dan memacu pertumbuhan ternak. Namun penggunaan feed additive

secara terus menerus akan mengakibatkan terdapatnya produk metabolit berupa

residu antibiotic. Oleh karena itu penggunaan feed additive alami merupakan

alternative untuk mengurangi akumulasi residu feed additive dalam daging. Salah

satu feed additive alami yang mulai digunakan yakni bakteri probiotik (Tensiska,

2008).

Pemberian probiotik pada ternak unggas biasanya diberikan dalam bentuk

campuran ransum atau diberikan melalui air minum, atau dalam bentuk probiotik

yang hanya mengandung satu macam strain mikroba saja atau dalam bentuk

16

campuran terdiri dari beberapa strain mikroba seperti “probiolac” atau “protexin”.

Beberapa keuntungan dari penggunaan probiotik pada hewan atau ternak antara

lain adalah dapat memacu pertumbuhan, memperbaiki konversi ransum,

mengontrol kesehatan antara lain dengan mencegah terjadinya gangguan

pencernaan terutama pada hewan-hewan muda (Budiansyah, 2004).

Daging itik juga merupakan salah satu sumber kolesterol yang apabila

terus dikonsumsi akan menyebabkan penyumbatan pada pembuluh darah

sehingga dapat mengakibatkan strok dan serangan jantung. Hal ini menyebabkan

kurangnya konsumsi itik oleh masyarakat, sehingga penurunan kadar kolesterol

pada itik perlu diupayakan (Budiansyah, 2004).

Penelitian yang telah dilakukan dengan menggunakan probiotik untuk

penurunan kadar kolesterol adalah pada telur ayam dengan persentase penurunan

5% pemberian 3,2 x 106 CFU/g Bacillus subtilis (Mahdavi et al., 2005). Yousefi

dan Karkoodi (2007) juga sudah telah melakukan penelitian pada ayam broiler,

dimana penurunan kadar kolesterol pada kuning telur ayam dengan pemberian

probiotik Thepax® yaitu 9% (dengan pemberian 0,05% probiotik) dan pemberian

Saccaromyces (ragi) yaitu 7,3% (dengan pemberian 0,15% ragi). Penurunan

kolesterol pada kuning telur ayam dengan pemberian Lactococcus plantarum asal

blondo dalam ransum ayam petelur menurunkan kadar kolesterol kuning telur

pada pemberian 3 ml (3,9 x 108 CFU/g) probiotik dengan persentase penurunan

53,6% (Purwati, 2011).

17

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Erlenmeyer, inkubator,

oven, neraca analitik, pipet tetes, tabung reaksi, cawan petri, jarum ose,

mikroskop, gelas objek, hot plate, corong, batang pengaduk, tabung durham,

lemari pendingin, penjepit tabung, rak tabung reaksi, spoit, termos, autoklaf,

scalpel, mortal, pastel, dan jangka sorong.

III.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah usus segar itik, air

suling, alkohol 70%, medium selektif MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar)

(ACUMEDIA), medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (MERCK), reagen H2O2,

medium SIM (Sulfid Indol Motility) (MERCK), medium MR-VP (Methyl Red-

Voges Proskauer) (MERCK), medium NA (Nutrien Agar) (MERCK), KOH 40%,

alfanaftol, metil-red, pewarnaan gram (Kristal Violet, lugol, alkohol-aseton, dan

safranin), NaCl fisiologis, HCl 0,1 N, garam empedu sintetik (ox bite) dengan

konsentrasi 1% dan 5%, minyak emersi, kapas, paper disk, kertas lakmus, dan

aluminium foil.

III.3 Prosedur Kerja

III.3.1 Sterilisasi Alat dan Medium

a. Alat-alat gelas berupa tabung reaksi, cawan petri, gelas objek dan pipet tetes

disterilkan dengan sterilisasi panas kering (udara panas) pada oven. Sterilisasi

dilakukan pada temperatur 170⁰- 180O C selama 1-2 jam (Lay dan Hastowo,

1992).

18

b. Jarum ose disterilkan dengan sterilisasi panas kering dalam nyala api bunsen

sampai merah membara (Dwyana dan Gobel, 2011).

c. Medium dan alat non-gelas yang digunakan terlebih dahulu disterilkan

dengan sterilisasi panas basah yaitu dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi

ini dilakukan selama 15 menit dalam temperatur 121OC dan tekanan 2 atm

(Lay dan Hastowo, 1992).

III.3.2 Pengambilan Sampel

Sampel diperoleh dari peternakan itik pedaging. Itik lalu dipotong dan

bagian anterior jejunum dan kloaka diikat terlebih dahulu kemudian usus tersebut

dimasukkan ke dalam plastik sampel dan dibawa ke laboratorium lalu disimpan

pada freezer sampai penelitian dilakukan.

III.3.3 Pembuatan Medium

Pembuatan medium (Dwyana dan Gobel, 2011) :

a. Medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar)

Sebanyak 6,2 g medium MRSA dan CaCO3 1% dilarutkan ke dalam 100

mL air suling dan dibuat dalam pH 6,2. Kemudian dipanaskan sambil diaduk

sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-

masing sebanyak 25 mL. Kemudian mulut masing-masing erlenmeyer ditutup

dengan menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu

121 O C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

b. Medium MRSB(Man Ragosa Sharpe Broth)

Sebanyak 5,2 g medium MRSB dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dan

dibuat dalam pH 6,2. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen.

Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak

19

25 mL. Lalu mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan menggunakan

aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C dan tekanan 2

atm selama 15 menit.

c. Medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Sebanyak 6,5 g medium TSIA dilarutkan ke dalam 100 mL air suling,

dibuat dengan pH 7,4. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen.

Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak

25 mL. Kemudian mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan

menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C

dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

d. Medium MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer)

Sebanyak 1,7 g medium MR-VP dilarutkan ke dalam 100 mL air suling,

dibuat dengan pH 6,9. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen.

Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak

25 mL. Selanjutnya mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan

menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C

dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

e. Medium SIM (Sulfid Indol Motility)

Sebanyak 3 g medium SIM dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dibuat

dengan pH 7,3. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen.

Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak

25 mL. Selanjutnya mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan

menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C

dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

20

f. Medium NA (Nutrien Agar)

Sebanyak 2,3 g medium NA dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dibuat

dengan pH 7,3. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen.

Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah Erlenmeyer masing-masing sebanyak

25 mL. Selanjutnya mulut masing-masing Erlenmeyer ditutup dengan

menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dengan autoklaf dengan suhu 121⁰ C

dan tekanan 2 atm selama 15 menit

III.3.4 Isolasi Bakteri Probiotik

Usus itik dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sampai lunak, kemudian

secara aseptis, bagian dalam (isi) usus itik dikerok dengan menggunakan scalpel.

Hasil kerokan tersebut kemudian dihaluskan dengan menggunakan mortal dan

pastel lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer steril dan diencerkan dengan larutan

NaCl fisiolgis steril dengan pengenceran 10-1

, 10-2

, dan 10-3

.

Sebanyak 1 mL hasil pengenceran tadi kemudian diinokulasikan pada

medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar) yang mengandung CaCO3 1 %

kemudian diinkubasikan pada suhu 37OC selama 2-3x24 jam. Koloni yang

menunjukkan zona bening disekitar koloni menunjukkan bahwa koloni tersebut

adalah bakteri asam laktat.

III.3.5 Tahap Pemurnian Kultur Bakteri

Pemurnian dimulai dengan memilih koloni-koloni yang disekitarnya

terdapat zona bening.

Mensterilkan jarum ose, lalu disentuhkan pada permukaan koloni bakteri

kemudian diinokulasikan pada permukaan medium MRSA yang mengandung

21

CaCO3 1% dengan metode gores untuk mendapatkan koloni yang terpisah.

Diinkubasikan pada suhu 37OC selama 2x24 jam. Tahap pemurnian dapat

dilakukan 2-3 kali, untuk lebih menyakinkan bahwa koloni yang terbentuk benar-

benar murni atau tidak.

III.3.6 Pengamatan Morfologi

Morfologi setiap koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian

kemudian diamati. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk koloni (shape),

bentuk tepi (edge), warna (colour), permukaan koloni (elevation), dan bau (odor).

a. Pengecatan Gram

Pengamatan morfologi koloni dilakukan dengan teknik pewarnaan gram.

Pertama-tama ulasan bakteri dibuat pada gelas objek dan dilakukan fiksasi.

Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan pada koloni bakteri, diamkan

selama 60 detik. Kemudian preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir lalu

dikeringanginkan. Sebanyak 2-3 tetes gram B (larutan lugol) diteteskan di atas

preparat dan dibiarkan selama 60 detik. Preparat dicuci dengan air mengalir lalu

dikeringanginkan. Preparat kemudian ditetesi 2-3 tetes larutan alkohol-aseton dan

dibiarkan selama 60 detik lalu dicuci kembali dan dikeringanginkan. Selanjutnya

preparat ditetesi dengan larutan safranin sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama

60 detik, lalu dicuci dan dikeringanginkan. Setelah itu diamati di bawah

mikroskop.

III.3.7 Pembuatan Stok Bakteri

Setiap koloni tunggal yang berbeda dan terbentuk setelah pemurnian

kemudian masing-masing diinokulasikan pada medium MRSA miring untuk

persiapan pengujian selanjutnya.

22

III.3.8 Uji Probiotik

a. Uji Ketahannan Terhadap Keasaman Lambung (pH)

Menurut Djide dan Wahyuddin (2008), uji ketahanan terhadap asam

dilakukan dengan menggunakan medium MRSB yang ditambahkan dengan HCl

0,1 N untuk mendapatkan pH 2,5-3 (sesuai dengan pH lambung). Sebanyak 1 ose

(ose bulat) masing-masing isolat bakteri yang diambil dari stok kultur kemudian

diinokulasikan pada medium MRSB-HCl. Diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu

37OC. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium MRSB-HCl,

dan hasil negatif apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium MRSB-

HCl.

b. Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu

Medium MRSB ditambahkan dengan garam empedu sintetik (ox bite),

dengan konsentrasi 1% dan 5%. Sebanyak 1 ose (ose bulat), masing-masing isolat

bakteri yang diambil dari stok kultur diinokulasikan pada medium MRSB-garam

empedu, lalu inkubasi selama 2-3 x24 jam pada suhu 37OC (Djide dan

Wahyuddin, 2008). Hasil diperoleh dari perbandingan jumlah koloni bakteri yang

tumbuh sebelum dan sesudah inkubasi.

III.3.9 Uji Fisiologis Probiotik

a. Uji Ketahanan Temperatur (Suhu)

Sebanyak 1 ose (ose bulat), masing-masing isolat bakteri yang diambil

dari stok kultur diinokulasikan pada medium MRSB dalam tabung reaksi.

Selanjutnya diinkubasi pada suhu 15OC, 37

OC, dan 45

OC selama 2 x 24 jam. Hasil

positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium dan hasil negatif apabila

tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium.

23

III.3.10 Uji Biokimia

a. Uji MR (Methyl Red)

Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan

diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya

diinkubasi selama 5x24 jam pada suhu 37OC. Sebanyak 5 tetes methyl-red

ditambahkan di atas preparat isolat bakteri. Hasil positif apabila terbentuk

kompleks berwarna merah muda sampai merah yang menandakan bahwa mikroba

tersebut menghasilkan asam.

b. Uji VP (Voges Proskauer)

Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan

diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya

diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 37OC. Medium kemudian ditambahkan 0,2

mL KOH 40% dan 0,6 mL alfanaftol lalu dikocok selama 30 detik. Hasil positif

jika medium berubah warna lembayung.

c. Uji Motilitas

Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan

dengan cara ditusuk pada medium SIM tegak, lalu diinkubasi pada suhu 37OC

selama 2x 24 jam. Hasil positif (motil) apabila terdapat rambatan-rambatan di

sekitar bekas tusukan jarum pada medium dan hasil negatif (non motil) bila tidak

terdapat rambatan-rambatan disekitar bekas tusukan jarum ose pada medium.

d. Uji Katalase

Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose (ose bulat) dari masing-masing stok

kultur kemudian dicelupkan ke dalam reagen H2O2 yang telah diisi ke dalam

24

tabung reaksi. Hasil positif apabila terbentuk gelembung gas pada ose, dan hasil

negatif apabila tidak terbentuk gelembung gas.

e. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose (ose lurus) dari masing-masing stok

kultur kemudian diinokulasikan dengan cara ditusukkan pada medium TSIA.

Kemudian diambil lagi 1 ose (ose bulat) isolat bakteri dari masing-masing stok

kultur dan digores pada permukaan medium. Selanjutnya diinkubasi selama 2-

3x24 jam pada suhu 37OC. Perubahan yang diamati setelah inkubasi adalah warna

medium menjadi kuning menandakan asam, warna medium menjadi lebih merah

menandakan medium menjadi basa, warna menjadi hitam menandakan

terbentuknya H2S dan bila medium terangkat menandakan bahwa mikroba

tersebut mampu untuk memproduksi gas.

III. 3. 11. Uji Daya Hambat Terhadap Bakteri Patogen

Untuk mengetahui bahwa isolat bakteri mempunyai potensi yang bagus

sebagai bakteri probiotik maka perlu dilakukan uji daya hambat terhadap bakteri

patogen. Bakteri patogen yang digunakan adalah Staphylococcus aureus (bakteri

gram positif) dan Escherichia coli (bakteri gram negatif).

Langkah awal yang perlu dilakukan adalah menginokulasi 1 ose (ose

bulat) isolat dari stok kultur pada medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar)

miring dan diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37°C. Hal yang sama dilakukan

terhadap bakteri uji (Staphylococcus aureus dan Escherichia coli) yang

diinokulasikan pada medium NA (Nutrien Agar) miring dan diinkubasikan selama

1x24 jam pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, 5 ml aquades steril ditambahkan ke

dalam inokulum kemudian divortex agar koloni bakteri yang menempel pada

25

permukaan medium dapat larut. Suspensi bakteri kemudian dipindahkan ke cuvet

lalu dilakukan spektrofotometri untuk mendapatkan keadaan 25%T dalam sampel

dimana aquades digunakan sebagai blanko.

Sebanyak 1 ml masing-masing isolat Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli diinokulasikan pada medium pada medium NA dengan metode

tuang dan dibiarkan memadat. Sementara itu siapkan paper disk steril lalu

direndam dalam masing-masing suspensi isolat probiotik selama 10 menit.

Kemudian paper disk diletakkan di permukaan medium NA yang telah memadat,

lalu diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37°C. Diameter zona bening yang

terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong.

26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi bakteri probiotik asam laktat dilakukan dengan menggunakan

medium MSRA + CaCO3 1% dan dilakukan inkubasi selama 2x24 jam. Setelah

inkubasi diperoleh koloni-koloni yang memperlihatkan zona bening disekitar

koloni. Isolasi koloni bakteri yang memiliki zona bening di sekitarnya diambil

dari pengenceran 10-3

karena pada pengenceran ini koloni-koloni sudah terpisah

seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 1 . Isolat Bakteri A-H Hasil Isolasi Bakteri Probiotik dari

Saluran Pencernaan Itik Pedaging

Berdasarkan hasil isolasi diperoleh 8 koloni yang memperlihatkan zona

bening pada medium MRSA + CaCO3 1%. Menurut Rahayu dan Margino (1997),

bakteri asam laktat memiliki sifat fisiologis yang sangat bervariasi. Medium yang

B

C

D

E

F

H

G

A

27

direkomendasikan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat adalah medium

MRSA (Man Rogosa Sharpe Agar) yang merupakan medium selektif untuk

menumbuhkan bakteri asam laktat. Sedangkan penambahan CaCO3 1% bertujuan

untuk menyeleksi bakteri asam laktat yang tumbuh pada medium maka setelah

inkubasi 1 x 24 jam akan terlihat zona bening di sekitar koloni bakteri yang

tumbuh. Hal ini disebabkan karena dalam masa pertumbuhannya selama inkubasi

bakteri asam laktat menghasilkan asam laktat yang bereaksi dengan CaCO3 yang

tidak larut di dalam medium sehingga membentuk kalsium laktat yang larut,

dengan menunjukkan adanya daerah atau zona bening disekitar koloni bakteri

yang tumbuh (Djide dan Sartini, 2008).

Selanjutnya dilakukan pemurnian pada kedelapan koloni, kemudian

dilakukan pengamatan morfologi koloni. Adapun ciri-ciri morfologi dari

kedelapan koloni yang berhasil diperoleh, dapat dilihat dari pada tabel 1 di bawah

ini.

Tabel 1. Morfologi Koloni Isolat Bakteri Probiotik yang Diperoleh

Isolat Bentuk Koloni

Bentuk Tepi Bentuk permukaan Warna Bau

A Bulatan kecil Rata Cembung Putih Berbau

B Bulatan kecil Rata Cembung Putih Berbau

C Bulatan Besar Rata Cembung Putih Berbau

D Bulatan kecil Rata Cembung Putih Berbau

E Bulatan Besar Rata Cembung Putih Berbau

F Bulatan kecil Rata Cembung Putih

Kekuningan Berbau

G Bulatan Besar Rata Cembung Putih Berbau

H Bulatan kecil Rata Cembung Putih Berbau

Setelah diperoleh kultur murni dari kedelapan isolat bakteri yang

diinginkan, maka selanjutnya dibuat dalam stok bakteri dalam agar miring untuk

persiapan uji-uji yang akan dilakukan.

28

Pengamatan morfologi bakteri probiotik asam laktat dilakukan dengan

pengecatan Gram. Hasil dari pengecatan Gram dapat dilihat dari gambar 2 dan

tabel 2 berikut.

Isolat A Isolat B

Isolat C Isolat D

Isolat E Isolat F

Isolat G Isolat H

Gambar 2. Hasil Pengamatan Pengecatan Gram dengan Perbesaran

100x10

29

Tabel 2. Hasil Pengecatan Gram dan Karakteristik Isolat Berdasarkan

pertumbuhan isolat pada kondisi pH, garam empedu, dan Suhu

yang berbeda.

Nama

Isolat

Karakteristik

Pengecatan

Gram

Ketahanan

Asam (pH)

Ketahanan

Garam Empedu

Ketahanan Suhu

(O

C)

Bentuk Gram 2,5 3 1% 5% 15 37 45

A Basil Positif +++ +++ +++ +++ + +++ ++

B Coccus Negatif +++ +++ ++ +++ + +++ ++

C Basil Positif +++ +++ +++ +++ + +++ ++

D Coccus Negatif + + ++ ++ + ++ +

E Coccus Positif ++ ++ + + + ++ +

F Coccus Positif ++ ++ + + + ++ +

G Coccus Positif + ++ ++ + + ++ +

H Coccus Positif +++ +++ +++ +++ + +++ ++ Keterangan :Coccus = bulat, basil = batang; +++ = sangat keruh dan banyak endapan, ++ = keruh

dan cukup banyak endapan, + = tidak keruh dan sedikit endapan.

Berdasarkan pewarnaan Gram, dapat pula diketahui sifat dinding sel

bakteri terhadap cat pewarna kristal violet dan safranin. Bakteri yang menyerap

Gram A (Kristal violet) akan tetap berwarna ungu setelah pelunturan dengan

Gram C (Alkohol aseton) disebut Bakteri Gram positif , sedangkan bakteri yang

warna ungunya luntur pada pencucian dengan alkohol, akan menyerap zat warna

Gram D (Safranin) sehingga akan berwarna merah muda disebut Bakteri Gram

negatif (James, et al., 2008).

Menurut Campbell, et al. (2003), struktur dinding sel akan menentukan

respon pewarnaan. Bakteri diwarnai dengan suatu zat warna violet dan yodium,

dibilas dengan alkohol dan kemudian diwarnai sekali lagi dengan zat warna

merah. Bakteri Gram Positif yang sebagian besar dinding selnya mengandung

peptidoglikan akan menjerat warna violet. Bakteri Gram Negatif memiliki lebih

sedikit peptidoglikan, yang terletak di suatu gel periplasmik antara membran

plasma dan suatu membran bagian luar. Zat warna violet yang digunakan dalam

30

pewarnaan gram sangat mudah dibilas dari bakteri gram negatif, akan tetapi

selnya tetap menahan zat warna merah.

Berdasarkan hasil pewarnaan gram diperoleh 2 macam bentuk yaitu Basil

(Batang) yaitu isolat A dan C, serta bentuk Coccus (Bulat) yaitu isolat B, D, E, F,

G, dan H. Menurut Surono (2004) bakteri asam laktat ada yang berbentuk Batang

(Basil) dan ada pula yang berbentuk bulat (Coccus). Dari pewarnaan gram

diperoleh pula sifat gram isolat yaitu isolat A, C, E, F, G, dan H bersifat gram

positif, sedangkan isolat B dan D memiliki sifat gram negatif. Menurut Cullimore

(2000) bakteri asam laktat memiliki sifat gram positif tetapi ada juga yang bersifat

bipolar (gram positif dan gram negatif ) yang kemungkinan terjadi akibat

granulasi dalam sel dan faktor umur kultur.

Bakteri probiotik harus mampu bertahan dalam menghadapi rintangan-

rintangan dalam saluran pencernaan agar dapat mencapai usus halus dalam

keadaan tetap hidup serta dalam jumlah yang cukup memadai untuk berkembang

biak dan menyeimbangkan mikrobiota dalam usus (Surono, 2004).

Kondisi saluran pencernaan erat kaitannya dengan pH yang berbeda

beda. Salah satu faktor yang menonjol dalam menentukan kadar pH dalam saluran

pencernaan adalah keasaman asam lambung. Kondisi keasaman lambung

berfungsi sebagai pintu gerbang pertama untuk melakukan seleksi mikroba

sebelum masuk ke usus (Khan dan Wiyana, 2011).

Dari hasil uji terhadap kadar keasaman (pH), terlihat bahwa kedelapan

isolat mampu tumbuh pada medium yang memiliki derajat keasaman (pH) 2,5-3.

Hal ini terlihat dari koloni bakteri yang tumbuh pada dasar tabung reaksi dan

kondisi media yang keruh. Isolat A, B, C, dan H menunjukkan pertumbuhan yang

31

bagus dilihat dari adanya banyak endapan pada tabung. Sedangkan isolat D, E, F,

dan G menunjukkan hasil yaitu media menjadi agak keruh pada pH 2,5 dan 3.

Semua isolat baik yang bersifat Gram positif ( A, C, E, F, G, dan H) maupun

Gram negatif (B dan D), mampu tumbuh pada kadar pH 2,5 dan 3. Hasilnya dapat

dilihat pada gambar berikut.

A B C D E F G H A B C D E F G H

(1) (2)

Gambar 3. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Keasaman (pH)

(1) MRSB dengan pH 2,5

(2) MRSB dengan pH 3

Uji probiotik terhadap ketahanan pH menurut Djide dan Wahyudi (2008)

dilakukan dengan menggunakan medium MRSB yang ditambah HCl 0,1 N untuk

mendapatkan pH 2,5-3 (sesuai pH lambung). Berdasarkan hasil pengujian isolat

bakteri probiotik mampu tumbuh pada pH 2,5-3. Hal ini membuktikan isolat BAL

tersebut mampu untuk melewati asam lambung sehingga dapat dimanfaatkan

sebagai bakteri probiotik. pH medium biakan mempengaruhi kecepatan

pertumbuhan, untuk pertumbuhan bakteri juga terdapat rentang pH dan pH

optimal. Meskipun medium pada awalnya dikondisikan dengan pH yang

32

dibutuhkan untuk pertumbuhan, tetapi secara bertahap pertumbuhan akan dibatasi

oleh produk metabolit yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut.

Bakteri asam laktat mampu mempertahankan pH intraseluler lebih alkali

daripada pH ekstraseluler, tetapi penurunan pH intraseluler tetap berlangsung

seiring dengan menurunnya pH ekstraseluler yang mendukung toleransinya

terhadap asam (Siegumfeldt et al., 2000). Bakteri dapat menurunkan pH

intraseluler sekitar menjadi netral pada saat pH ekstraseluler turun, tetapi akan

menggunakan banyak energi karena perbedaan gradien proton yang besar dan

mengakibatkan terjadinya akumulasi anion asam organik dalam sitosol yang

beracun bagi sel (Russel, 1992).

Untuk menguji potensi bakteri asam laktat sebagai bakteri probiotik,

bakteri asam laktat tidak hanya harus tahan terhadap pH rendah, akan tetapi juga

harus tahan terhadap garam empedu. Menurut Russel (1992), ketahanan terhadap

derajat keasaman dan garam empedu merupakan ciri yang penting bagi bakteri

asam laktat sebab menentukan aktivitasnya dalam saluran pencernaan, terutama di

saluran usus bagian atas tempat empedu disekresikan. Kemampuan kultur

probiotik meningkatkan kolonisasi laktobasili pada bagian atas usus dapat

mengendalikan pertumbuhan patogen usus yang memasuki sistem pencernaan.

Berdasarkan hasil pengujian ketahanan bakteri asam laktat terhadap

garam empedu sintetik, setalah 1x24 jam terlihat adanya endapan pada dasar

tabung pada isolat A,B,C,dan H, sedangkan pada isolat D, E, F, dan G medium

menjadi lebih keruh. Hal ini menadakan bahwa terjadi pertumbuhan bakteri pada

medium MRSB yang telah ditambahi garam empedu sintetik 1 % dan 5 %, seperti

yang terlihat pada gambar di bawah ini.

33

D C B A H G F E

(a)

D C B A H G F E

(b)

Gambar 4. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Garam Empedu

(a) MRSB + Garam Empedu Sintetik 1%

(b) MRSB + Garam Empedu Sintetik 5%

Dari hasil pengujian diperolah data bahwa isolat A, B, C, dan H

menunjukkan pertumbuhan pada kadar garam empedu sintetik 1%, dan adanya

endapan pada dasar tabung menunjukkan bahwa isolat tersebut bersifat anaerob.

Isolat D, E, F, dan G juga mampu untuk tumbuh pada kadar garam empedu

sintetik 1% vdan 5% dan membuat media menjadi keruh tanpa endapan. Hal ini

menunjukkan bahwa isolat tersebut tersuspensi pada media sehingga memiliki

sifat anaerob fakultatif. Semua isolat baik yang bersifat Gram positif maupun

Gram negatif, mampu tumbuh pada kadar garam empedu 1% dan 5%.

Menurut Dwyana dan Gobel (2011), pertumbuhan bakteri dalam tabung

memperlihatkan perbedaan respon terhadap oksigen atmosferik, bila bakteri

berkumpul di permukaan tabung makan bersifat aerob, bila bakteri berkumpul di

dasar tabung maka bersifat anaerob, namun apabila bakteri tersuspensi merata

pada media dalam tabung maka bersifat anaerob fakultatif. Surono (2004)

34

mengemukakan bahwa baktero probiotik bersifar anaerob sampai anaerob

fakultatif.

Penelitian yang dilakukan oleh Djide dan Wahyudin (2008),

membuktikan bahwa isolat bakteri asam laktat mampu tumbuh pada medium yang

telah ditambahkan garam empedu sintetik 1 % dan 5%. Hal ini berarti bahwa

isolat BAL tersebut mampu melewati saluran pencernaan dimana terdapat garam

empedu yang disekresikan oleh hati sehingga dapat digunakan sebagai bakteri

probiotik.

Garam empedu berpengaruh terhadap permeabilitas sel bakteri

(Kusumawati, et al., 2003). Bakteri yang tidak tahan terhadap garam empedu

diduga mengalami permeabilitas membran sel sehingga mengalami kebocoran

materi intraselular yang besar dan menyebabkan lisisnya sel. Garam empedu

memiliki sifat sebagai senyawa aktif permukaan sehingga dapat menembus dan

bereaksi dengan sisi membran sitoplasma yang selanjutnya menyebabkan

perubahan dan kerusakan struktur membran. Keragaman struktur asam lemak

pada membran sel bakteri menyebabkan perbedaan permeabilitas dan diduga akan

mempengaruhi ketahan bakteri terhadap garam empedu (Kusumawati, et al.,

2003).

Salah satu faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan,

perbanyakan dan daya tahan bakteri yaitu suhu. Berdasarkan hasil pengamatan

terlihat bahwa kedelapan isolat mampu tumbuh pada suhu 15OC, 37

OC, dan 45

OC.

Akan tetapi pertumbuhan terlihat lebih baik pada suhu 37OC sehingga dapat

dikatakan bahwa isolat probiotik BAL baik yang bertipe Gram positif maupun

35

tipe Gram negatif bersifat termofilik. Hasil pengujian terhadap beberapa kondisi

suhu yang diberikan dapat dilihat pada gambar berikut.

D E G F A B C H

(a)

A B C H D E F G

(b)

D E F G A B C H

(c)

Gambar 5. Hasil Uji Temperatur/Suhu

(a) Inkubasi pada Suhu 37 O

C,

(b) Inkubasi pada Suhu 45 O

C

(c) Inkubasi pada Suhu 15 O

C

36

Bakteri asam laktat dibagi atas dua kelompok berdasarkan suhu, yaitu

mesofilik, yang tumbuh optimum pada suhu 25OC dan tumbuh maksimum pada

rentang suhu 37- 40 OC, dan termofilik yang tumbuh optimum pada suhu 37- 45

OC, dan suhu maksimumnya adalah 45- 52

OC (Saruno, 2004).

Uji MR (Methyl Red) merupakan uji yang digunakan untuk menentukan

adanya fermentasi asam campuran oleh bakteri. Dari hasil penelitian terlihat

bahwa semua isolat positif terhadap uji MR baik itu pada isolat probiotik BAL

Gram positif maupun Gram negatif. Hasil positif ditandai dengan berubahnya

warna medium dari kuning menjadi kemerah-merahan setelah ditetesi reagen

Methyl Red. Pada penelitian yang telah dilakukan oleh Fadlya (2008) diketahui

bahwa isolat BAL yang diperoleh dari beberapa sumber menunjukkan hasil yang

positif terhadap uji MR yang ditandai dengan adanya perubahan warna medium

dari kuning menjadi merah. Hal ini berarti bahwa isolat tersebut dapat

memfermentasikan karbohidrat menghasilkan asam campuran seperti yang terlihat

pada gambar berikut.

F G E D A B C H

Gambar 6. Hasil Uji MR (Methyl Red)

37

Bila suatu bakteri memfermentasikan glukosa di dalam medium MR-VP,

produk yang dihasilkan biasanya asam laktat, asam asetat, asam suksinat, dan

asam format. Akumulasi dari asam-asam ini dapat menurunkan pH sampai 5 atau

kurang. Bila idikator merah (Methyl Red) ditambahkan pada biakan tersebut,

maka medium yang mengandung asam-asam tersebut akan merubah warna

medium menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa mikroorganisme ini

merupakan penghasil asam campuran. Menurut Raihana (2011), hasil uji

dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk cincin merah atau medium berubah

menjadi warna merah dan mengindikasikan bahwa sangat sedikit atau tidak ada

asam organik yang tersisa di medium.

Uji VP (Voges Preskauer) digunakan untuk membedakan antara

organisme yang menghasilkan asam dalam jumlah yang besar dan yang

menghasilkan produk netral seperti asetilmetilkarbonil (asetoin) dari hasil

metabolisme glukosa. Produk netral ini membuat bakteri dapat memfermentasi

karbohidrat dalam jumlah yang besar. Adanya kandungan asetoin yang diproduksi

dalam larutan ditandai dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi

merah muda hingga merah tua.

Ini juga digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang dapat

menfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butadiol sebagai produk utama, dan akan

terjadi penumpukan bahan tersebut dalam medium pertumbuhan. Penambahan

40% KOH dan 5% α-naftol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin

(asetilmetilkarbonil) yakni suatu senyawa awal dalam sintesis 2,3-butanadiol.

Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu

menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan α-

38

naftol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan

dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi

asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.

Berikut adalah hasil pengamatan uji VP untuk kedelapan isolat bakteri

probiotik BAL dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

A B C H F G E D

Gambar 7. Hasil Uji VP (Voges Preskauer)

Uji VP merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3-

butanadiol karena dalam uji ini yang terdeteksi adalah pembentukan asetoin.

Namun karena asetoin merupakan senyawa awal dalam pembentukan 2,3-butadiol

dan selalu diperoleh secara serentak, sehingga uji VP dapat digunakan untuk

menentukan adanya 2,3-butadiol (Lay, 1994).

Hasil penelitian menunjukkan isolat Gram positif yaitu isolat A, C, E, G,

dan H serta isolat Gram negatif yaitu isolat B menunjukkan hasil yang negatif

terhadap uji VP. Hal ini terlihat dengan tidak berubahnya warna medium setelah

ditambahkan larutan indikator KOH 40% dan alfanaftol 5%. Hasil negatif ini

menunjukkan bahwa ke-6 isolat tersebut tidak menghasilkan 2,3-butanadiol

39

ataupun asetoin. Kalaupun ada, jumlahnya tidak mencukupi untuk mengubah

warna medium setelah ditambahkan indikator. Kedua isolat lainnya yaitu isolat D

(Gram Negatif) dan F (Gram positif) menunjukkan hasil yang positif, dengan

terbentuknya komplek warna lembayung pada medium. Hal ini membuktikan

bahwa isolat tersebut menghasilkan 2,3-butanadiol atau asetoin. Hasil penelitian

yang telah dilakukan Fadlya (2008), isolat BAL yang diisolasi dari beberapa

sumber menunjukkan hasil yang negatif terhadap uji VP.

Tabel 3. Hasil uji TSIA, MR-VP, Motilitas, dan Katalase

Nama

Isolat

Uji TSIA Uji

MR Uji VP Motilitas Katalase

Slant Butt Gas H2S

A Kuning Kuning - - Merah Kuning - -

B Kuning Kuning - - Merah Kuning - -

C Kuning Kuning - - Merah Kuning - -

D Kuning Kuning - - Merah Lembayung - -

E Kuning Kuning - - Merah Kuning - -

F Kuning Kuning - - Merah Lembayung - -

G Kuning Kuning - - Merah Kuning - -

H Kuning Kuning - - Merah Kuning - -

Motilitas merupakan kemampuan suatu mikroba bergerak sendiri (Volk,

1988). Sifat motilitas pada bakteri dapat dilihat dengan pertumbuhan yang

menyebar disekeliling tempat penusukan kultur atau adanya penyebaran yang

berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi, yang berarti bahwa bakteri ini

memiliki flagel (Fardiaz, 1993).

Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa kedelapan baik isolat

Gram positif maupun Gram negatif merupakan bakteri non-motil. Hal ini dapat

dilihat dengan tidak adanya rambatan di sekitar bekas tusukan jarum ose seperti

pada gambar di bawah ini.

40

A B C D E F G H

Gambar 8. Hasil Uji Motilitas

Hampir semua sel bakteri spiral dan sebagian sel bakteri yang berbentuk

batang bersifat motil (bergerak), sedangkan bakteri yang berbentuk bulat bersifat

non motil (tidak bergerak). Savadago et al. (2006) menjelaskan bahwa bakteri

asam laktat terdiri dari sekelompok bakteri Gram positif, tidak membentuk spora

serta berbentuk batang dan bulat yang bersifat non motil. Menurut Cullimore

(2000) bakteri asam laktat bak yang bersifat Gram Positif maupun yang besifat

bipolar (Gram positif dan Gram negatif) memiliki sifat non-motil.

Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri

yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat

memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk

pertumbuhan aerobik karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai

enzim respirasi bersifat racun terhadap sel mikroba. Berikut ini adalah hasil uji

katalae terhadap isolat bakteri probiotik terlihat pada gambar di bawah ini.

41

C A D H B E F G

Gambar 9. Hasil Uji Katalase

Hasil uji menunjukkan bahwa kedelapan isolat baik isolat Gram positif

maupun Gram negatif menunjukkan hasil yang negatif terhadap uji katalase. Hal

ini dibuktikan dengan tidak terbentuknya gelembung udara (O2) pada saat isolat

dimasukkan ke dalam larutan H2O2. Djide dan Sartini (2008) mengemukakan

bahwa dari hasil uji biokimia berupa uji katalase terhadap bakteri asam laktat

menunjukkan hasil yang negatif.

Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan

respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H2O2.

Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase maka

segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya

sendiri. Bakteri katalse positif akan memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 dimana

parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya

gelembung-gelembung oksigen. Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan

gelembung-gelembung. Hal ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh

bakteri katalase negatif sehingga tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase

negatif tidak memiliki enzim katalase yang mengurai H2O2.

42

Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) menurut Russel (1992) umumnya

digunakan terutama untuk mengidentifikasi Enterobacteriaceae dengan bakteri

saluran pencernaan yang bersifat gram negatif yang lain dilihat dari

kemampuannya dalam mengkatabolisme glukosa, laktosa, atau sukrosa dan

membebaskan sulfida dari FeSO4 (Harley dan Prescott, 2002). Dalam medium

TSIA mengandung 3 macam gula (glukosa, laktosa, dan sukrosa), indikator merah

dan ferosulfat (Lay, 1994). Pada uji TSIA dapat diketahui terjadinya fermentasi

glukosa, laktosa, dan/atau sukrosa, produksi gas dari glukosa, dan produksi

hidrogen sulfida (H2S).

Tabel 4 : Identifikasi Hasil Fermentasi Bakteri pada Medium TSIA

(Fadlya, 2008) :

Agar Miring (Slant) Agar Tegak (Butt) Katerangan

Merah (basa) Kuning (asam) Hanya glukosa yang difermentasi

Kuning (asam) Kuning (asam) Glukosa, laktosa, dan/atau

sukrosa difermentasi

Kuning (asam) Merah (basa) Laktosa dan sukrosa difermentasi

Merah (basa) Marah (basa) Ketiga gula tidak difermentasi

Pembentukan H2S dapat diamati dengan terbentuknya warna kehitaman

pada bekas goresan, dan pembentukan gas dapat dilihat dengan terbentuknya

rongga pada bagian bawah agar (Fadlya, 2008). Hasil uji menunjukkan bahwa

pada bagian Slant dan Butt medium TSIA kedelapan isolat setelah inkubasi 1x24

jam menunjukkan warna kuning yang berarti besifat asam. Hal ini menandakan

telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa, dan atau sukrosa pada isolat Gram positif

maupun Gram negatif, karena sukrosa dan laktosa memiliki konsentrasi yang

lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bahan fermentasi selanjutnya

jika glukosa habis dan akan menghasilkan asam yang ditandai dengan warna

kuning pada media setelah inkubasi 24 jam. Malaka dan Laga (2005) menjelaskan

43

bahwa ada jenis bakteri asam laktat yang mampu untuk menfermentasi ketiga

jenis gula yang terdapat dalam medium TSIA, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa.

Berikut adalah gambar hasil uji TSIA.

A B C H G E F D

Gambar 10. Hasil Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Hasil uji menunjukkan bahwa pada bagian Slant dan Butt medium TSIA

kedelapan isolat setelah inkubasi 1x24 jam menunjukkan warna kuning yang

berarti besifat asam. Hal ini menandakan telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa,

dan atau sukrosa pada isolat Gram positif maupun Gram negatif, karena sukrosa

dan laktosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan

sebagai bahan fermentasi selanjutnya jika glukosa habis dan akan menghasilkan

asam yang ditandai dengan warna kuning pada media setelah inkubasi 24 jam.

Malaka dan Laga (2005) menjelaskan bahwa ada jenis bakteri asam laktat yang

mampu untuk menfermentasi ketiga jenis gula yang terdapat dalam medium

TSIA, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa.

Untuk melihat kemampuan ke delapan isolat bakteri probiotik asam lakat

dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen maka dilakukan uji daya

44

hambat terhadap bakteri patogen tersebut. Bakteri uji yang digunakan yaitu

Escherichia coli (Gram negatif) dan Staphylococcus aureus (Gram Positif)

dengan waktu inkubasi selama 2 x 24 jam untuk mengetahui kemampuannya

dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen (antibakteri) apakah bakteri

probiotik yang diuji bersifat bakteriostatik atau bakteriosida.

Bakteri asam laktat (BAL) biasanya memproduksi bakteriosin yang

merupakan peptida dengan sifat sebagai antibakteri yang menyerang suatu strain.

Bakteriosin mampu meningkatkan kemampuan dari BAL terhadap pencegahan

dari pertumbuhan bakteri yang berbahaya disamping karena menghasilkan

lingkungan yang asam bagi bakteri lain (Jeevaratnam, et al., 2003). Surono (2004)

menjelaskan bahwa beberapa jenis bakteri asam laktat menghasilkan bakteriosin,

suatu peptida yang bersifat antibakteri, toksin yang berupa protein yang dapat

mencegah pertumbuhan bakteri.

Tabel 5 : Hasil Pengukuran Zona Bening Pada Uji Daya Hambat

Nama Isolat

Diameter Zona Hambat (mm)

Escherichia coli Staphylococcus aureus

1 x 24 jam 2 x 24 jam 1 x 24 jam 2 x 24 jam

A 9,51 10,50 10,92 12,01

B 9,03 14,01 9,21 9,69

C 9,11 10,20 9,02 9,07

D 12,02 12,50 10,50 10,50

E 12,32 24,89 8,93 9,03

F 11,50 11,93 9,50 10,23

G 8,04 17,05 9,55 10,12

H 8,00 9,03 8,47 9,50

Secara umum bakteriosin dihasilkan selama masa tumbuh cepat

(Exponential growth phase) pada siklus pertumbuhan mikroba, namun nisin

dihasilkan dalam jumlah besar setelah sel mencapai fase stasioner. Nisin

merupakan bahan antimikroba yang berperan menghambat pertumbuhan bakteri

45

gram positif termasuk pembentuk spora. Hasil uji menunjukkan bahwa kedelapan

isolat probiotik Bal baik yang bersifat Gram positif maupun Gram negatif, mampu

menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Hal ini dapat dilihat dengan

terbentuknya zona bening disekitar paper disk yang sebelumnya telah direndam

dalam suspensi isolat. Akan tetapi menurut Tagg et al. (1976) dalam Surono

(2004) kriteria bakteriosin (antimikroba) yang dihasilkan oleh bakteri gram positif

yaitu, suatu jenis protein, bersifat bakteriosidal tidak hanya bakteriostatik,

mencegah pertumbuhan bakteri sejenis, dan mempunyai tempat perlekatan yang

spesifik bagi patogen, yang membedakannya dengan senyawa antimikroba

lainnya.

Dari tabel 5 diatas dapat dilihat bahwa, sebagian besar isolat bersifat

bakteriosidal yaitu kemampuan untuk menghasilkan bakteriosin yang membunuh

bakteri lain, dan sebagian kecil bersifat bakteriostatik yaitu kemampuan yang

hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Pada uji terhadap Escherichia

coli semua isolat bakteri memiliki kemampuan untuk menghasilkan bakteriosida,

yang dilihat dari bertambahnya ukuran zona bening dari 1x24 jam ke 2x24 jam.

Isolat E memiliki daya hambat yang paling besar terhadap Escherichia coli yaitu

12,32 mm pada inkubasi 1x24 jam dan 24,89 mm pada inkubasi 2x24 jam.

Sedangkan untuk Staphylococcus aureus semua isolat memiliki kemampuan

bakteriosidal, kecuali isolat D yang memiliki ukuran zona bening yang sama

besarnya pada 1x24 jam dan 2x24 jam. Hal ini menunjukkan bahwa sisolat D

hanya berkemampuan untuk menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus

(bakteriostatik). Pada uji daya hambat terhadap Staphylococcus aureus isolat A

46

memiliki zona bening yang paling besar yaitu 10,92 mm pada inkubasi 1x24 jam

dan 12,01 mm pada inkubasi 2x24 jam.

Hasil uji daya hambat pada penelitian ini sesuai dengan Surono (2004)

yang menyatakan bahwa kebanyakan bakteriosin yang dihasilkan oleh probiotik

bersifat bakterisidal yaitu membunuh bakteri dan bukan hanya menghambat,

sebagai akibat dari hilangnya kemampuan potensi membran.

47

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil isolasi dan karakterisasi yang dilakukan dalam

penelitian dapat disimpulkan bahwa :

1. Hasil isolasi bakteri probiotik dari saluran pencernaan itik pedaging Anas

domesticus diperolah 8 isolat.

2. Keseluruhan isolat tersebut menunjukkan karakteristik bakteri probiotik asam

laktat seperti bersifat Gram positif (isolat A, C, E, F, G, dan H) maupun Gram

negatif (isolat B dan D). Isolat probiotik BAL yang berbentuk batang (basil)

yaitu isolat A dan C tergolong genus Lactobacillus dan isolat probiotik BAL

yang berbentuk bulat (coccus) yaitu isolat B, D, E, F, G, dan H tergolong

genus Streptococcus atau Diplococcus.

3. Semua isolat tergolong Bakteri Probiotik BAL, baik yang bersifat Gram

positif maupun yang bersifat Gram negatif, memiliki kemampuan untuk

menghasilkan senyawa yang mampu untuk membunuh bakteri patogen

sehingga bersifat bakterisidal.

V.2 Saran

Bakteri probiotik yang telah didapatkan dapat digunakan untuk penelitian-

penelitian selanjutnya seperti pengaplikasiannya terhadap industri pakan

peternakan unggas sebagai pakan probiotik.

48

DAFTAR PUSTAKA

Adams, C. 2009. Probiotics - Protection Against Infection: Using Nature's

Tiny Warriors To Stem Infection. Available at: http://probiotic.org/

lactobacillus-rhamnosus.htm. Opened : Nopember 24, 2010.

Begley, M., C. Hill, and C. G. M. Gahan. 2006. Bile Salt Hydrolase Activity in

Probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 72 (3):1729-1738.

Belviso, S., M. Giordano, P. Dolci and G. Zeppa. 2009. In vitro cholesterol-

lowering activity of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus

paracasei strains isolated from the Italian Castelmagno PDO cheese.

Dairy Sci. Technol. 89 : 169-176.

Budiansyah, Agus. 2004. Pemanfaatan Probiotik dalam Meningkatkan

Penampilan Produksi Ternak Unggas. Prog. Pascasarjana IPB. Bogor.

Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell, L. G., 2003, Biologi, Erlangga,

Jakarta.

Collado, M. C., E. Isolauri, S. Salmien, and Y. Sanz. 2009. The impact of

probiotic on gut health. Curr Drug Metab. 10(1):68-78.

Cullimore, R.D. 2000. Principal Atlas For Bacterial Identification. Lewis

Publisher. United States of America.

Ditjennak, 2006, Direktorat Jendral Peternakan Republik Indonesia, Jakarta.

Djide, M. N., dan Sartini, 2008, Isolasi, Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari

Kol Brassica oleracea L. dan Potensinya sebagai Antagonis Vibrio

harveyi In Vitro, Torani, Vol.18 (3) : 211-216.

Djide, M. N., dan Wahyudin E. 2008. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Air

Susu Ibu, dan Potensinya dalam Menurunkan Kadar Kolesterol

secara In Vitro. Majalah Farmasi dan Farmakologi. Vol. 12(3)

Dommels, Y.E.M., R.A. Kemperman, Y.E.M.P. Zebregs, and R.B. Draaisma.

2009. Survival of Lactobacillus reuteri DSM 17938 and Lactobacilus

rhamnosus GG in the Human gastrointestinal Tract with Daily

Consumption of a Low-Fat Probiotic Spread. Appl. Environ. Microbiol.

75 (19) : 6198-204.

Ducluzeau, R. Gouet, Ph. And Williams, P.E.V.. 1991 Probiotics in ruminants.

In : Rumen Microbial Metabolism And Ruminant Digestion, pp. 343 –

49

346. Ed. J.P. Jouany, Institut National de La Recherche Agronomique,

147, rue de l’Universite – 75338, Paris cedex 07.

Dwyana, Z. dan Gobel, R. B. 2011. Mikrobiologi Umum. Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Hasanuddin. Makassar.

Fadlya, 2008, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Proteolitik dari Limbah Tahu,

Universitas Hasanuddin, Makassar.

FAO/WHO. 2001. Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of

Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including

Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Amerian Córdoba Park

Hotel, Córdoba, Argentina.

FAO/WHO. 2002. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting

Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London.

Fardiaz, S., 1993, Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Raja Grafindo Persada,

Jakarta.

Fuller, R., 1986. Probiotics. J.Appl. Bact., 61 : 1S - 7S.

Gunawan dan M.M.S. Sundari, 2003, Pengaruh Penggunaan Probiotik dalam

Ransum terhadap Produktivitas Ayam. Fakultas Peternakan. Institut

Pertanian Bogor. Bogor.

Granato, D., G. F. Branco, A. G. Cruz, J. D. A. F. Faria, and N. P. Shah. 2010.

Probiotic Dairy Products as Functional Foods. Comprehensive

Reviews in Food Science and Food Safety 9: 455–470.

Harley, J. P. dan Prescott, L. M., 2002, Laboratory Exercises in Microbiology,

The McGraw-Hill Compenies.

Havenaar, R., B. T. Brink, and J. H. J. Huis IN’T Veld. 1992. Selection of Strains

for Probiotics Use. In: Probiotics the Scientific Basis. R. Fuller (Ed). Chapman & Hall, London. pp. 209-224.

ISAPP. 2009. Clarification of the Definition of a Probiotic. Available at;

www.isapp.net. Opened : Nopember 21, 2010.

Iskandar, S., D. Zainuddin, T. Susanti., A.R. Setioko dan U. Hidayat. 1995.

Kinerja anak itik jantan Mojosari diberi pakan yang disimpan

dengan tepung zeolit atau arang tempurung kelapa. J. Ilmu

Peternakan. 8(2): 32 – 37.

Isolauri, E, Y. Sütas, P. Kankaanpää, H. Arvilommi and S. Salminen. 2001.

Probiotics: effects on immunity. Am. J. Clin. Nutr. 73 (2) : 444 – 450.

50

James, J., Baker, C. dan Swain, H., 2008, Prinsip – Prinsip Sains untuk

Keperawatan, Erlangga, Jakarta.

Jeevaratnam, K., Jamuna, M. dan Bawa, A. S., 2003, Biological Preservation of

Foods – Bacteriocins of Lactid Acid Bacteria, Defence Food Research

Laboratoty, India.

Khan, M. S. dan Wiyana, A., 2011, Karakteristik Ketahanan Bakteri Asam

Laktat Indigeneous Kefir Sebagai Kandidat Bakteri Probiotik pada

Kondisi Saluran Pencernaan In Vitro , Institit Pertanian Bogor, Bogor.

Khedid. K dan Faid, M. 2006. Characterization of Lactic Acid Bacteria

Isolated from the One Humped Camel Milk Produced in Morocco.

Microbiology Reseach. Vol. 164: 81-91.

Kusmiati dan Malik, A. 2002. Aktivitas Bakteriosin dari Bakteri Leuconostoc

mesenteroides Pbac1 pada Berbagai Media.

Kusumawati, N; Bettysri, L J; Siswa S; Ratihdewanti dan Hariadi. 2003. Seleksi

Bakteri Asam Laktat Indigenous sebagai Galur Probiotik dengan

Kemampuan Menurunkan Kolesterol. Journal Mikrobiologi Indonesia.

Vol. 8(2): 39-43.

Lay, B. W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT. Raja Grafindo

Persada, Jakarta.

Lay, B. W. dan Hastowo. 1992. Mikrobiologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Lee, J., Y. Kim, H. S. Yun, J. G. Kim, S. Oh, and S. H. Kim. 2010. Genetic and

Proteomic Analysis of Factors Affecting Serum Cholesterol Reduction

by Lactobacillus acidophilus A4. Appl. Environ. Microbiol. 76(14): 4829-

4835.

Leeson, S. and J.D. Summer. 1996. Commercial Poultry Nutrition. 2nd Ed.

University Books. University of Guelph. Guelph, Ontario, Canada.

Mac Farland, G.T. dan J.H. Cummings, 1998.

http://ighawaii.com/naturally/newsletter/biotic.htmlProbiotic and

Prebiotic. Department of Molecular and Cellular Pathology,

University of Dundee, Ninewells Hospital Medical School, Wysong

Health Letter. Diakses pada tanggal 17 Februari 2013 pukul 21.00 Wita.

Mahdavi, A.H; H.R. Rahmani dan J. Pourreza. 2005. Effect of Probiotic

Supplements on Egg Quality and Laying Hen's

Performance.International Journal of Poultry Science. Vol. 4 (7): 488-

492.

51

Malaka, R. dan Laga, A., 2005, Isolasi dan Identifikasi Lactobacillus bulgaricus

Strain Ropy dari Yakult Komersial, Sains dan Teknologi, Vol. 5, No.

1: 50 – 58.

Nettles, C.G and Barefoot, S.F. 1993. Biochemical and Genetic Characteristics

of Bacteriocin of Food-Associated Lactic Acid Bakteria. J. Food Prot.

Vol. 56: 338-356.

Ooi, Lay-Gaik and Min-Tze Liong. 2010. Cholesterol-Lowering Effects of

Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings.

Int. J. Mol. Sci. Vol. 11: 2499-2522.

Parker, R.B., 1974. Probiotics, the other half of antibiotic story.

Anim.Nutr.Heath 29 : 4 – 8.

Pereira, D. I. A., A. L. McCartney, and G.R. Gibson. 2003. An In Vitro Study of

the probiotic Potential of a Bile-Salt-Hydrolyzing Lactobacillus

fermentum Strain, and Determination of Its Cholesterol-Lowering

Properties. Appl. Environ. Microbiol. 69 (8):4743-4752.

Prado, F. C., J. L. Parada, A. Pandey, and C. R. Soccol. 2008. Trends in non-

dairy probiotic beverages. Food Res. Int. 41: 111-123.

Purwadaria, T., I. P. Kompiang, J. Darma, Supriyati, and E. Sudjatmika. 2003.

Isolation and Screening of Microbes for Poultry Probiotics and Their

Growth on Different Sugar Resources. JITV 8(2): 76-83.

Purwati, E. 2011. Effect Of Probiotics In Lactococcus Plantarum Origin

Blondo On The Quality Cholesterol Egg Of Layer Chicken. Telah

diseminarkan pada International Seminar Faculty of Animal Husbandry,

Universitas Padjadjaran, Jatinangor Campus pada tanggal 6-7 Agustus

2011.

Rahayu, E. S. dan Margino, S., 1997, Bkateri Asam Laktat : Isolasi dan

Identifikasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Raihana, N., 2011, Profil Kultur dan Uji Sensitivitas Bakteri Aerob dari

Infeksi Luka Operasi Laparotomi di Bangsal Bedah RSUP DR. M.

Djamil Padang, Universitas Andalas, Padang.

Russel, J. B., 1992, Another Explanation for The Toxicitry of Fermentation

Acid at Low pH : Anion Accumulation versus Uncoupling, J. Appl.

Bacterial 73 : 363 – 370.

52

Saarela, M., G. Mogensen, R. Fondén , J. Mättö, and T.Mattila-Sandholm. 2000.

Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J.

Biotechnol. 84(3):197-215.

Samudra, R dan H. Arif. 2008. Warna kulit, lemak abdomen dan lemak karkas

itik alabio (Anas plathyrhincosn borneo) jantan akibat pemberian

azolla dalam ransum. Animal Production.Jurnal.hlm164-167.

Sari, Ramdana. 2012. Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari

Saluran Pencernaan Ayam Pedaging. Universitas Hasanuddin.

Makassar.

Savadago, Cheik, O. A. T., Imael, B. H. dan Alfred, T. S., 2006, Bacteriocins

and Lactid Acid Bacteria – A Minireview, African Journal og

Biotechnology, Vol. 5 (9), pp. 678 – 683.

Saxelin, M .1997. Lactobacillus GG – a Human Probiotic Strain with

Thorough Clinical Documentation. Food Rev Int. Vol. 13: 293–313.

Senok, A. C. 2009. Probiotics in the Arabian Gulf Region. Food & Nutrition

Researc. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC

2651754/pdf/FNR-53-1842.pdf. Opened: November 29, 2010.

Setiabudi. 2011. Daftar kontrol makanan dan kandungan kolesterolnya.

http://www. Metasolusisehat.com. Diakses pada hari Jumat, 1Maret 2013.

Shah, N. P. 2007. Functional cultures and health benefits. Int. Dairy J.

17:1262-1277, Elsevier Inc, USA.

Shitandi, A., M. Alfred, and M. Symon. 2007. Probiotic characteristic of

lactococcus strain from local fermented Amaranthus hybrydus and

Solanum nigrum. African Crop Science Confrence Proceedings 8:1809-

1812.

Siegumfeldt, H., Rechninger, B. K. dan Jacobsen, M., 2000, Dynamic Changes

of Intracellular pH in Individual Lactid Acid Bacterium Celss in

Respons To a Rapid Drop in Extracellular pH, Appl. Environ Microbiol

66 : 2330 – 2335.

Sinurat, A.P., Miftah dan T. Pasaribu. 1993. Pengaruh sumber dan tingkat

energy ransum terhadap penampilan itik jantan lokal. Proc. Seminar

Penelitian dan Pengembangan Ternak. Balitnak, Ciawi, Bogor.

Simadibrata, M. 2010. Probiotik-Peranannya dalam Dunia Medis. Universitas

Indonesia. Jakarta.

53

Sujaya, I N., Y. Ramona, N.P. Widarini, N.P. Suariani, N.M.U. Dwipayanti, K.A.

Nocianitri dan N.W. Nursini. 2008b. Isolasi dan Karakteristik Bakteri

Asam Laktat dari Susu Kuda Sumbawa. J. Vet. 9 (2) : 52 – 59.

Surono, IS. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya:

Jakarta

Tabbers, M.M. and M.A. Benninga. 2007. Administration of Probiotic

Lactobacilli to Children With Gastrointestinal Problems : There is

Still Little Evidence. Ned. Tijdschr. Geneeskd. 151 (40) : 2198 – 2202

Tensiska, 2008, Probiotik dan Prebiotik sebagai Pangan Fungsional,

Universitas Padjadjaran. Jatinegara.

Vélez, M. Perea. 2007. Identification and Characterization of Starter Lactic

Acid Bacteria and Probiotics from Columbian Dairy Products. Journal

of Applied Microbiology; ISSN; 1364-5072.

Volk, 1988, Mikrobiologi Dasar, Erlangga, Jakarta.

Weichselbaum, E. 2009. Probiotics and health: a review of the evidence.

Nutrition Bulletin. 34:340–373.

Yousefi, M and Karkoodi, K. 2007. Effect Probiotic Thepar® and

Saccharomyces cerevisia Supplementation on Performance and Egg

Quality of Laying Hens. International Journal of Paultry Science.Vol.

6(1):52-54

Yeong, S.W. 1994. Promoting growth efficiency in ducks. Poult. Int. (July).

Yulinery, T., E. Yulianto dan N. Nurhidayat. 2006. Uji Fisiologis Probiotik

Lactobacillus sp Mar 8 yang telah Dienkapsulasi Dengan

Menggunakan Spray Dryer Untuk Menurunkan Kolesterol.

Biodiversitas 7 (2) : 118 – 122.

54

LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Kerja Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang

Berasal Dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging Anas domesticus

Isolasi Bakteri

Sampel

(Usus Itik)

Kultur Murni

Bakteri

Karakterisasi

Bakteri Probiotik

Uji Probiotik

Uji

Ketah

anan

Terha

dap

Keasa

man

Lamb

ung

Uji

Ketah

anan

Terha

dap

Gara

m

Empe

du

Uji Fisiologis

Probiotik

Uji

Ketah

anan

Temp

eratur

Uji

pH

Opti

mum

Uji Biokimia

Uji

MR

(Meth

yl

Red)

Uji VP

(Voges

Proskaue

r)

Uji

Moti

litas

Uji

Katal

ase

Uji

TSIA

(Tripl

e

Sugar

Iron

Agar)

Uji Daya

Hambat

55

Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi Bakteri Probiotik

Usus Ayam

Kultur Bakteri

Satu Koloni

Bakteri (murni)

Stok

Bakteri

- Melakukan pengamatan morfologi bakteri

meliputi bentuk koloni, bentuk tepi, warna,

elevasi, dan bau

- Memilih setiap koloni yang terpisah

- Menyentuhkan jarum ose yang steril pada koloni

bakteri kemudian digores pada media MRSA

- Inkubasi selama 2x24 jam

- Kultivasi secara berulang sampai didapat kultur murni

- Mengambil saluran pencernaan (usus) itik segar

- Bagian anterior jejunum dan kloaka diikat sebelum

dilepas dari badan itik

- Mengambil bagian dalam usus dengan menggunakan

Scalpel (pisau Kecil) dan menghaluskannya dengan

menggunakan mortar dan pastel lalu memasukkannya ke

dalam Erlenmeyer steril

- Mengencerkan isi usus dengan NaCl fisiologis dengan

perbendingan 1:1

- 1 mL sampel diinokulasikan pada medium MRSA

56

Lampiran 3. Skema Kerja Pengecatan Gram

Stok Bakteri

Gram C

- Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di atas

permukaan preparat

- Dibiarkan selama 60 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- dikeringanginkan

Gram B

Preparat

Gram D

Pengamatan

- Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di

atas permukaan preparat

- Dibiarkan selama 60 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- dikeringanginkan

- Sebanyak satu ose (ose bulat) isolat diambil dari stok

- Dibuat ulasan pada gelas objek

- difiksasi

- Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di atas

permukaan preparat

- Dibiarkan selama 60 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- dikeringanginkan

- Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan

di atas permukaan preparat

- Dibiarkan selama 60 detik

- Dicuci dengan air mengalir

- dikeringanginkan

- Diamati di bawah mikroskop

Gram A

57

Lampiran 4. Skema Kerja Uji Motilitas

Stok bakteri

Medium SIM

tegak

- Sebanyak satu ose (ose bulat) diambil dari stok

- Diinokulasi pada medium SIM tegak dengan cara

ditusuk

- diinokulasi selama 2x24 jam

Pengamatan

58

Lampiran 5. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Keasaman (pH)

Medium

MRSB

- Medium dimasukkan ke dalam dua

erlenmeyer berbeda

- Disterilkan dalam

autoklaf

Medium MRSB-HCl

Medium MRSB

pH 2,5

Medium MRSB

pH 3

- ditambahkan

HCl pekat

sampai pH

menjadi 2,5

- ditambahk

an HCl

pekat

sampai pH

menjadi 3

- Ditambahkan satu ose (ose bulat)

isolat dalam masing-masing

medium

- Inkubasi selama 2x24 jam

Pengamatan

59

Lampiran 6. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu

Medium MRSB

- Medium dimasukkan ke dalam 2

erlenmeyer berbeda

Medium MRSB-Garam

empedu

Medium MRSB-Garam

empedu

- Disterilkan di dalam autoklaf

Medium MRSB-Garam

empedu

- Ditambahkan 1 ose isolat (ose bulat)

dalam masing-masing medium

MRSB-Garam empedu 1% dan

Medium MRSB-Garam empedu 5%

- Inkubasi selama 1-3x24 jam

- Ditamnbahkan garam

empedu sintetik 1%

- Ditambahkan garam

empedu sintetik 5%

Pengamatan

60

Lampiran 7. Skema kerja uji ketahanan temperatur

Stok bakteri

Medium MRSB+isolat

Pengamatan

- Masing-masing tabung

diinkubasi selama 2x24 jam

pada suhu yang berbeda

yaitu 15OC, 37

OC, dan 45

OC

- Sebanyak 1 ose isolat (ose

bulat) diinokulasikan pada

medium MRSB dalam 3

tabung reaksi yang berbeda

61

Lampiran 8. Skema kerja uji MR (Methyl Red)

Stok bakteri

Pengamatan

- Ditambahkan 5 tetes metil-

red inokulum

Inokulum

- Sebanyak 1 ose isolat (ose

bulat) diinokulasikan pada

medium cair MR-VP

- Inkubasi selama 5x24 jam

62

Lampiran 9. Skema kerja uji Vp (Voges Preskauer)

Stok bakteri

Pengamatan

- Sebanyak 1 ose isolat (ose

bulat) diinokulasikan pada

medium cair MR-VP

- Inkubasi selama 3x24 jam

- Ditambahkan 0,2 mL KOH

dan 0,6 mL alfanaftol

- Dikocok selama 30 detik

Inokulum

63

Lampiran 10. Skema kerja uji katalase

Stok bakteri

Pengamatan

- Sebanyak 1 ose isolat

(ose bulat) diambil dari

stok kultur

- Isolat dicelup pada

Reagen H2O2

64

Lampiran 11. Skema kerja uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Stok bakteri

Pengamatan

Diinkubasi selama 2-3x24 jam

Inokulum

- Sebanyak 1 ose isolat (ose lurus)

diambil dari stok kultur kemudian

ditusuk pada bagian tegak medium

TSIA

- Sebanyak 1 ose isolat (ose bulat)

diambil dari stok kemudian digores

pada bagian miring media TSIA

65

Lampiran 12. Skema kerja uji daya hambat

Stok bakteri probiotik

- Sebanyak 1 ose (ose

bulat) diambil dari stok

dan diinokulasi pada

medium NA miring

- Diinkubasi selama

5x24 jam

- Sebanyak 1 ose (ose

bulat)

diinokulasikan pada

medium NA miring

- Diinkubasi selama

24 jam

Bakteri uji (Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli)

Inokulum

- Ditambahkan 5 mL aquades steril dan

divorteks

- Diukur pada spektrofotometer

Suspensi bakteri probiotik

- Paper disk direndam

dalam suspensi selama ±

10 menit

- Paper disk kemudian

diletakkan di atas

permukaan medium NA

yang sebelumnya telah

diinokulasikan bakteri uji

Inokulum

- Sebanyak 1 mL

bakteri uji

diinokulasikan

pada medium

NA dengan

metode tabur

- Biarkan

memadat

Suspensi bakteri uji

Diameter zona hambat yang terbentuk

diukur setiap 24 jam dengan menggunakan

jangka sorong Pengamatan

- Diinkubasi selama 2x24

jam

66

Lampiran 13. Uji Daya Hambat Bakteri

A (1) B

A (2) B

Keterangan : (1) Waktu inkubasi 1 x 24 jam

(2) Waktu inkubasi 2 x 24 jam

A = Bakteri Escherichia coli

B = Bakteri Staphylococcus aureus

67

Lampiran 14. Pemurnian isolat probiotik BAL dengan Metode Kuadran

68

Lampiran 15: Foto Prosedur Kerja

Usus Itik Pedaging

Pengambilan isi dalam usus

Proses pemurnian isolat

Pembuatan stok bakteri

Proses inokulasi bakteri pada

Uji MR-VP dan Temperatur

Pembuatan media

69

Proses Pengecatan gram

Inokulasi bakteri pada Uji motilitas

70

Lampiran 16. Tabel 6 : Hasil Karakterisasi Bakteri Probiotik BAL

Karakterisasi Isolat

A B C D E F G H

Pengecatan Gram Positif

(Basil)

Negatif

(Coccus)

Positif

(Basil)

Negatif

(Coccus)

Positif

(Coccus)

Positif

(Coccus)

Positif

(Coccus)

Positif

(coccus)

Uji Motilitas Non

Motil

Non

Motil

Non

Motil

Non

Motil

Non

Motil

Non

Motil

Non

Motil

Non

Motil

Uji

Ketahanan

Terhadap

Keasaman

(pH)

2,5 +++ +++ +++ + ++ ++ + +++

3 +++ +++ +++ + ++ ++ + +++

Uji

Ketahanan

Terhadap

Garam

Empedu

1% +++ ++ +++ ++ + + ++ +++

5% +++ +++ +++ ++ + + + +++

Uji

Ketahanan

Temperatur

150C + + + + + + + +

370C +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ +++

450C ++ ++ ++ + + + + ++

Uji MR (Methyl Red) Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif

Uji VP (Voges

Preskauer) Negatif Negatif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Negatif

Uji Katalase

Uji TSIA

(Triple

Sugar Iron

Agar)

Lereng

(Slant) Asam Asam Asam Asam Asam Asam Asam Asam

Tegak

(Butt) Asam Asam Asam Asam Asam Asam Asam Asam

Terbentuk

Gas Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif

Terbentuk

H2S Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif