7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

1/23

Isolasi danPemurnian Protein

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

2/23

Tujuan

Mempelajari fungsi enzim/protein

Menentukan urutan asam amino

Mempelajari struktur

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

3/23

Sel mengandung ribuan protein

Prosedur pemurnian harus membedakan

protein yang diinginkan dari protein yanglain

Sifat protein merupakan kunci dalam

merancang protokol pemurnian

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

4/23

Sifat Protein

Muatan disebabkan oleh rantai samping

COOdan !"#$

%erat molekul protein ber&ariasi Titik isoelektrik' pI' p" ketika muatan

total protein nol

(ika protein dengan pI tertentu beradadalam larutan dengan p" tertentu' maka

p" ) pI ) p"!et$ !et

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

5/23

Prosedur pemurnian protein dapat dilakukankarena adanya &ariasi*

+elarutan' ukuran' muatan' bindingspecificity ,affinity-'sifat hidrofobik/hidrofilik

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

6/23

Sel

LisisOsmosisFreeze/ThawFrench pressGrindingglass beads

Sonication (bakteri)

Sentrifugasi

elet Supernatan!ebris sel

rotein terlarut

Isolasi Protein

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

7/23

!ama (enis Inhibitor Target Protease

PMS.

,Phenylmethylsulfonyl fluoride-

Ire&ersibel Ser ,$Cys- protease* terikatpada pusat aktif Ser/Cys

%enzamidine e&ersibel Ser dan Cys protease* inhibitorkompetitif

01T2 e&ersibel Metalo enzim* chelate metals

Pestatin ,pentapeptida $ gugusorganik-

e&ersibel 2sp3acidic3 protease* inhibitorkompetitif ,target* pepsin' "I4

protease-

2protinin ,56mer peptida- e&ersibel Serin protease' esterase*inhibitor kompetitif ,target*tripsin' kimotripsin' plasmin-

7eupeptin ,2cleuleu2rg- e&ersibel Ser dan Cys protease* inhibitorkompetitif

Inhibitor Protease* inakti&asi protease yang

dibebaskan selama lisis sel

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

8/23

Stabilisasi* +etika berada diluar lingkungan aslinya,nati&e-' protein menjadi kurang stabil8 Meskipun

organisme hidup pada temperatur #9oC' pemurnian

dilakukan pada temperatur :oC

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

9/23

Solubility ,Salting Out-

;aram berkompetisi

dengan air

Protein mengalami

agregasi melalui interaksi

&an der

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

10/23

Strategi Pemurnian

Muatan* +romatografi Penukar Ion

+epolaran* +romatografi Interaksi

"idrofobik?kuran* 1ialisis' ?ltrafiltrasi' ;el

elektroforesis' +romatografi .iltrasi ;el'

?ltrasentrifugasi

Spesifisitas* +romatografi afinitas

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

11/23

Ione@change Chromatography ,I0A-

Cation e@changers

contain negati&ely

charged polymer

2nion e@changerscontain positi&ely

charged polymer8

Is effected by p"

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

12/23

;el .iltration/Size 0@clusion

Chromatography

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

13/23

+romatografi Interaksi

"idrofobik Protein mempunyai Bdaerah3

hidrofobik dipermukaan yangdapat berinteraksi denganresin

esin yang mengandunggugus fenil atau alifatikmengikat protein* protein yangpaling hidrofobik akan terikatpaling kuat

0lusi dilakukan dengan pelarutyang kurang polar ataudengan menurunkan garamD

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

14/23

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

15/23

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

16/23

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

17/23

Schematic of "is7ink and "istag Interaction

Two site are a"ailable for #is$tag binding are rapidl% coordiwith histidine in the presence of a #is$tagged pol%peptide

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

18/23

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

19/23

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

20/23

2kti&itas 4s8 2kti&itas Spesifik

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

21/23

0lektroforesis S1SP2;0

Pemisahan protein

,molekul bermuatan

berdasarkan ukuran

dalam medan listrik Protein didenaturasi

dengan detergen anion

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

22/23

Penentuan Massa Molekul Protein

7/25/2019 Isolasi+dan+pemurnian+protein

23/23

2nalisa Tingkat +emurnian dengan

S1SP2;0

&' kstrak kasar' engendapan dengan garam

*' +romatogra, penukar ion-' +romatogra, ,ltrasi gel.' +romatogra, a,nitas

&0g protein/la1ur