7/25/2019 Laporan Genetika Molekuler

1/3

Laporan Genetika Molekuler

Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen DNA Penyandi 16S rRNA

Oleh

!anni "saa#ifah

B"$% P&'11'&&(1

PROGRAM S")DI BIO"*$NOLOGI

S*$OLA! PAS+ASAR,ANA

INS"I")" P*R"ANIAN BOGOR

-&1'

Pendahuluan

7/25/2019 Laporan Genetika Molekuler

2/3

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkuantifikasi serta menganalisis

kualitas DNA genom dari bakteri, tumbuhan, dan cendawan.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu collection tube tabung eppendorf!,

tabung P"#, mikropipet ukuran $P, $%P, $%%P dan &%%%P! dan tip, mortar dan pestle,

erlenmeyer, setrifuge, inkubator, pengering 'akum, 'orte(, alat spin, Thermal cycler,

timbangan, hot plate, comb, cetakan agar, dangel doc.

Bahan yang digunakan pada praktikum antara lain kulturEscherichia coliD) * +,

daun nanas, sampel cendawan, larutan "TAB, " $-&!, P", /mercapto etanol,

Na0Ac $12 p) *,$!, 3t0) absolut dan 4%5, dd)$0, #nase, nitrogen cair, agarose,

buffer TA3 & (,pcr mi(, .

1etodesolasi DNA, Pemurnian, dan Pengendapan DNA 6enom

7ebanyak &,* ml kultur bakteri Escherichia coliD) * + di masukkan ke dalam

tabung eppendorf. 8ultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm selama $/

* menit. 7upernatan yang terbentuk dibuang, sedangkan pelet yang berada pada

tabung ditambahi sebanyak 9%% l larutan "TAB dan diresuspensi. "ampuran

pelet dan "TAB selanjutnya di inkubasi pada suhu 9* selama :% menit tabung

di bolak balik setiap &% menit! kemudian didinginkan pada es selama * menit.

"ampuran ditambahi dengan larutan kloroform isoamil alkohol "2 $-&!. Tabung

dibolak balik kemudian disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm selama &% menit.

;ase supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke tabung eppendorf baru

dengan menggunakan mikropipet untuk mengetahui 'olume supernatan yangterambil. Tabung ditambahkan larutan fenol kloroform isoamil alkohol P"2

$*$-&! sebanyak & kali 'olume supernatan ke dalam tabung. Tabung dibolak balik

sampai homogen dan disentrifugasi dengan kecepatan &%.%%% rpm pada suhu -

selama &% menit. 7upernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung baru dan di

tambahi Na0Ac sebanyak %,& kali 'olume supernatan dan ditambah dengan 3t0)

&%%5 sebanyak $ kali 'olume. Tabung diinkubasi pada suhu /$% selama

semalam.

7/25/2019 Laporan Genetika Molekuler

3/3

selanjutnya, tabung disentrifugasi dengan kecepatan &%.%%% rpm selama $* menit

pada suhu - . 7upernatan yang terbentuk dibuang, selanjutnya pellet ditambah

dengan *%% l 3t0) 4%5. Tabung disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm

pada suhu - selama &% menit. 7upernatan dibuang dan tabung yang berisi pelet

dikeringkan dengan 'akum. Pellet dicuci dengan larutan dd)$0 sebanyak $% ldan #Nase sebanyak %,$ l . Tabung diinkubasi pada suhu :4 selama &%

menit.

"endawan

7ampel cendawan digerus sampai halus menggunakan pestle dan mortar dengan

ditambah larutan nitrogen cair. 7erbuk cendawan dimasukkan ke tabung eppendorf

yang telah diisi 9%% l larutan buffer "TAB $ ( $5 P=P!. Tabung di bolak balik

agar homogen dan diinkubasi pada suhu 9* selama :% menit. Pada saat

inkubasi, tabung dibolak balik setiap &% menit sekali. Tabung selanjutnya

didinginkan ke dalam es selama * menit. 7ampel pada tabung ditambah dengan 9%%l larutan kloroform isoamil alkohol "2 $-&!, kemudian disentrifugasi

kecepatan &%.%%% rpm selama &% menit pada suhu ruang. 7upernatan yang terbentukdiambil, dipindahkan ke tabung baru dan ditambahi larutan fenol kloroform isoamil

alkohol P"2 $*$-&! sebanyak & kali 'olume supernatan. Tabung disentrifugasi

pada &%.%%% rpm selama &% menit pada suhu ruang. 7upernatan yang terbentuk

dipindahkan ke tabung baru dan ditambahi Na0Ac $12 p) *,$! sebanyak & kali

'olume dan 3t0) absolut sebanyak $/: kali 'olume. "ampuran larutan di diinkubasi

selama semalam pada suhu /$% . Tahap selanjutnya, tabung disentrifugasi

dengan kecepatan &%.%%% rpm selama $* menit pada suhu - . 7upernatan yang

terbentuk dibuang, kemudian pellet ditambah dengan *%% l 3t0) 4%5. Tabung

disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm pada suhu - selama &% menit.

7upernatan dibuang dan tabung yang berisi pellet dikeringkan dengan 'akum. Pellet

ditambah dengan larutan dd)$0 sebanyak $% l dan #Nase sebanyak : l .Tabung diinkubasi pada suhu :4 selama &% menit.

Pembuatan 6el Agarose

7ebanyak %,: gram serbuk agarosa dilarutkan dengan :% ml buffer TA3 &( pada

erlenmeyer. 3rlenmeyer ditutup dengan seal dan dilubangi, kemudian dipanaskan

dengan microwa'e pada suhu sekitar &4* hingga agarosa larut. Agarosa yang

telah larut di diamkan hingga suhunya suam/suam kuku 9% / 4% ! dan

dituang ke cetakan gel yang sudah dipasangi dengan comb.

Deteksi dan >ji 8ualitas DNA dengan 3lektroforesis

>ji 8uantitas DNA dengan 7pektofotometer