LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI KOLOM DAN VAKUM

LABORATORIUM FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP

KROMATOGRAFI KOLOM, KROMATOGRAFI CAIR VAKUM, DAN MPLC

(Middle Pressure Liquid Chromatography)

EKSTRAK DAUN JAMBU BIJI (Psidium guajava L.)

OLEH:PUTRI SAKINAH N111 12 109YAYU PERMATASARI N111 13 004SILVA MALIKU N111 13 026REZKY APRHODYTA N111 13 312HUTRI ARDIYANTO N111 13 519NAHDIAH W N111 13 521

KELOMPOK IVGOLONGAN SENIN PAGI

ASISTEN: DIAN MEGAWATI AMIN PUTRI

MAKASSAR2015

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak

berhubungan dengan sifat spesifik senyawa. Analisis meliputi pengambilan

cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang

dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan

pengukuran. Banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik

paling banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael

Tswett, seorang ahli botani Rusia, pada tahun 1906. Kromatografi berasal

dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘Graphos’ yang berarti

menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada

perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa

tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa

gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa

menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling

kuat dan sering dilakukan di laboratorium. Metode kromatografi, karena

pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik

dan preparatif. Oleh karena itu untuk memisahkan komponen-komponen

yang terdapat dalam ekstrak sampel maka dilakukan dengan metode

kromatografi kolom, kromatografi cair vakum, dan MPLC (Medium Pressurre

Liquid Chromatography).

I.2 Maksud Percobaan

1. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang

terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan

metode kromatografi kolom.



metode kromatografi cair vakum.



metode MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography).

I.3 Tujuan Percobaan

1. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak

daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi

kolom berdasarkan tingkat kepolarannya.


daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi

cair vakum berdasarkan tingkat kepolarannya.


daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan MPLC (Middle

Pressure Liquid Chromatography) berdasarkan tingkat kepolarannya.

I.4 Prinsip Percobaan

1. Pemisahan senyawa dengan metode kromatografi kolom berdasarkan

absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda

terhadap permukaan fase diam dengan cara melarutkan campuran yang

akan diuji dalam sedikit pelarut lalu dimasukan lewat puncak kolom dan

dibiarkan mengalir kedalam zat penyerap. Karena adanya perbedaan

daya serap dari masing-masing komponen, senyawa yang lebih polar

akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non

polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari

larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada

kolom. Pelarut lebih lanjut/dengan tanpa tekanan udara masing-masing

zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi

pemisahan dalam kolom.

2. Pemisahan senyawa dengan metode kromatografi cair vakum

berdasarkan pemisahan secara adsorpsi dan partisi yang dipercepat

dengan bantuan pompa vakum.

3. Pemisahan senyawa dengan metode MPLC berdasarkan prinsip

pemisahan di bawah tekanan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Kromatografi

Kromatografi adalah cara pemisahan zat khasiat dan zat lain yang ada

dalam sediaan dengan jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau

penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir

(2).

Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya

menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja

berdasarkan prinsip yang sama (3).

Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau

cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase

gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari

campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan

bergerak pada laju yang berbeda pula (3).

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada

kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah

fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran

sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen

yang mudah tertahan pada fase diam akan tertimggal. Sedangkan komponen

yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (4).

II. 2 Kromatografi Kolom

Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang

digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapkan pada skala

besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan

untuk pemurnian senyawa di laboratorium (5).

Gambar 1. Alat Kromatografi Kolom

Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang

dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel-

sampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum

bahwa panjang kolom harus sekurang-kurangnya 10 kali ukuran

diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan

diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti

alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam

porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan

sedikit cairan (6).

Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan

sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relatif zat terlarut

melalui sistem. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom

dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m

hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair

dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol,

ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan

silicon (5).

Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai

keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti

yang tertera pada masing-masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap

sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang

rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan

ulang senyawa yang dikromatografi.

Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan suatu campuran

senyawa. Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa

serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri

(dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut.

Kromatografi kolom terdiri dari 2 fase yaitu (7):

1. Fase Diam

Fase stationer dalam kromatografi kolom adalah zat padat (adsorben).

Fase diam yang paling umum digunakan adalah silica gel yang diikuti

alumina. Fungsi dari fase diam adalah untuk menahan sampel bergerak di

sepanjang kolom.

2. Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi kolom berupa campuran

pelarut atau pelarut murni (eluent). Fungsi fase gerak adalah mengalirkan

analit (sampel) untuk bergerak di sepanjang fase diam sampai akhirnya

terelusi.

Ukuran penyerap untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT.

Kemasan kolom biasanya 63-250 µm, untuk kolom yang dijalankan dengan

gaya tarik bumi, kolom yang dijalankan dengan tekanan, apakah

menggunakan udara atau pompa, biasanya mengandung partikel 40-63 µm

atau lebih halus (8).

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang

masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan

senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan

partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60,

kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam : (7)

a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi

kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.

b. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan

pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom

melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk

semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat,

setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben

kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu

dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik.

Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui

dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka

dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang

keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

Pada kromatografi kolom ukuran silika 1:100 karena berdasarkan

penelitian/pengalaman itu merupakan perbandingan yang paling tepat untuk

panjang kolom dalam menghasilkan pemisahan senyawa yang baik,

mengingat pemisahan dipengaruhi oleh panjang dan diameter kolom,

semakin panjang kolom semakin baik untuk melakukan pemisahan. Pada

kromatografi cair vakum digunakan 1:10 karena kapasitas dari gelas masir

tidak mencukupi jika menggunakan perbandingan 1:100, jadi biasanya

menggunakan perbandingan 1:10, intinya pemisahan dipengaruhi oleh

panjang dan diameter dari silika, semakin panjang dan lebar diameternya,

maka pemisahan akan semakin baik. (12)

Kromatografi kolom dari larutan dibutuhkan tabung pemisah tertentu

yang diisi dengan bahan sorpsi dan juga pelarut pengembang yang berbeda.

Tabung pemisah yang diisi dengan bahan sorpsi disebut kolom pemisah.

Tergantung dari masalah bahan pemisahan dapat digunakan tabung filter

dengan gelas berpori yang pada ujung bawah menyempit (tabung Allihn) atau

tabung gelas, yang pada ujung bawah menyempit dan dilengkapi dengan

kran. Tabung bola jarang digunkan. Perbandingan panjang tabung terhadap

diameter pada umumnya adalah 40:1. Harga 20 berlaku sebagai batas

bawah (9).

Pengisisan tabung pemisah dengan adsorben, yang juga disebut

kemasan kolom, harus dilakukan secara hati-hati, harus rata. Aluminium

oksida atau silika gel dapat diisikan kering ke dalam tabung pemisah. Agar

pengisian rata, tabung setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan

lemah pada pelat kayu. Adsorben lainnya harus diisikan sebagai suspensi,

terutama jika zat ini menggelembung dengan pelarut pengembang. Yang

umum dilakukan adalah, adsorben dibuat seperti bubur dengan pelarutelusi,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung pemisah. Sebagai bahan sorpsi

digunakan bahan yang sama dengan kromatografi lapis titpi yaitu silika gel,

aluminium oksida, poliamida, selulosa, selanjutnya juga arang aktif dan gula

tepung. Tergantung dari cara pengembangan dapat dibedakan kromatografi

elusi, kromatografi garis depan dan kromatografi pendesakan (9).

Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar

menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertical (10).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi

kolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),

ukuran kolom (diamter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi membantu

mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan

kehidupan manusia secara umum (10).

Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada

afinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu

memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar

kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase

gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih

singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu

yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat

ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan

mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol

keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa

atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara, nitrogen,

argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom. Kolomnya (tabung gelas)

diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan

adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian

diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben.

Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari

atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah

(fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer).

Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan

partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat

terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut.

Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa

lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok

untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat

terlarut dengan persamaan berikut.

R = (jarak yang ditempuh zat terlarut)/(jarak yang ditempuh pelarut/fasa

mobil) (11).

Kromatografi kolom karena memiliki aliran konstan solusi eluted

melewati detektor dalam berbagai konsentrasi, detektor harus plot

konsentrasi dari sampel eluted selama perjalanan waktu. Plot konsentrasi

sampel terhadap waktu disebut kromatogram. Resolusi mengungkapkan

tingkat pemisahan antara komponen-komponen dari campuran. Semakin

tinggi resolusi kromatogram, semakin baik tingkat pemisahan sampel kolom

memberi (12).

Faktor-faktor yang digunakan untuk evaluasi kinerja kolom yaitu (12):

1. Efisiensi Kolom Kromatografi

Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling sederhana

adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N). Ukuran efisiensi kolom

adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep

lempeng teoritis pada distilasi.

2. Resolusi (Daya Pisah)

Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat

pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode

kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk

hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus

terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang

(overlapping) atau tidak ada tumpang tindih sama sekali. Resolusi

komponen-komponen dalam kromatografi tergantung pada waktu retensi

relatif pada sistem kromatografi tertentu dan tergantung pada lebar

puncak.

3. Faktor Asimetri (Faktor Pengekoran)

Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik

adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran

(tailing) sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak

simetri. Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak

setangkup), maka suatu perhitungan asimetris merupakan cara yang

berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi.

Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang

sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif,

senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek

molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam

bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-

molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan

molekul penting lainnya.

Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi

ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya,

dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau

dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa

bertahan lama.

Dalam bidang klinik, teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam

menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien,

dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut.

Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau

ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air

liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa

memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu

penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.

Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi

sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak

metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan

tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama

untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.

Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama

dalam.

Pada metode kromatografi kolom mempunyai keuntungan dan kerugian,

yaitu (14):

Keuntungan:

1. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif

2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran

3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi

Kerugian:

1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual

2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.

Kromatografi Kolom Isap :

1. Suction Colomn

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan absorpsi

dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan

suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia

yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. (12)

2. Rapid-Sigel

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi

dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan

suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia

yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. . (12)

3. Press Colomn

Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan

cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara

yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan

peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi. .

(12)

II. 3 Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom vakum merupakan kromatografi kolom yang

dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan

kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi

dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan

maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet,

pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung

fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari

pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya (9).

Gambar 2. Alat Kromatografi Vakum Cair

Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi kolom yang dikemas

kering biasanya dengan penyerap mutu kromatografi lapis tipis10-4 µg pada

kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga

prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam

keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Setelah diperoleh

kemasan yang maksimum, kemudian vakum dihentikan dan pelarut yang

kepolarannya rendah dituangkan kedalam permukaan penjerap lalu divakum

lagi, kolom dihisap sampai keringdan kolom sekarang siap dipakai (9).

Fraksi Pelarut Komposisi Volume (ml)

1 Heksana 100 100

2Heksana-etil

asetat50:50 100

3 Etil asetat 100 100

4 Etil asetat- 75:25 100

metanol

5Etil asetat-

metanol50:50 100

6Etil asetat-

metanol25:75 100

7 Metanol 100 100

Tabel 1. Urutan pelarut yang digunakan dalam Kromatografi Cair Vakum

Salah satu cara pemisahan adalah kromatografi cair vakum,

kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan

bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3,

sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta

wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5 cm,

kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam

pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut

ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran

ini digenis sampai homogen, dikeringkan dandimasukkan ke dalam corong G-

3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas

saring. Elusi diawali dengan pelarut nonpolar dilarutkan dengan kombinasi

pelarut dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap

kali elusi adalah sebagai berikut: untuk bobot ekstrak sampai lima gram

diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-30 g ekstrak diperlukan 50 ml pelarut.

Dalam hal ini diameter corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan

ekstrak dipermukaan kolom setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut

dituangkan ke permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum.

Masing-masing ekstrak ditampung dalam wadah terpisah sehingga

menghasilkan sejumlah fraksi (10).

Kromatografi cair vakum dapat digunakan untuk fraksinasi dan

memurnikan fraksi. Metode KCV digunakan karena lebih efektif dan efisien

dalam pemisahan dibandingkan kromatografi kolom gravitasi. Kromatografi

cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh para ilmuwan dari

Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk separasi

menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini adalah

kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak

dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum. Kromatografi cair

vakum pada awalnya digunakan untuk separasi senyawaan steroid dan

produk-produk natural dari laut. Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu

corong Buchner yang memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan

fase diam yang tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai dalam

kromatografi lapis tipis (70-230 mesh) (11).

Corong Buchner yang berisi fase diam ini digunakan dalam kondisi

vakum/bertekanan, yang berakibat pada kemampuan yang dihasilkan oleh

kromatografi cair vakum akan sama dengan kromatografi gravitasi namun

diperlukan waktu yang lebih singkat. Cara asli yang

diperkenalkan oleh Coll menggunakan corong Buchner kaca masir atau

kolom pendek sedangkan target menggunakan kolom yang lebih panjang

untuk meningkatkan daya pisah (11).

Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama

dibandingkan kolom konvensional yaitu (12):

1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan

kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak

lebih lambat (10-100μl/menit).

2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal

jika digabung dengan spektrometer massa.

3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

missal sampel klinis.

Adapun kerugian dari KCV (Kromatografi Vakum Cair) yaitu (12):

1. Membutuhkan waktu yang cukup lama

2. Sampel yang dapat digunakan terbatas

II.4 MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography) (15)

Middle Pressure Liquid Chromatography (MPLC) adalah salah satu

dari berbagai jenis teknik kromatografi kolom preparatif. Pemisahan di bawah

tekanan memungkinkan penggunaan ukuran partikel yang lebih kecil dan

meningkatkan keragaman fase diam yang dapat digunakan.

Pada dasarnya MPLC atau yang dikenal dengan Sepacore adalah

pemisahan yang menggabungkan keuntungan dari kromatografi kolom dan

vakum, senyawa yang dapat dipisahkan dari instrumen ini adalah senyawa

metabolit sekunder meliputi senyawa alkaloid, streoid/terpenoid, flavanoid,

tannin, fenolik, saponin dan senyawa metabolit sekunder lainnya.(2)

MPLC diperkenalkan pada tahun 1970 sebagai salah satu teknik yang

efisien untuk pemisahan preparatif senyawa organik. MPLC mampu

mengatasi salah satu kelemahan utama dari Low Pressure Liquid

Chromatography (LPLC), yaitu terbatasnya sampel yang dapat digunakan.

Metode pemisahan ini sekarang sering digunakan baik sendiri atau dalam

kombinasi dengan alat preparatif umum lainnya seperti kromatografi kolom

terbuka, kromatografi Sash, LPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi

preparatif (HPLC). Perbedaan antara kromatografi cair tekanan rendah,

tekanan menengah, dan tekanan tinggi didasarkan pada rentang tekanan

yang diterapkan dalam teknik ini. MPLC memungkinkan pemisahan senyawa

dalam jumlah besar, dan tidak seperti kromatografi kolom terbuka dan

kromatografi Sash, MPLC dapat meningkatkan hasil pemisahan yang

diperoleh dan waktu yang diperlukan lebih singkat. Pengepakan bahan

dengan ukuran partikel yang lebih rendah di bawah tekanan meningkatkan

kualitas pemisahan serta fase padatnya dapat digunakan kembali.

Instrumen MPLC ini terdiri dari pompa untuk pelarut, sistem injeksi

sampel, dan pengemasan kolom. Pemisahan produk dapat diikuti secara

manual dengan memonitor dengan kromatografi lapis tipis (TLC) atau secara

otomatis dengan detektor dan perekam yang terhubung ke kolom outlet.

Senyawa yang dipisahkan dikumpulkan oleh kolektor fraksi.

1. Pompa

Pemisahan kromatografi 0,1-100 g sampel dalam beberapa jam

membutuhkan laju aliran 5-200 ml/menit, dengan tekanan maksimum 40

bar. Kriteria untuk memilih pompa MPLC meliputi: rentang laju aliran; ada

tidaknya peredam, yang menyediakan laju aliran dan tekanan selama

proses pemisahan dan meningkatkan reprodusibilitas pemisahan;

keberadaan perangkat pemutus tekanan; dan adanya pembuat gradien.

2. Kolom

Kolom adalah titik pusat ketika mengoptimalkan pemisahan kromatografi

preparatif dan kriteria seperti jumlah sampel yang akan dimurnikan,

jumlah bahan kemasan, dan penjang serta diameter kolom, harus

dipertimbangkan dengan cermat. Kolom MPLC umumnya terbuat dari

kaca tebal yang dilapisi denga plastik pelindung dan dapat menahan

tekanan sampai 50 bar; Namun, beberapa kolom dari beberapa produsen

tidak bisa menahan tekanan melebihi 20 bar. Kolom juga bervariasi dalam

penjang dan diameternya (i.d.), ukuran kolom ini digambarkan sebagai

volume pengisian. Volume pengisian ini berkisar antara 63 ml (9 mm (i.d.)

x 100 mm) sampai 15000 ml (105 mm i.d. x 1760 mm). Pemilihan dimensi

kolum bergantung pada jumlah sampel yang akan dipisahkan, dengan

kisaran antara 0,1 g dengan kolom paling kecil hingga 100 g dengan

kolom yang besar.

4. Detektor dan Rekorder

Monitoring pemisahan MPLC dapat dilakukan dengan KLT dari fraksi

yang terkumpulkan. Deteksi secara online juga rutin digunakan dengan

detektor panjang gelombang tunggal UV/Vis. Detektor UV biasanya

didesain untuk tujuan analisis dan fungsinya tidak memberi manfaat besar

dalah pemisahan preparatif. Akomodasi untuk laju aliran tinggi merupakan

prasyarat untuk detektor kromatografi preparatif.

5. Kolektor Fraksi

Pengumpulan otomatis dari fraksi dapat dilakukan dengan

menghubungkan kolektor fraksi dengan outlet kolom atau detektor.

Volume dari fraksi yang terkumpulkan bergantung pada diameter internal

kolom dan laju aliran. Pada standar pengaturan MPLC, kolektor frraksi

memiliki total kapasitas tube 240 x 20 ml, 120 x 50 ml, atau 48 x 250 ml.

Gambar 3. Medium Pressure Liquid Chromatography

II.2 Uraian Bahan

1. Etil asetat (1)

Nama Resmi : Etil asetat

Nama Lain : Etil asetat

RM : CH3CO.O.C2H5

Pemerian : Cairan, tidak berwarna, bau khas

Kelarutan : Larut dalam 15 bagian air, dapat bercampur dengan

etanol (95%)P dan dengan eter P.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai eluen dan larutan partisi

2. n-Heksana (1)

Nama resmi : HEXAMINUM

Nama lain : Heksamina

RM/BM : C6H12N4 / 140,19

Pemerian : hablur mengkilap, tidak berwarna atau serbuk

hablur putih, tidak berbau, rasa membakar dan

manis kemudian agak pahit. Jika di panaskan

dalam suhu ± 260⁰ menyublim.

Kelarutan : larut dalam 1,5 bagian air, dalam 12,5 ml etanol

(95 %) P dan dalam lebih kurang 10 bagian

kloroform P

Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : antiseptikum

BAB III

METODE KERJA

III. 1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah kolom, statif,

botol vial, botol coklat, gelas ukur, dan pipet tetes.

III.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan ekstrak jambu biji yang tidak larut heksan (non

polar), kapas, silica, n-heksan, etil asetat dan kapas.

III.2 Cara Kerja

Kromatografi Kolom

1. Disiapkan alat dan bahan

2. Dibuat gradian konsentrasi sesuai eluen terbaik yang didapatkan

3. Dimasukkan kapas kedalam kolom

4. Kemudian dimasukkan silika yang sebelumnya telah disuspensikan

dengan n-heksan dan dimampatkan

5. Dimasukkan kertas saring sesuai besar diameter kolom

6. Dimasukkan sampel sebanyak 1 gram

7. Dimasukkan gradient konsentrasi eluen dari yang paling non polar

hingga paling polar

8. Ditampung hasil dalam botol vial

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Percobaan

No Eluen Jumlah (ml) Warna fraksi

1 Heksan : Etil asetat = 10:1 50 ml Kekuningan




5 Heksan : Etil asetat = 1:3 50 ml Bening

6 Heksan : Etil asetat = 1:3 50 ml Bening

7 Heksan : Etil asetat = 1:4 50 ml Kehijauan




11 Etil asetat 100% 50 ml Bening

IV.2 Gambar Hasil Percobaan

Penimbangan ekstrak 1 gram

LABORATORIUM FITOKIMIAFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS HASANUDDIN

Penimbangan silika


Deret eluen yang digunakan


Proses kromatografi kolom


Penampungan fraksi hasil pemisahan


Fraksi hasil pemisahan dengan kromatograifi kolom


BAB V

PEMBAHASAN

Pada percobaan ini dilakukan pemisahan komponen senyawa pada

sampel ekstrak daun jambu biji (P. guajava) dengan menggunakan

kromatografi kolom. Alat dan bahan disiapkan, kemudian ditimbang silika

sebanyak 100 gram. Silika kemudian disuspensikan dengan n-heksan, lalu

dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding sembari dimampatkan agar tidak

ada gelembung udara dan keran kolom dibuka. Setelah silika mencapai dua

per tiga dari tinggi kolom, dimasukkan kertas saring ke dalam kolom, lalu

dimasukkan sampel yang telah diserbukkan sebelumnya dengan silika.

Ekstrak sampel yang digunakan yaitu ekstrak hasil partisi metode ECP yaitu

ekstrak tidak larut heksan, karena senyawa yang ingin diisolasi adalah

senyawa flavanoid yang sifatnya semi polar sampai polar.

Setelah itu, dimasukkan eluen mulai dari yang paling non polar, dan

ditampung hasil fraksi yang dihasilkan dalam vial yang telah dikalibrasi 5 ml.

Dimasukkan eluen atau campuran eluen berikutnya dari yang kurang polar

hingga yang paling polar. Ditampung hasilnya dalam vial.

Eluen yang digunakan adalah heksan:etil asetat = 10:1, heksan:etil =

8:1, heksan:etil asetat = 6:1, heksan:etil asetat = 4:1, heksan:etil asetat = 1:3,

heksan:etil asetat = 1:4, heksan:etil asetat = 1:6, heksan:etil asetat = 1:8,

heksan:etil asetat = 1:10, dan etil asetat 100% masing-masing sebanyak 50

ml. Elusi yang dilakukan pada kromatografi kolom dilakukan dari eluen non

polar ke eluen polar, agar pemisahan yang terjadi dapat menghasilkan

pemisahan senyawa yang baik, dimana ketika eluen polar yang terlebih

dahulu dilewatkan, maka senyawa yang sifatnya polar maupun non polar

akan ikut terelusi, karena kemampuan yang dimiliki oleh pelarut polar dapat

melarutkan senyawa yang sifatnya polar dan non polar sehingga pemisahan

tidak terjadi, berbeda ketika eluen non polar yang dilewatkan terlebih dahulu,

kemampuan eluen non polar hanya dapat melarutkan/mengelusi senyawa

non polar. Hasil partisi yang tertampung adalah 68 vial dengan berbagai

variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.

BAB VI

PENUTUP

VI.1 Kesimpulan

Dari kromatografi kolom yang dilakukan dengan menggunakan ekstrak

daun jambu biji (Psidium guajava) di dapatkan hasil fraksi sebanyak 68 vial

dengan berbagai variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.

VI.2 Saran

Semoga komunikasi antar praktikan dan asisten bisa lebih terjaga

sehingga segala hal yang berkaitan dengan praktikum dapat berjalan dengan

baik dan tidak terjadi kesalahpahaman.

DAFTAR PUSTAKA

1. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Departemen Kesehatan RI.

1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan Republik

Indonesia: Jakarta.

2. Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis.

Pustaka Pelajar: Yogyakarta.

3. Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar

Kromatografi. Penerbit ITB: Bandung.

4. J. B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern

Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB: Bandung.

5. K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara Kromatografi

Preparatif. Penerbit ITB: Bandung.

6. Skoog DA, West DM, Holler FJ. 1996. Fundamentals of Analytical

Chemistry. 7th edition. New York: Saunders College Publishing. Hal. 17-

25.

7. Alam, Gemini, dkk. 2011. Penuntun Pratikum Senyawa Bioaktif. Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin : Makassar

8. Kisman .Dr. Sastro ,ddk .1994. Analisis Farmasi Cet. 2 , Gadjah Mada

University Press, Yogyakarta

9. Johnson, Edward. 1991.Dasar Kromatografi Cair Penerbit ITB. Bandung

10.Soediro. I., dkk. 1986. Kromatografi Cepat Sebagai Cara

Fraksinasi Ekstrak Tanaman. Acta Pharmaceutica Indonesia

11.Adriana, Renalitha Devri. 2009. Skripsi : Aktivitas Antiplasmodium Fraksi

Non Polar Ekstrak Etanol Rimpang Temu Mangga. Universitas

Muhammadiah Fakultas FarmasI. Surakarta

12.Meronda, G.Rahmah. 2008. Kromatografi, Makalah. FFUH. Dikutip dari

Kromatografi Makalah journal. Makassar

13.Anonim. 2007. Kromatografi Kolom . (Online) http://www.chem-is- try.org .

Diakses tanggal 14 November 2011

14. Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991.

Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung.

15.Hostettmann, K and C. Terreaux. 2000. Medium-Pressure Liquid

Chromatography. University of Lausanne, Lausanne, Switzerland:

Academic Press.

http://www.chem-is-try.org/

http://www.chem-is-try.org/

LAMPIRAN

Skema Kerja

A. Kromatografi Cair Vakum

Penyiapan Ekstrak

Ekstrak ditimbang

Ekstrak herba Eupatorium Oderatum dikeringkan dengan penambahan silika

Sedikit demi sedikit

Digerus hingga kering

Sisa silika disimpan

Ekstrak siap digunakan

Proses Partisi

Disiapkan gelas masir dan erlenmeyer

Dirangkai alat vakum

Dimasukkan silica halus

mampatkan

Dimasukkan ekstrak kering

Dimasukkan kertas saring

Dimasukkan perbandingan eluen

Dinyalakan pompa vakum

Ditampung dimangkok

Diuapkan

B. Kromatografi Kolom

Penyiapan Bubur Silika

Ditimbang silika kasar dan ekstrak

Diperoleh bobot silika kasar 100x dari ekstrak

Dibagi menjadi 2 bagian

Bagian pertama dimasukkan di cawan porselen

Bagian kedua untuk penyiapan sampel

Dibasahkan dengan pelarut hexan

Diaduk-aduk hingga terbasahi semuanya

Diamkan beberapa saat (sekali-sekali diaduk)

Silika siap digunakan

Penyiapan Ekstrak

Ekstrak ditimbang

Ekstrak dikeringkan dengan penambahan sisa silika tadi

Sedikit demi sedikit

Digerus hingga kering

Sisa silika disimpan

Ekstrak siap digunakan

Proses Partisi

Dirangkai alat kolom

Dimasukkan kapas pada buret kolom

Dimasukkan bubur silika

mampatkan

Dimasukkan ekstrak kering

Dimasukkan kertas saring

Dimasukkan perbandingan eluen

Ditampung di vial

Diuapkan

LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI KOLOM DAN VAKUM

Documents

Transcript of LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI KOLOM DAN VAKUM