LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

MODUL RESPIRASI

KELOMPOK 5

Afiati

Faizal Rachman

Kiki Rosmayanti

Maya Damayanti

Muhammad Arif Rahman

Muhammad Fahreza Kautsar

Seflan Syahrir Ahliadi

Siti Nashratul Kamila

Tiara Putri Methas

Wulan Roudotul Zanah

PROGRAM STUI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

1

DAFTAR ISI

Daftar Isi…………………………………………………………………………………. 2

Praktikum I

Pengukuran Kadar Peroksida Lipid Dalam Cairan Biologis…………………………. 3

Praktikum II

Uji Oksihemoglobin & Deoksihemoglobin……………………………………………… 6

Praktikum III

Uji Untuk Methemoglobin………………………………………………………………. 9

Praktikum IV

Hemolisis Sel Darah Merah……………………………………………………………… 13

Praktikum V

Pengaruh Pelarut Organik Terhadap Sel Darah Merah………………………………. 17

2

Praktikum 1

PENGUKURAN KADAR PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS

A. Tujuan

Menetapkan Kadar Peroksida Lipid Dalam Cairan Biologis

B. Dasar Teori

1. Radikal Bebas

Radikal bebas adalah suatu atom, gugus, atau molekul yang memiliki satu atau

lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit paling luar, termasuk atom hidrogen,

logam-logam transisi, dan molekul oksigen. Adanya ‘elektron tidak berpasangan’ ini,

menyebabkan radikal bebas secara kimiawi menjadi sangat aktif. Radikal bebas dapat

bermuatan positif (kation), negatif (anion), atau tidak bermuatan .

Sumber radikal bebas bisa berasal dari proses metabolisme dalam tubuh (internal)

dan dapat berasal dari luar tubuh (eksternal). Dari dalam tubuh mencakup superoksida

(O2*), hidroksil (*OH), peroksil (ROO*), hidrogen peroksida (H2O2), singlet oksigen

(O2), oksida nitrit (NO*), dan peroksinitrit (ONOO*). Dari luar tubuh antara lain berasal

dari: asap rokok, polusi, radiasi, sinar UV, obat, pestisida, limbah industri, dan

ozon .Radikal bebas pada umumnya dapat mempunyai efek yang sangat menguntungkan,

seperti membantu destruksi sel-sel mikroorganisme dan kanker. Akan tetapi, produksi

radikal bebas yang berlebihan dan produksi antioksidan yang tidak memadai dapat

menyebabkan kerusakan sel-sel jaringan dan enzimenzim. Kerusakan jaringan dapat

terjadi akibat gangguan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas asam lemak atau

dikenal sebagai peroksidasi lipid.

Aktivitas radikal bebas dapat menjadi penyebab atau mendasari berbagai keadaan

patologis. Di antara senyawa-senyawa oksigen reaktif, radikal hidroksil (‘OH)

merupakan senyawa yang paling berbahaya karena mempunyai tingkat reaktivitas sangat

tinggi. Radikal hidroksil dapat merusak tiga jenis senyawa yang penting untuk

mempertahankan integritas sel yaitu:

3

(1) Asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) yang merupakan komponen penting fosfolipid

penyusun membran sel

(2) DNA, yang merupakan piranti genetik dari sel.

(3) Protein, yang memegang berbagai peran penting seperti enzim, reseptor, antibodi,

pembentuk matriks, dan sitoskeleton .

Regulasi jumlah radikal bebas secara normal dalam sistem biologis tubuh

dilakukan oleh enzim-enzim antioksidan endogenous seperti enzim SOD, GPx, dan CAT.

Pengukuran radikal bebas di dalam tubuh sangat sulit dilakukan karena radikal bebas

bereaksi sangat cepat sehingga seringkali dilakukan pengukuran tidak langsung melalui

produk turunannya seperti MDA dan 4-hidroksinonenal. Kedua senyawa tersebut sering

digunakan untuk pengukuran reaksi radikal bebas lipid .

2. Malondialdehida (MDA)

MDA merupakan produk enzimatis dan nonenzimatis dari pemecahan

prostaglandin endoperoksida dan produk akhir dari lipid peroksidasi. MDA merupakan

molekul reaktif yang memiliki rumus molekul C3H4O2 dan dikenal sebagai penanda

(marker) peroksidasi lipid.

Pengukuran MDA banyak dilakukan oleh para peneliti sebagai indeks tidak

langsung dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh peroksidasi lipid. prinsip

pengukuran MDA adalah rekasi satu molekul MDA dengan dua molekul asam

tiobarbiturat (TBA) membentuk kompleks senyawa MDA-TBA yang berwarna pink dan

kuantitasnya dapat dibaca dengan spektrofotometer.

C. Alat dan Bahan tabung sentrifuge 6 buah kit 2 buah spektofotometer rak tabung darah EDTA dari OP 1 darah EDTA dari OP 2 TCA 0,67%

4

TBA aquades

D. Cara Kerja

1. Ambil darah OP kedalam 2 tabung sentrifuge masing-masing 25 ml (beri tanda 1 untuk darah OP 1, beri tanda 2 untuk darah OP 2)dan 1 tabung sentrifuge lain sebagai blanko diisi oleh 25ml aquades (sebagai kontrol)

2. Tetesi 0,75 ml TCA 0,67% kedalam 3 tabung diatas, kocok dulu sebentar mencampur bahan

3. Letakan tabung sentrifuge kedalam alat senftrifuge lalu atur kecepatan alat sentrifuge dan tunggu sampai alat sentrifuge berhenti

4. Setelah berhenti, lalu ambil masing-masing tabung sentrifuge tersebut.5. Ambil supernatan dari masing-masing tabung sentrifuge lalu masukan kedalam tabung

sentrifuge baru yang telah diisi oleh TCA, lalu beri label S1 untuk darah dari sampel 1, S2 untuk darah dari, dan B untuk blanko.

6. Masukan masing-masing sampel kedalam kit secara bergantian lalu baca di Spektofotometer pada gelombang 560nm.

7. Setelah itu hitung kadar MDA.

E. Hasil

Rumus menghitung kadar MDA :

Kadar MDA =

Ɛ = 153.000

F. Kesimpulan

Seharusnya nilai MDA normal itu nol. Namun, pada kedua OP yang diuji ternyata memiliki nilai MDA>0. Karena MDA merupakan salah satu hasil dari reaksi radikal bebas dengan lipid, berarti terdapat radikal bebas didalam tubuh para OP yang melebihi kadar antioksidan.

5

Bahan Absorban Kadar MDA

Blanko 0,023 A 1,5 x 10-7

S1 0,085 A 5,5 x 10-7

S2 0,136 8,8 x 10-7

Praktikum II

UJI OKSIHEMOGLOBIN & DEOKSIHEMOGLOBIN

A. TujuanMembuktikan hemoglobin dapat mengikat oksigen membentuk oksihemoglobin

(HbO2) dan dapat terurai kembali menjadi O2 dan deoksihemoglobin.

B. Dasar Teori

Hemoglobin merupakan pembawa 02 yang baik. Hemoglobin merupakan protein yang tersusun dari empat subunit yang masing-masing berisis heme yang separuhnya menempel pada rantai polipeptida. Pada orang dewasa yang normal, kebanyakan hemoglobin berisi dua rantai alfa dan dua rantai beta. Heme merupakan komplek cincin porfrin yang meliputi satu atom ferrous besi. Masing-masing atom besi tersebut secara reversible dapat mengikat satu molekul oksigen. Besi tersebut selalu dalam bentuk ferrous sehingga reaksi tersebut dinamakan oksigenasi. Reaksi hemoglobin dengan oksigen adalah:

Hb(Fe2+) + O2  Hb(Fe2+)O2

Karena berisi empat deoksihemoglobin, molekul hemoglobin juga dipresentasikan sebagai Hb4 dan beraksi dengan empat oksigen untuk membentuk Hb4O8. Reaksinya berjalan sangat cepat hanya kurg dari 0,01 detik

Hemoglobin berfungsi untuk :

1.Mengikat dan membawa oksigen dari paru-paru keseluruh jaringan tubuh

2.Mengikat dan membawa karbondioksida dari seluruh jaringan tubuh ke paru-paru

3.Memberi warna merah pada darah

4.Mempertahankan keseimbangan asam basa dari tubuh

Pengujian kali ini bertujuan untuk memperlihatkan bahwa hemoglobin dapat mengikat oksigen menjadi HbO2 dan senyawa ini dapat terurai kembali menjadi deoksi Hb dan O2. Dalam keadaan tereduksi, Fe dalam hemoglobin dapat mengikat O2 menjadi HbO2. Dan HbO2 akan melepas 02 pada penambahan reaksi stokes.

C. Alat dan Bahan Darah segar Pereaksi Stokes

6

Larutan NH4OH

D. Cara Kerja OksiHb

1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 1 mL darah dengan 5 ml air suling. Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksiHb yang terbentuk.

2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing – masing tabung berisi 3 mL. Gunakan tabung 1 sebagai control.

Pembentuk deoksiHb1. Isi tabung ketiga dengan 1 mL pereaksi stokes dan tambahkan NH4OH

secukupnya untuk melarutkan untuk melarutkan endapan yang akan segera terbentuk. Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat.

2. Masukkan beberapa tetes larutan stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.

7

Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb1. Kocok kuat – kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali

oksigenasidari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk.2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang –ulang.

E. Hasil

Hasil Tabung 1 Tabung 2

Warna yang terbentuk Merah terang Merah gelap

F. Kesimpulan

Hemoglobin dapat mengikat oksigen dalam bentuk oksihemoglobin dan dapat terurai menjadi deoksihemoglobin

Pertanyaan :

Peristiwa faal apakah yang ditiru dari percobaan ini?

Jawab:

Peristiwa yang ditiru adalah peristiwa pertukaran gas O2 dialveolus di mana setelah O2 berhasil masuk ke aliran darah akan diikat oleh hemoglobin menjadi oksihemoglobin dan ketika sampai dijaringan yang membutuhkan O2, ikatan Hb dan O2

dilepas dan akan membentuk deoksihemoglobin.

G. Daftar PustakaBarret KE, Barman SM, Boitano S, Brooks HL. 2010. Ganong’s Review of Medical Physiology: gas Transport dan pH dalam Paru. 23rd. United States: Mc Graw Hill.

8

Praktikum III

UJI UNTUK METHEMOGLOBIN

A. Tujuan

Memperlihatkan bila besi (Fe2+) dalam molekul hemoglobin dioksidasi menjadi

Fe3+, maka terbentuk metHb yang tidak bisa lagi mengikat oksigen.

B. Dasar Teori

1. Methemoglobin

Pada methemoglobinemia, besi heme adalah ferri bukan ferro. Jadi,

methemoglobin tidak dapat mengikat atau mengangkut O2. Secara normal, enzim

methemoglobin reduktase mereduksi Fe3+ methemoglobin menjadi Fe2+. Methemoglobin

dapat terbentuk oleh oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ sebagai efek samping obat, seperti

sulfonamide, dari hemoglobin M herediter atau akibat berkurangnya aktivitas enzim

methemoglobin reduktase.

Pada hemoglobin M, histidin F8 (His F8) diganti oleh tirosin. Besi pada HbM

membentuk kompleks ionic ketat dengan anion fenolat tirosin yang menstabilkan bentuk

Fe3+. Di varian hemoglobin M rantai alfa, keseimbangan R-T menguntungkan keadaan T.

Afinitas oksigen berkurang, dan efek Bohr tidak dijumpai. Varian hemoglobin M rantai

beta memperlihatkan pertukaran R-T sehingga terjadi efek Bohr.

Mutasi yang menguntungkan keadaan R (misalnya hemoglobin Chesapeake)

meningkatkan afinitas O2. Jadi, hemoglobin tidak dapat menyalurkan O2 secara memadai

ke jarigan perifer. Hipoksia jaringan yang terjadi menyebabkan polisitemia, suatu

peningkatan konsentrasi eritrosit.

2. Reaksi

Hb (Fe2+) + K3Fe(CN)6 Hb(Fe3+) + K4Fe(CN)6

Hb Oksidator MetHb

MetHb ini tidak dapat lagi mengikat oksigen.

9

C. Alat dan Bahan

1. Darah segar

2. Pereaksi K3Fe(CN)6

3. Pereaksi Stokes

4. Tabung reaksi

5. Pipet

D. Cara Kerja

1. Ambil sample darah sebanyak 1 mL, lalu encerkan dengan menambahkan 9 mL

aquades dalam tabung reaksi.

2. Bagilah darah yang telah diencerkan tersebut ke dalam 2 tabung reaksi, masing-

masing sebanyak 5 mL. Menjadi tabung A dan tabung B.

3. Salah satu tabung (Tabung A) tambahkan 5 mL dari K3Fe(CN)6 33% lalu kocok

tabung dengan kuat. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Lalu

tambahkan peraksi Stokes ke dalam tabung tersebut dan kocok kuat-kuat. Perubahan

yang terjadi diperhatikan dan dicatat.

4. Tabung yang lain (Tabung B) dipanaskan sebentar, lalu tambahkan 5 mL K3Fe(CN)6.

Campurkan dengan membalik-balikkan tabung (tutup tabungnya terlebih dahulu).

Perhatikan perubahan warna yang terjadi dan adakah gelembung- gelembung oksigen

yang terbentuk.

10

1ml darah+ 9ml aquades

Dipanaskan sebentar

E. Hasil

Tabung A Perubahan (Warna darah dan gelembung)

Setelah + K3Fe(CN)6 Warna coklat tua

Setelah pengocokkan kuat Ada gelembung (+)

Setelah + Stokes Warna hitam

Setelah pengocokkan kuat Ada banyak gelembung (+++)

Tabung B Perubahan (Warna darah dan gelembung)

Setelah dipanaskan Warna coklat muda

Setelah + K3Fe(CN)6 Warna coklat tua

Setelah pengocokkan kuat Ada gelembung-gelembung (++)

F. Kesimpulan

Pada percobaan ini, terbentuk methemoglobin akibat oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+

oleh K3Fe(CN)6 dan penambahan stokes karena stokes menghomogenkan pereaksi stokes

dengan darah, sehingga oksigen akan dilepas. Oleh karena telah terbentuk

methemoglobin, maka tidak bias lagi mengikat oksigen. Lepasnya oksigen ini terlihat

11

dari adanya gelembung-gelembung diatas campuran darah, K3Fe(CN)6, dan pereaksi

stokes.

G. Daftar Pustaka

Murray, Robert K. 2009. Biokimia Harper Edisi 27. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

12

Praktikum IV

HEMOLISIS SEL DARAH MERAH

A. Tujuan

Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonil terhadap membran sel darah

merah.

B. Dasar Teori

Dalam larutan Hipotonis sel darah merah akan menggembung karena cairan dari

luar sel akan masuk ke dalam sel darah merah. Bila pembengkakan SDM akan larut

dalam cairan hipotonik sehingga larutan akan berwarna merah jernih. Di dalam larutan

hipertonik terhadap tekanan osmotik plasma darah maka cairan dari SDM akan keluar

dari sel sehingga SDM akan mengkerut (crenated).

C. Alat dan Bahan

Darah segar

Larutan NaCl 2%

D. Cara Kerja

1. Ke dalam 10 tabung reaksi isikan campuran berikut :

Tabung Air (ml) NaCl 2% (ml) % NaCl Teori Praktikum

1 10 - 0 100

2 9 1 0,2 90

3 8 2 0,4 80

4 7,5 2,5 0,5 75

5 7 3 0,6 70

13

6 6,5 3,5 0,7 65

7 6 4 0,8 60

8 5,5 4,5 0,9 55

9 5 5 1,0 50

10 4,5 5,5 1,1 45

2. Campur dengan baik

3. Tambahkan 2 tetes suspensi ke dalam setiap tabung dan kocok dengan membalik-

balikan tabung perlahan. Diamkan selama satu jam.

4. Perhatikan dan catatlah derajat hmolisis pada tiap tabung.

E. Hasil

Tabung %NaCl Hemolisis Tabung %NaCl Hemolisis

1 0 + 6 0,7 +

2 0,2 + 7 0,8 +

3 0,4 + 8 0,9 -

4 0,5 + 9 1 -

5 0,6 + 10 1,1 -

14

Pembahasan

Dari data yang tertera pada tabel diatas dapat diketahui bahwa beberapa tanbung

telah terjadi hemolisis. Dengan dibuktikan adanya larutan yang berwarna lebih merah

dari yang lainnya, hal tersebut terjadi karena hemoglobin yang ada pada eritrosit tersebut

keluar ke media disekelilingnya yang diakibatkan pecahnya plasma darah, hal tersebut

akibat pecahnya membran eritrosit, sehingga hemoglobin bebas ke dalam medium

sekelilingnya (plasma). Kerusakan membran eritrosit dapat disebabkan oleh antara lain

penambahan larutan hipotonis, hipertonis kedalam darah, penurunan tekanan permukaan

membran eritrosit, zat/unsur kimia tertentu, pemanasan dan pendinginan, rapuh karena

ketuaan dalam sirkulasi darah dll.

Apabila medium di sekitar eritrosit menjadi hipotonis (karena penambahan

larutan NaCl hipotonis) medium tersebut (plasma dan lrt. NaCl) akan masuk ke dalam

eritrosit melalui membran yang bersifat semipermiabel dan menyebabkan sel eritrosit

menggembung. Bila membran tidak kuat lagi menahan tekanan yang ada di dalam sel

eritrosit itu sendiri, maka sel akan pecah, akibatnya hemoglobin akan bebas ke dalam

medium sekelilingnya. Sebaliknya bila eritrosit berada pada medium yang hipertonis,

15

maka cairan eritrosit akan keluar menuju ke medium luar eritrosit (plasma), akibatnya

eritrosit akan keriput (krenasi). Keriput ini dapat dikembalikan dengan cara

menambahkan cairan isotonis ke dalam medium luar eritrosit (plasma). Jika phi cairan <

phi darah, maka cairan bersifat hipotonik terhadap plasma darah. Hal ini menyebabkan

aliran pelarut air dari cairan ke plasma darah. Akibatnya sel darah merah akan

mengembang dan dapat pecah. Adanya hemoglobin dalam darah menimbulkan timbulnya

warna merah dalam darah dan hemoglobin tersebut merupakan suatu senyawa organik

yang kompleks yang terdiri dari empat pigmen porfirin merah.

Fragilitas sel darah merah mencerminkan kemampuan sel darah merah untuk

memasukkan sejumlah larutan sebelum sel darah merah tersebut lisis akibat membran

selnya tertekan oleh larutan di dalam sel yang memiliki tekanan osmotik lebih tinggi

dibandingkan dengan diluar sel. Larutan yang memiliki tekanan osmotik lebih rendah

dibandingkan dengan tekanan osmotik di dalam sel darah merah disebut larutan

hipotonis

Jika sel darah merah berada dalam larutan hipertonis, yaitu larutan yang

memiliki tekanan osmotik lebih tinggi jika dibandingkan dengan tekanan osmotik di

dalam sel, maka sel darah merah akan mengalami krenasi karena cairan di dalam sel

darah merah keluar ke cairan di sekitarnya

Sedangkan Jika sel darah merah berada pada larutan hipertonis,yaitu larutan

yang memiliki tekanan osmotik lebih rendah jika dibandingkan dengan tekanan osmotik

di dalam sel,maka sel darah merah akan bertambah volumenya hingga

pecah(hemolisis).adanya hemolisis ini akan menyebabkan larutan menjadi berwarna

keruh karena isi sel darah merah keluar.

F. Kesimpulan

Peristiwa hemolisis terjadi pada larutan yang hipotonis, yaitu air hingga larutan

NaCl 0,8 % . Adanya hemolisis menyebabkan cairan dan zat-zat lain dalam sel darah

merah akan keluar menuju larutan sehingga larutan akan berwarna keruh.

16

Praktikum V

PENGARUH PELARUT ORGANIK TERHADAP SEL DARAH MERAH

A. Tujuan

Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah dapat mengalami lisis dalam pelarut organik tertentu.

B. Dasar Teori

Membran SDM antara lain mengandung lipid. Pelarut organik tertentu yang bersifat melarutkan lemak anak menyebabkan lipid membran larut sehingga terjadi hemolisis.

Dinding sel darah merah adalah suatu lipoprotein. Lemak merupakan pelarut organik. Dalam pelarut lemak, dinding ini akan larut, sehingga bila sel darah merah dimasukkan dalam pelarut lemak akan terjadi hemolisis. Oleh karena itu, lemak termasuk larutan hipotonis karena dapat membuat sel darah merah menjadi lisis.

C. Alat dan Bahan

Tabung reaksi Pipet Darah segar Larutan NaCl 0,9% Kloroform Eter Aseton Alkohol Toluen

D. Cara Kerja

1. Ke dalam 5 tabung reaksi, masukkan setiap 10ml larutan NaCl 0,9%.

17

2. Tambahkan setiap 2 tetes klororfom (tabung 1), eter (tabung 2), aseton (tabung 3), toluen (tabung 4) dan alkohol (tabung 5) secara berurutan

3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam (30 menit)

4. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan tabung lainnya

E. Hasil

1. Pada hasil percobaan ini didapatkan bawah larutan yang terdapat didalam tabung yang awalnya berwarna merah, lama kelamaan berubah menjadi pucat perlahan-lahan mulai dari bagian atasnya

2. Keadaan tersebut dipengaruhi oleh kadar zat pelarut organik yang diberikan ke dalam larutan

3. Pada percobaan yang ini, zat pelarut organik yang diberikan sedikit, sehingga efek hemolisis yang muncul pun juga sedikit

F. Kesimpulan

Sel darah merah akan mengalami lisis jika bereaksi dengan zat pelarut organik, yang bersifat melarutkan lemak.

18

Nomor tabung Pelarut Hemolisis

1 Kloroform +

2 Eter +

3 Aseton +

4 Toluen +

5 Alkohol +

G. Daftar Pustaka

Murray, Robert K. 2009. Biokimia Harper Edisi 27. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

19