Media MS
-
Upload
jamilatus-sadiyah -
Category
Documents
-
view
12 -
download
0
description
Transcript of Media MS
PEMBUATAN MEDIA MURASHIGE DAN SKOOG (MS)
Laporan PraktikumUntuk memenuhi tugas Matakuliah Kultur Jaringan Tumbuhan
yang dibina oleh Ibu Balqis, S.Pd., M.Si dan Ibu Frida Kunti Setiowati, S.Si, M.Si
Oleh:Kelompok II
Alfian Oktavijayanti (110341421527)Jamilatus Sa’diyah (110341421534)Novy Kurnia Rikardo (10342422006)
The Learning University
UNIVERSITAS NEGERI MALANGFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGIFebruari 2015
A. Topik
Pembuatan Media
B. Hari/Tanggal
Rabu/11-Februari-2015
C. Tujuan
1) Untuk mempraktikkan cara membuat media dengan tepat
D. Dasar Teori
Kebutuhan nutrisi sel dan jaringan tumbuhan yang dikultur penting untuk
diperhatikan supaya kultur jaringan tumbuhan berhasil. Nutrisi untuk sel dan jaringan
yang dikultur terdiri atas komponen utama dan komponen tambahan. Komponen utama
meliputi bahan mineral, sumber karbon (gula), vitamin, dan zat pengatur tumbuh (ZPT).
Komponen lain seperti senyawa nitrogen organik, asam-asam organik, metabolit dan
ekstrak tambahan tidak mutlak diperlukan, tetapi dapat menguntungkan pertahanan sel dan
perbanyakannya (Margono dan Balqis, 2003). Tanaman dapat tumbuh pada kondisi in
vitro ketika tersedia media yang terspesialisasi. Media biasanya terdiri dari larutan garan
yang menyediakan kebutuhan unsur mayor dan minor untuk pertumbuhan tumbuhan
(George et al, 2008).
Praktikum di laboratorium memerlukan kepraktisan, maka senyawa yang digunakan
untuk membuat media disiapkan dalam bentuk stok larutan. Stok larutan dapat dibuat
secara terpisah atau dicampur tergantung apakah senyawa tersebut bereaksi satu dengan
yang lain atau tidak. Jika suatu jenis medium menggunakan banyak stok larutan dalam
komposisinya, maka larutan stok perlu disiapkan dalam kuantitas yang banyak. Demikian
pula sebaliknya (Margono, 2001).
Terfokus pada ZPT. Terdapat 2 kelompok ZPT penting, yaitu sitokinin dan auksin.
Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel,
jaringan, dan kultur organ. Perimbangan konsentrasi dan interaksi antara ZPT yang
diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen akan menentukan
arah perkembangan suatu kultur (Karjadi dan Buchori, 2007).
Untuk memudahkan pembuatan, media dibagai-bagi dalam kelompok larutan stok,
yaitu stok elemen makro, elemen mikro, besi suplemen organik, auksin dan sitokinin.
Setiap kelompok ini dibuat secara terpisah. Umumnya larutan stok dibuat dalam jumlah
besar yang ekivalen dengan kandungan zat-zat yang menyususnnya dalam 1 L medium.
Larutan stok disimpan dalam almari pendingin dan dikeluarkan pada saat pembuatan
media saja (Margono dan Balqis, 2003).
E. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain.
1. Erlenmeyer 100 ml
2. Beaker glass 250 ml
3. Batang pengaduk
4. Gelas ukur 100 ml
5. Neraca digital
6. Kompor
7. Autoklaf
8. Nampan plastik
9. Botol stok
10. Botol kultur
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain.
1. Makronutrien
2. Iron
3. Mikronutrien
4. Vitamin
5. Zat pengatur tumbuh
6. Myo-Inositol
7. Sukrosa
8. Agar
9. Kertas pH indikator
10. Aquades
11. Alkohol 70%
12. HCl
13. NaOH
F. Langkah Kerja
1. Pembuatan Larutan Stok
2. Pembuatan Medium
*dilakukan 2x akan tetapi larutan kedua tanpa norit
Menimbang Makronutrien 5x (mg/250 ml) stok A yg terdiri dari: NH
4
NO
3
8250 mg, KNO
3
9500 mg, MgSO
4
7H
2
O 1850 mg, KH
2
PO
4
850 mg kemudian dilarutkan dalam 250 ml aquades
Membuat larutan stok B yaitu CaCl
2
2H2O 2200 mg dilarutkan dal HCl sedikit kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml
Membuat larutasn stok C (5x mg/250ml) yaitu N
2
EDTA 18,65 mg dan F
2
SO
4
7H
2
O 139 mg kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml
Membuat larutan D mikronutrien (10x mg/250ml) yaitu MnSO
4
H
2
O 223 mg, ZnSO
4
4H
2
O 86 mg, H
3
BO
3
62 mg, KI 8,3 mg, NaMoO
4
2H
2
O 2,5 mg CuSO
4
5H
2
O 0,25 mg, CaCl
2
6H
2
O 0,25 mg kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml.
Membuat larutan E (vitamin 100 ppm mg/100ml) Nicotinic acid 5ml, Pyridoxine-HCl 5ml
Membuat larutan F-ZPT (5x dalam 250 ml) yaitu myo-inositol 5mg dalam 250ml aqyades
Mencampurkan larutan stok A, B, C, D, Vitamin, dan ZPT dengan gula 30 g ke dalam
Menambahkan aquades hingga 250 ml ke dalam erlenmeyer
dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml daiduk dan di cek pHnya menggunakan kertas pH indikator universal khusus. Jika < 5,7 tambahkan NaOH+
, jika > 5,7 tambahkan HCl kemudian tambahkan norit 2gr dan agar 7gr
Panaskan di atas kompor yang dialasi kassa dan tuangkan dalam botol kultur yang telah disterilisasi 1/5 bagian dengan cepat sebelum memadat
sterilisasi dengan autoiklaf +/- 1 jam dan simpan di tempat yang steril
G. Analisis Data
Pada praktikum kali ini membuat medium. Proses membuat medium ada 2 tahapan
yaitu membuat larutan stok dan membuat medium disertai sterilisasi. Proses pembuatan
larutan stok terlebih dahulu dilakukan penghitungan untuk menimbang bahan dan berapa
kali harus memipet. Pembuatan stok ada berbagai macam. Ada stok A,B, C, D, E, dan F.
Stok A adalaha larutan makronutrien 5x (mg/liter). Cara penghitungan larutan stok A
adalah sebagai berikut.
• NH4NO3 = 1650 × 5 = 8250 mg,
• KNO3 =1900 × 5 = 9500 mg
• MgSO47H2O = 370 × 5 =1850 mg,
• KH2PO4 = 170 × 5 =850 mg
Cara penghitungan larutan stok B 5x (mg/250ml)adalah sebagai berikut.
• CaCl2 2H2O = 440×5 = 2200 mg
dilarutkan dal HCl sedikit kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml
Larutan Stok C adalahIRON 5x (mg/250 ml). Cara penghitungan larutan stok C adalah
sebagai berikut.
• N2EDTA = 37,3×5 =18,65 mg
• F2SO47H2O = 27,8×5 =139 mg
Larutan Stok D adalah Mikronutrien 10x (mg/250ml). Cara penghitungan larutan stok D
adalah sebagai berikut.
• MnSO4H2O = 22,3 ×10 = 223 mg,
• ZnSO44H2O = 8,6 ×10 = 86 mg,
• H3BO3 = 6,2 ×10 = 62 mg,
• KI = 0,83×10 = 8,3 mg,
• NaMoO42H2O = 0,25×10 = 2,5 mg
• CuSO45H2O = 0,025×10 = 0,25 mg,
• CaCl26H2O = 0,025×10 = 0,25 mg
Larutan Stok E adalah Vitamin 5x(100 ppm mg/100ml). Vitamin yang dihitung hanya
Nicotinic acid dan pyridoxine-HCl. Cara penghitungan larutan stok E adalah sebagai
berikut.
Ditambahkanaquades dan dilarutkan sampai 250 ml
ditambahkan aquades dan dilarutkan sampai 250 ml
ditambahkan aquades dan dilarutkan sampai 250 ml
• Nicotinic acid
Vp = Ve× Ke
Kp
= 1000× 0,5100 ppm
= 5ml
• Pyridoxine-HCl 5ml dalam 250 ml
Vp = Ve× Ke
Kp
= 1000× 0,5100 ppm
= 5ml
Larutan Stok F adalah ZPT 5x(mg/250 ml). ZPT yang dihitung hanya Myo-Cara
penghitungan larutan stok F adalah sebagai berikut.
500 mg ditambahkan 250 ml aquades
= 250/5 gr= 5x
• Myo-inositol yang dipipet Vp = Ve× Ke
Kp
= 1000× 0,5100 ppm
= 5ml
Setelah semua larutan stok dismpan di dalam lemari es, larutan stok siap untuk
dicampukan dengan sukrosa, agar dan aquades. Mula-mula gula dilarutkan di dalam
erlenmeyer dengan aquades, kemudian dimasukkan larutan stok sesuai label dan
ditambahkan aquades hingga 1 liter. Tabung dikocok agar larutan tercampur rata
kemudian dituangkan ke dalam beaker glass dan di cek pH menggunakan kertas indikator
universal khusus. Jika < 5,7 tambahkan NaOH+, jika > 5,7 tambahkan HCl kemudian
tambahkan norit 2gr dan agar 7gr. Larutan dipanaskan di atas kompor yang dialasi kassa
dan ditunggu hinga mendidih. Larutan tersebut dituangkan pada botol kurtul steril +/- 1/5
bagian. Proses ini harus dilakukan dengan cepat agar larutan tidak memadat. Setelah ituu
botol kultur berisi medium disterilisasi menggunakan autoklas 1 jam. Setelah itu botol
dikeluarkan dan digoyang agar larutan tercampur rata. Kemudian dismpan di lemari
medium yang steril.
H. Pembahasan
Media merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam proses perbanyakan
tanaman dengan teknik kultur secara in vitro. Karenanya dalam proses pembuatan media
diperlukan cara yang tepat dan steril serta ukuran tertentu terhadap berbagai komponen
yang akan dicampurkan sebagai media kultur. Hal ini sesuai dengan pernyataan Rahardja
(2003) bahwa untuk membuat media dengan komposisi tertentu diperlukan penimbangan
dan penakaran bahan secara tepat karena ketidak tepatan ukuran dapat menyebabkan
terjadinya proses yang tidak dikehendaki.
Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman in vitrodengan maksud
memberikan nutrisi sesuai dengan kebutuhan sel-sel tanaman tersebut secara alami sebagai
tanaman utuh yang tumbuh dialam. Tumbuhan dialam bebas bersifat autotrof, memerlukan
nutrient sederhana yang terdapat didalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk
meneruskan siklus hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh
tumbuhan tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro
tumbuhan, untuk keperluan hidupnya sel-sel pada eksplan juga memerlukan nutrient yang
komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak telah kehilangan sifat
autotrofnya (Santoso, 2003).
Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalisasikan
pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang akan dikulturkan. Pemilihan medium
tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-
masing kegiatan praktikum yang diinginkan. Isi dan komposisi dari medium kultur
dirancang secara khusus untuk tujuan yang berbeda. Dalam praktikum ini media yang
dibuat adalah media Murashige dan Skoog yang dikenal dengan medium MS. Menurut
Gunawan (1994) medium MS merupakan medium yang sangat banyak digunakan untuk
kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium ini mengandung garam-garam
mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat.
Komposisi yang digunakan dalam praktikum pembuatan medium MS meliputi larutan stok
A, B, C, D, E, F, agar, dan gula dengan kadar tertentu. Setiap bahan yang dicampurkan
dalam medium MS tersebut memeliki manfa’at dan tujuan tertentu pada pertumbuhan dan
perkembangan tanaman kultur.
Larutan Stok A yang dicampurkan dalam meium MS adalah larutan makronutrien
yang terdiri dari NH4NO3 , KNO3, MgSO47H2O, dan KH2PO4. Larutan stok B adalah
larutan CaCl2 2H2O yang juga merupakan unsur makro yang dibutuhkan tanaman. Unsur
makro yang dibutuhkan tanaman kultur dalam prosesnya secara in vitro diberikan dalam
bentuk persenyawaan. Hal ini bersesuaian dengan pernyataan Santoso (2003) bahwa unsur
makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya diberikan dalam bentuk
persenyawaan. beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan pada medium
kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; CaCl2. 2H2O;
MgSO2. 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. 2H2O; Na2SO4; (NH4)2SO4;
NH4Cl; dan K2SO4.
Unsur makro yang dibutuhkan oleh tanaman diantaranya meliputi; Nitrogen, Fosfor,
Kalium, Sulfur, Calsium, dan magnesium. Nitrogen diberikan dalam bentuk persenyawaan
yang bermacam-macam, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3;
NH4H2PO4; (NH4)2SO4; NH4Cl. Kebutuhan N terbesar adalah untuk menyusun asam-
asam nukleat, protein, sebagai koenzym atau persenyawaan lain yang mengandung N
seperti klorofil, alkaloid, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen.
Medium Murashige dan Skoog (MS) menyediakan nitrogen dalam bentuk garam
NH4NO3, ini merupakan strategi yang baik dan mempunyai keuntungan ganda, karena
selain sumber N nya lengkap juga dalam bentuk garam effeknya terhadap penurunan pH
medium berkurang (George dan Sherrington, 1984).
Fosfor diberikan pada medium kultur jaringan dalam bentuk persenyawaan KH2PO4
atau K2HPO4; NH4H2PO4; NaH2 PO4. Dalam praktikum ini senyawa yang ditambahkan
dalam bentuk KH2PO4 . Unsur fosfor didalam sel diubah menjadi persenyawaan RNA dan
DNA yang sangat penting yang bertanggung jawab atas sifat-sifat keturunan. Unsur P juga
diperlukan sebagai aktifator enzim untuk memacu pertumbuhan pada jaringan
meristematik. Kelebihan unsur P dapat menghambat pertumbuhan eksplan, karena akan
terjadi persaingan penyerapan deng9an unsur lain seperti seng (Zn), besi (Fe) dan tembaga
(George dan Sherrington, 1984).
Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KNO3; KH2PO4 atau K2HPO4, KCl;
dan K2SO4. Unsur K sangat diperlukan untuk memacu pembelahan sel, sintesa
karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat. Kalium
berpengaruh pada hidratasi, menambah atau mengurangi hidratasi pada misel sehingga
mempengaruhi keluar masuknya nutrien ke dalam sel. Sulfur atau belerang diberikan pada
medium dalam bentuk MgSO4. 7H2O; (NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4.7H2O;
MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; CuSO4. 5H2O. Sulfur ada didalam beberapa molekul
protein dan koenzym. Memacu perkembangan akar, juga berguna untuk ketahanan atau
proteksi tubuh tumbuhan (George, E. F., dan P. D. Sherrington, 1984).
Calcium diberikan pada medium dalam bentuk Ca(NO3). 4H2O; CaCl2.2H2O; Ca3
(PO4)2. Dalam praktikum ini calcium dibuat larutan stok B dengan persenyawaan yang
digunakan berupa CaCl2 2H2O. Calcium mempengaruhi hidratasi, permeabilitas,
penyerapan nutrient, dan mempengaruhi tingginya pH. Magnesium terutama diberikan
pada medium dalam bentuk MgSO47H2O. Magnesium diperlukan sebagai elemen utama
dalam pembentukan klorofil, berperan penting sebagai aktivator ensim terutama dalam
proses fosforilasi dan sintesis protein dengan cara membentuk komplek enzim-substrat.
Selain unsur makro yang berupa larutan A, dalam medium juga ditambahkan larutan
stok C yang merupakan IRON dengan persenyawaan N2EDTA dan F2SO47H2O. Stok D
dalam medium merupakan mikronutrien yang terdiri dari persenyawaan MnSO4H2O,
ZnSO44H2O, H3BO3 (Boric acid), KI, NaMoO42H2O (sodium molybdat) , CuSO45H2O
(Cupric sulfate), dan CaCl26H2O. Unsur hara mikro adalah unsur yang diperlukan dalam
jumlah sedikit. Unsur hara mikro yang dibutuhkan tanaman diantaranya meliputi; Boron
(B),Molybdenum (Mo), Manganase (Mn), Zincum (Zn), Cuprum (Cu), dan Chlorine (Cl).
Boron diberikan pada medium kultur sebagai asam borak (boric acid, H3BO3) berperan
dalam translokasi karbohidrat, juga terlibat dalam diferensiasi seluler dan perkembangan.
Molybdenum diberikan pada medium sebagai sodium molybdat (Na2MoO4. 2H2O)
berpartisipasi pada konfersi nitrogen ke ammonia dan fiksasi nitrogen, ikut dalam
metabolisme protein, sintesis asam askorbat, dan kofaktor enzim. Manganese merupakan
elemen esensial yang terdapat pada membran kloroplas, berperan sebagai aktifator enzim
serta sebagai bahan pembentuk klorofil, metabolisme protein, dan pembentukan vitamin C
Santoso (2003). Zincum berperan sebagai aktifator ensim, penyusun khlorofil, pemacu
pembentukan zat pengatur tumbuh terutama IAA dan pada medium diberikan dalam
bentuk Zincum sulfate (ZnSO4). Cuprum merupakan bagian dari enzim, Cu bereaksi
menjadi komponen phenolase, lactase dan askorbat oksidase. Ikut ambil bagian dalam
proses fotosintesis dan reduksi nitrit. Chlorine sebagai ion berpengaruh terhadap aktifitas
enzim, dan memacu proses fotosintesis (George, E. F., dan P. D. Sherrington. 1984).
Selain unsur garam organik yang meliputi unsur makro dan mikro tersebut juga
ditambahkan zat organik pada medium. Zat-zat organik adalah persenyawaan yang
mengandung karbon, ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-
Inositol, vitamin, asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Dalam praktikum ini
vitamin diberikan dalam bentuk larutan stok E yang meliputi Nicotinic acid dan
pyridoxine-HCl. Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan,
diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor
dari reaksi-reaksi enzimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif. Nicotinic acid
(niacin) yang digunakan dalam praktikum ini penting dalam reaksi-reaksi enzimatis
disamping peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid (George, E. F., dan P. D.
Sherrington. 1984). Zat pengatur tumbuh (ZPT) dalam medium yang dibuat ini diberikan
dalam bentuk stok F. Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium
bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur tumbuh dikelompokan
dalam beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid, dan Ethylene. Myo-
Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan
jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik penting yang
berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan perantara pada perubahan
glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai prazat untuk pektin dan penyusun dinding
sel (Abidin, 1994).
Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam melakukan
asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula sebagai sumber karbon dan enersi. Selain
sebagai sumber enersi bagi sel dan jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga
keseimbangan tekanan osmotik potensial didalam medium. Gula pada umumnya
diberikan pada medium kultur berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti
monosakarida glukosa atau fruktosa (Widyastuti, 2002). Karena medium yang dibuat
merupakan medium padat sehingga dalam praktikum ini ditambahkan agar.
I. Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum pembuatan media adalah; Media
merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam proses teknik kultur secara in
vitro sehingga dalam proses pembuatan media diperlukan cara yang tepat dan steril serta
ukuran tertentu terhadap berbagai komponen yang akan dicampurkan sebagai media
kultur, komposisi yang digunakan dalam pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS)
dalam praktikum ini meliputi larutan stok A, B, C, D, E, F, agar, dan gula dengan kadar
yang telah ditentukan.
J. Daftar Rujukan
Abidin, Z. 1994. Dasar-Dasar Pengetahuan Tentang Zat Pengatur Tumbuh. Angkasa. Bandung.
George, E. F., dan P. D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegetics Limited. England.
George, E. F., Hall, M. A., dan Klerk, G. D. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition. Netherland: Springer.
Gunawan, LW. 1994. Teknik kultur jaringan tumbuhan. PAU. Bioteknologi IPB. Bogor.
Karjadi, A. K. dan Buchory, A. 2007. Pengaruh NAA dan BAP tehadap Pertumbuhan Jaringan Meristem Bawang Putih pada Media B5. Jurnal Hortikultura. 17 (3): 217-223.
Margono, H. 2001. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.
Margono, H. dan Balqis. 2003. Panduan Belajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.
Rahardja, P. C., dan Wahyu, W. 2003. Aneka Cara Memperbanyak Tanaman. Agromedia Pustaka. Jakarta.
Santoso, U., dan Fatimah, N. 2003. Kultur Jaringan Tanaman. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.
Widyastuti, N. 2002. Inovasi Memperbanyak Bibit Tanaman. (online) www.sinarharapan.co.id/berita/0202/13/ipt02.html. Diakses tanggal 14 Februari 2015