Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan fraksinasi dengan metode kromatografi kolom.

Setelah sebelumnya dilakukan fraksinasi dengan metode ECC, maka didapat fraksi yang baik

dengan menggunakan pelarut yang baik pula. Sehingga pelarut tersebut dipilih sebagai eluen untuk

mengelusi sampel pada metede kromatografi kolom.

Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia

tunggal dari campurannya. Ada 2 metode dalam kromatografi kolom yaitu metode kering dan

metode basah. Adapun metode yang kami gunkan adalah metode basah. Pada metode basah, fasa

diam dibasahi dengan fasa gerak hingga menjadi bubur di luar kolom, dan kemudian dituangkan

perlahan-lahan ke dalam kolom. Pencampuran dan penuangan harus ekstra hati-hati untuk

mencegah munculnya gelembung udara. Larutan bahan organik diletakkan di bagian atas fasa diam

menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya ditutup dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol

kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari tuangan eluen. Eluen kemudian dialirkan

perlahan melalui kolom sambil membawa sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen sferis

atau corong pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas kolom.

Mekanisme kerja dari kromatografi kolom adalah pemisahan suatu senyawa dalam kolom

kromatografi dengan silika gel sebagai fasa diam dan campuran pelarut polar-nonpolar sebagai fasa

gerak yang akan mengelusi sampel, eluen bergerak turun dan mengelusi sampel digerakkan oleh

gaya grafitasi bumi.

Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fasa diam

yang paling umum untuk kromatografi kolom adalah silika gel sedangkan Fasa gerak atau eluen

dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga

nilai faktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan

waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan

daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen

dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis

(KLT) dengan fasa gerak yang sama.

Pada metode ini, kolom diisikan dengan adsorben yang berupa padatan dalam hal ini adalah

silika gel yang sebelumnya telah dilarutkan dengan eluen. Eluennya yang digunkan adalah

campuran antara diklorometan dengan metanol pada perbandingan 99:1.yang dicampurkan hingga

membentuk bubur silika (slurry). Slurry dimasukkan dengan hati-hati kedalam kolom kromatografi

yang telah diisikan eluen yang sebelumnya telah disumbat dengan glass woll dan pasir pantai yang

berfungsi sebagai penahan adsorben agar tidak keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus

dikerjakan secara seragam dan sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembung-

gelembung udara. Jika terdapat gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan berpotensi

menyebabkan pecahnya kolom.

Hal lain yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan

menambahkan eluen secara kontinu agar udara tidak masuk kedalam kolom. Kolom yang padat

diindikasikan dengan warna slurry yang semakin memutih dan kecepatan alir eluen yang semakin

lambat. Jika kolom sudah memadat, larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom . Mekanisme

yang terjadi pada kromatografi kolom ialah sampel akan terelusi oleh eluen melalui fase diam

silika gel. Senyawa organik terelusi oleh eluen proses elusi terjadi karena keseimbangan distribusi

zat analit pada fase gerak eluen dan fase diam selika gel. Elusi terus berlangsung hingga tidak ada

lagi yang tinggal dalam kolom. Proses elusi ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung

banyak kurkumin.

. Eluen akan mengelusi sampel kunyit dan membawa senyawa bersamanya menuju wadah

eluat (keluar dari kolom), fasa diam (silika gel) memiliki daya adsorbsi yang cukup besar, sehingga

ketika eluen yang membawa sampel melewati fasa diam akan terbentuk fraksi-fraksi warna yang

berbeda. Fraksi warna yang berbeda ini menunjukkan perbedaan senyawa atau zat aktif yang

dipisahkan dari setiap fraksi. Semakin pekat warna fraksi, maka semakin banyak senyawa atau zat

aktif yang terpisahkan dalam fraksi tersebut. Dalam percobaan ini diperoleh 10 fraksi yang berbeda.

Dari fraksi yang dihasilkan pada kromatografi kolom selanjutnya dilakukan kromatografi

lapis tipis, namun sebelumnya fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom dipekatkan terlebih

dahulu. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan pelarut yang masih terkandung dalam fraksi

tersebut.

Pada dasarnya kurkumin banyak terdapat pada kunyit, sehingga dapat dipastikan dari setiap

fraksi yang diperoleh memiliki kandungan kurkumin. Untuk menguji keberadaan kurkumin maka

dilakukan metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis. Eluen yang digunakan untuk

mengelusi sampel pada KLT ini sama dengan eluen yang digunakan dalam kromatografi kolom,

yaitu campuran 1,2-dikloroetan-metanol dengan perbandingan 99:1.