PENGARUH KOMPOSISI FASA GERAK PADA PENETAPAN

KADAR ASAM BENZOAT DAN KAFEIN DALAM KOPI

KEMASAN MENGGUNAKAN METODE KCKT

(KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI)

Auliya Puspitaningtyas, Surjani Wonorahardjo, Neena Zakia

Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Malang

Email: k.auliya@ymail.com, s_wonorahardjo@yahoo.com, z_khia@yahoo.com

Abstrak: Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh komposisi fasa gerak terhadap penetapan kadar asam benzoat dan kafein, serta mengetahui kadar asam benzoat dan kafein

dalam kopi kemasan. Tahapan penelitian ada dua langkah pokok yaitu (1). Optimasi kondisi

analisis yang meliputi penentuan masing-masing maksimum asam benzoat dan kafein

menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, standart asam benzoat dan kafein dianalisis dalam

berbagai komposisi fasa gerak menggunakan KCKT, dan pemilihan komposisi fasa gerak yang

baik untuk analisis asam benzoat dan kafein menggunakan KCKT; (2) Penetapan kadar asam

benzoat dan kafein dalam sampel, sebelumnya dilakukan beberapa tahapan yaitu pretreatment

sampel untuk memisahkan asam benzoat dan kafein dari masing-masing sampel, pembuatan

kurva kalibrasi larutan standart asam benzoat dan larutan standart kafein menggunakan

komposisi fasa gerak terpilih, dan analisis sampel menggunakan komposisi fasa gerak terpilih.

Fasa gerak terpilih yang digunakan adalah campuran metanol dan buffer asetat dengan

perbandingan 50:50 dan 60:40. Kadar asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A

20,5 ppm dan sampel B 12 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 35 ppm dan sampel

B 41,5 ppm. Kadar kafein pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A 6,5 ppm dan sampel B 11,5

ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 22 ppm dan sampel B 37 ppm.

Kata kunci: fasa gerak, asam benzoat, kafein, kopi kemasan, KCKT

Abstract: This research is done to determine the effect of mobile phase composition on benzoic acid and caffeine and determine benzoic acid and caffeine in instant coffee package. This study

conducted in the laboratory which consists of several steps: (1). Optimization of analysis

condition that comprise determining each maximum of benzoic acid and caffeine using UV-Vis

Spectrophotometer, benzoic acid and caffeine standard analyzed on various mobile phase

composition using HPLC, the best selection of mobile phase composition for benzoic acid and

caffeine using HPLC , (2) Determination benzoic acid and caffeine contains in samples,

previously done several steps, sample pretreatment for separating benzoic acid and caffeine from

sample, making the calibration curve for benzoic acid and caffeine solution standard, and

analysis of sample using selected mobile phase composition. The selected mobile phase is the

mixture of methanol and buffer acetate within comparison 50:50 and 60:40. The content of

benzoic acid at mobile phase composition 50:50 for sample A 20,5 ppm and sample B 12 ppm, at

mobile phase composition 60:40 for sample A 35 ppm and sample B 41,5 ppm. The content of

caffeine at mobile phase composition 50:50 for sample A of 6.5 ppm and sample B 11.5 ppm, at

mobile phase composition of 60:40 for sample A 22 ppm and sample B 37 ppm.

Key word: mobile phase, benzoic acid, caffeine, instant coffee package, HPLC

PENDAHULUAN

Jenis bahan pengawet yang sering digunakan dalam makanan untuk menghambat

pertumbuhan jamur, ragi, dan beberapa bakteri adalah asam benzoat. Bahan pengawet

ini biasanya digunakan dalam bentuk garam benzoat yang lebih mudah larut dalam air

dibanding bentuk asamnya yaitu natrium benzoat (PerMenKes No.772, 1988). Selain

bahan pengawet, beberapa minuman kemasan juga mengandung kafein yang berfungsi

mailto:k.auliya@ymail.commailto:s_wonorahardjo@yahoo.commailto:z_khia@yahoo.com

untuk merangsang sistem saraf pusat sehingga dapat mengusir rasa kantuk dan lelah

secara sementara. Jenis minuman kemasan tersebut antara lain jenis minuman ringan,

minuman berenergi, teh kemasan, dan kopi kemasan.

Pada penelitian sebelumnya McDevitt et al (1998) menganalisis asam benzoat

dan kafein pada minuman ringan menggunakan spektrofotometri ultra violet (UV), dan

El-Ziney (2009) menganalisis kandungan asam benzoat yang terdapat pada beberapa

minuman ringan dan minuman berenergi dengan GC-MS (Gas Chromatography-Mass

Spectrometer). Metode spektrofotometri UV memiliki kelebihan antara lain sampel

dapat langsung dianalisis meskipun tanpa preparasi dan sampel tidak perlu dibuat

berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Sedangkan kelemahannya antara lain,

penentuan kadar sampel berdasarkan banyaknya sinar yang diserap oleh sampel

sehingga hasil yang diperoleh belum tentu sesuai dengan kadar yang sebenarnya. Selain

itu, banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain yang juga menyerap

sinar pada panjang gelombang UV tersebut, sehingga dapat menimbulkan bias pada

hasil analisis (Riyadi, 2009). Pada metode GC-MS, sampel yang akan dianalisis harus

memenuhi persyaratan antara lain sampel mudah menguap, mudah diuapkan, dan tidak

rusak karena panas (Anonymous, 2012).

Perlu adanya metode lain yang mampu menutupi kelemahan yang dimiliki oleh

metode spektrofotometri UV dan GC-MS. Salah satu metode yang dapat digunakan

yaitu metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang selanjutnya disingkat dengan

KCKT. Metode KCKT termasuk suatu teknik kromatografi kolom dengan fase gerak

berupa cairan dan fase diam berupa padatan yang terdapat pada kolom. Kelebihan yang

dimiliki oleh KCKT antara lain mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu

campuran dengan baik, memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat

menggunakan berbagai detektor, kolom dapat digunakan kembali, memisahkan zat yang

labil dan tidak mudah menguap, dilakukan pada suhu kamar, serta ideal untuk

pemisahan ion dan molekul besar (Johnson dan Stevenson, 1991).

Metode analisis KCKT dapat digunakan untuk analisis secara kualitatif maupun

kuantitatif senyawa-senyawa yang terdapat dalam sampel. Penelitian yang

menggunakan metode KCKT dilakukan oleh Ree, M dan Stoa, E (2011) untuk

menetapkan kandungan aspartam, asam benzoat, kafein, dan sakarin dalam minuman

ringan bebas gula. Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol dengan buffer

fosfat pH 3 (20:80), kolom XB-C18 (50 L x 4,6 mm), dengan panjang gelombang 220

nm dan 270 nm.

Penelitian lain juga dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007)

menggunakan metode KCKT untuk menganalisis asam benzoat dan asam sorbat pada

minuman ringan menggunakan fase gerak metanol dengan buffer ammonium asetat

(60:40), dan penelitian yang dilakukan oleh Saad, B dkk (2004) juga menggunakan

metode KCKT untuk menganalisis bahan pengawet pada makanan dengan fase gerak

metanol dengan buffer ammonium asetat (50:50).

Fase gerak yang digunakan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007)

dan Saad, B dkk (2004) berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Ree, M dan

Stoa, E (2011). Perbedaan dari ketiga penellitian tersebut terletak pada jenis buffer yang

digunakan yaitu buffer ammonium asetat dan buffer fosfat, sedangkan pelarut yang lain

sama-sama menggunakan metanol. Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) dan

Saad, B dkk (2004) menggunakan jenis fase gerak yang sama dengan perbandingan

komposisi yang berbeda. Hasil dari ketiga penelitian yang diperoleh tidak dapat

dibandingkan karena sampel yang digunakan berbeda. Dalam KCKT, fase gerak selain

berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fase

gerak merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses analisis (Hendayana,

2010).

Terhadap kopi kemasan yang digunakan sebagai sampel dilakukan ekstraksi

pelarut sebelum dianalisis menggunakan KCKT. Ekstraksi pelarut merupakan metode

pemisahan yang sering digunakan dalam laboratorium untuk mengisolasi satu atau lebih

komponen dari suatu campuran (Khopkar, 1990). Prinsip metode ekstraksi pelarut

didasarkan pada distribusi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur.

Ekstraksi terhadap kopi kemasan dilakukan untuk menghilangkan unsur lain yang

mungkin akan mengganggu proses analisis. Oleh karena itu dilakukan penelitian tentang

pengaruh komposisi fase gerak pada penentuan kadar asam benzoat dan kafein yang

terdapat pada kopi kemasan dengan metode KCKT menggunakan fase gerak campuran

metanol dan buffer ammonium asetat.

METODE

Rancangan Penelitian

Tahap penelitian meliputi dua langkah pokok yaitu: (1) Optimasi kondisi analisis

yang meliputi beberapa tahap yaitu (a) Penentuan masing-masing maksimum asam

benzoat dan kafein menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, (b) Standart asam benzoat

dan kafein dianalisis dalam berbagai komposisi fase gerak menggunakan KCKT, (c)

Pemilihan komposisi fase gerak yang baik untuk analisis asam benzoat dan kafein

menggunakan KCKT; (2) Penetapan kadar asam benzoat dan kafein dalam sampel,

sebelumnya dilakukan beberapa tahapan yaitu (a) Pretreatment sampel untuk

memisahkan asam benzoat dan kafein dari masing-masing sampel, (b) Pembuatan kurva

kalibrasi larutan standart asam benzoat dan larutan standart kafein menggunakan

komposisi fase gerak terpilih (b) Analisis sampel menggunakan komposisi fase gerak

terpilih.

Prosedur Kerja

1. Ektraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi

Ekstraksi asam benzoat dilakukan dengan mengambil sebanyak 150 mg kopi

bubuk kemasan dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL dan ditambah dengan larutan

NaCl jenuh secukupnya, larutan tersebut dibuat basa dengan menambahkan larutan

NaOH 10%, selanjutnya ditambah larutan NaCl jenuh sampai tanda batas dan diaduk

konstan selama 2 jam kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat yang bebas bubuk

kopi. Filtrat hasil saringan diambil sebanyak 25 mL dan dimasukkan dalam corong

pisah 100 mL untuk diekstraksi menggunakan kloroform, sebelumnya ditambah dengan

HCl sebanyak 1,25 mL. Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan 18,5 mL; 12,5

mL; 10 mL; 7,5 mL kloroform. Fase organik dari hasil ekstraksi dimasukkan dalam

gelas kimia 250 mL yang telah berisi air sebanyak 50 mL, selanjutnya didestilasi untuk

menghilangkan fase organiknya (kloroform) sehingga diperoleh asam benzoat yang

terlarut dalam air.

Sedangkan untuk ekstraksi kafein, sebanyak 25 g kopi bubuk kemasan

dimasukkan dalam timbel, kemudian dimasukkan dalam rangkaian alat sohlet yang

telah berisi 300 mL metanol, selanjutnya diekstraksi selama 3 jam. Ekstrak kopi dalam

metanol disaring dengan pompa vakum menggunakan kertas saring Whatman 41.

Ekstrak kopi yang telah disaring diambil sebanyak 100 mL untuk dimasukkan dalam

gelas kimia 250 mL yang telah berisi 12,5 g MgO. Campuran tersebut selanjutnya

ditambah dengan 75 mL air dan diaduk konstan disertai pemanasan selama 10 menit.

Setelah itu, campuran disaring, residu sisa penyaringan dicuci dengan 125 mL dan 63

mL air panas secara bergantian. Filtrat dari kedua penyaringan dicampurkan dan

disaring kembali menggunakan pompa vakum. Selanjutnya, keseluruhan filtrat yang

dihasilkan ditambah dengan H2SO4 10% sebanyak 12,5 mL. Campuran tersebut

dipanaskan dan diuapkan sampai tersisa 1/3 volume awal, setelah itu disaring dalam

keadaan panas dan didinginkan. Setelah dingin, filtrat dimasukkan dalam corong pisah

250 mL dan diekstraksi dengan 7,5 mL kloroform. Lapisan organik hasil ekstraksi

dimasukkan dalam gelas kimia 500 mL dan ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai

warnanya hilang, kemudian ditambah air dengan volume sama dengan volume larutan

NaOH 1% yang ditambahkan dan didestilasi untuk menghilangkan pelarut organiknya.

2. Pembuatan Larutan

a. Pembuatan Larutan Penyangga Amonium Asetat pH 4

Sebanyak 7,7 gram amonium asetat dimasukkan dalam labu ukur 1000 mL,

kemudian ditambah aquabides sampai kira-kira volume 900 mL dan ditambah dengan

asam asetat glasial sampai pH 4 yang diukur menggunakan kertas indikator universal.

Selanjutnya, campuran tersebut ditambahkan aquabides sampai batas.

b. Pembuatan Larutan Induk Asam Benzoat dan Kafein

Pembuatan larutan induk asam benzoat dan kafein masing-masing 100 ppm.

Larutan induk asam benzoat dibuat dengan menimbang sebanyak 10 mg asam benzoat.

Asam benzoat tersebut dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambah

aquabides sampai batas dan dikocok sehingga dihasilkan larutan induk asam benzoat

100 ppm. Larutan induk kafein dibuat dengan menimbang sebanyak 10 mg kafein.

Kafein tersebut dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambah aquabides

sampai tanda batas dan dikocok.

c. Pembuatan Larutan Standart Asam Benzoat dan Kafein

Larutan induk asam benzoat dan kafein 100 ppm digunakan untuk membuat

larutan standar. Larutan induk asam benzoat diencerkan dengan aquabides menjadi 5

ppm, 10 ppm, dan 20 ppm dengan cara mengambil 2,5 mL; 5 mL; dan 10 mL, kemudian

dimasukkan dalam 3 labu ukur 50 mL yang berbeda secara berturut-turut. Larutan induk

kafein diencerkan dengan aquabides menjadi 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm dan 50 ppm

dengan cara mengambil 2,5 mL; 5 mL; 10 mL; dan 25 mL, dimasukkan dalam 4 labu

ukur 50 mL yang berbeda secara berturut-turut.

d. Pembuatan Larutan Sampel

Sebanyak 5 mL ekstrak asam benzoat dan kafein masing-masing diencerkan

dalam labu ukur 50 mL dengan aquabides sampai tanda batas. Larutan yang akan

dianalisis disaring terlebih dahulu menggunakan Cellulose Nitrate Membrane Filtrat

0,45 m.

3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (maks)

Penentuan maks dilakukan dengan menganalisis larutan standart asam benzoat

dan kafein menggunakan spektrofotometer UV-Vis. maks (panjang gelombang

maksimal) yang diperoleh digunakan untuk analisis larutan standart dan sampel pada

instrument KCKT Shimadzu.

4. Optimasi Kondisi Analisis dengan KCKT

Larutan standart asam benzoat dan kafein masing-masing 20 ppm dalam pelarut

aquabides disuntikkan sebanyak 100 L ke dalam kolom secara bergantian

menggunakan fase gerak campuran matanol dan buffer asetat pH 4,4 dengan berbagai

komposisi yaitu 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 80:20; 90:10. Panjang

gelombang yang digunakan untuk mendapat kondisi optimum adalah panjang

gelombang maksimum asam benzoat dan kafein yang diperoleh pada tahap sebelumnya.

Komposisi yang memberikan hasil pemisahan terbaik berdasarkan waktu retensi dan

bentuk puncak digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi dan analisis penetapan kadar

asam benzoat dan kafein pada masing-masing sampel.

5. Penetapan kadar asam benzoat dan kafein

Kondisi analisis terpilih digunakan untuk menganalisis 100 L sampel

disuntikkan ke dalam kolom dan diamati waktu retensi puncak-puncak yang dihasilkan

oleh sampel. Apabila puncak-puncak tersebut mempunyai waktu retensi yang kurang

lebih sama dengan waktu retensi puncak bahan baku pembanding asam benzoat dan

kafein, maka dapat disimpulkan bahwa pada sampel terdapat zat-zat tersebut.

Analisis Data

Kadar asam benzoat dan kafein ditentukan melalui persamaan garis yang

diperoleh dari kurva kalibrasi. Nilai luas area setiap sampel yang dianalisis

menggunakan KCKT disubstitusikan ke dalam persamaan garis, sehingga diperoleh

kadar asam benzoat dan kafein.

HASIL

1. Ekstraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi

a. Ekstraksi Asam Benzoat

Fase organik hasil ekstraksi bertahap dikumpulkan dalam gelas kimia 250 mL

yang telah berisi air sebanyak 50 mL. Campuran air dan fase organik tersebut

selanjutnya didestilasi pada suhu 60C untuk menghilangkan kloroform, setelah

kloroform dalam campuran tersebut menguap seluruhnya destilasi dihentikan. Larutan

sisa destilasi didinginkan, setelah dingin dilakukan analisis menggunakan KCKT.

b. Ekstraksi Kafein

Fase organik hasil ekstraksi dimasukkan dalam gelas kimia 500 mL dan

ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai warnanya memudar sekitar 50 mL,

kemudian ditambah air dengan volume yang sama dengan volume NaOH 1% yang

ditambahkan yaitu 50 mL, kemudian didestilasi untuk menghilangkan fase organik. Sisa

hasil destilasi tersebut didinginkan dan dianalisis menggunakan KCKT.

2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Hasil dari pengukuran menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa

asam benzoat terdeteksi pada panjang gelombang 222 nm dan kafein terdeteksi pada

panjang gelombang 272 nm. Panjang gelombang yang diperoleh selanjutnya digunakan

untuk analisis larutan standart dan sampel pada instrument KCKT Shimadzu.

3. Komposisi Fase Gerak pada Instrumen KCKT (Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi) Shimadzu

Data waktu retensi dan luas area komposisi fase gerak terpilih yang diperoleh

dari standart asam benzoat dan kafein disajikan pada Tabel 1 dan 2.

Tabel 1. Data Waktu Retensi dan Luas Area Komposisi Fase Gerak Terpilih Standart Asam

Benzoat 200 ppm pada 222 nm

Variasi fase gerak Asam Benzoat

Waktu retensi (menit) Luas Area

50 : 50 5,452 17002267

60 : 40 4,130 17105220

Tabel 2. Data Waktu Retensi dan Luas Area Komposisi Fase Gerak Terpilih Standart Kafein 200

ppm pada 272 nm

Variasi fase gerak Kafein

Waktu retensi (menit) Luas Area

50 : 50 3,955 13115831

60 : 40 3,457 13191438

4. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Data hasil pengukuran larutan standart asam benzoat dan kafein untuk membuat

kurva kalibrasi disajikan pada Tabel 3 dan 4. Tabel 3. Data Hasil Pengukuran Larutan Standart Asam Benzoat untuk Membuat Kurva Kalibrasi

Konsentrasi

(x) ppm

Luas Area Standart Asam Benzoat

50 : 50 60 : 40

5 465512 384563

10 848356 816085

20 1509538 167319

Tabel 4. Data Hasil Pengukuran Larutan Standart Kafein untuk Membuat Kurva Kalibrasi

Konsentrasi

(x) ppm

Luas Area Standart Kafein

50 : 50 60 : 40

5 393458 324281

10 703796 702109

20 1322745 1317473

Data yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi asam

benzoat dan kurva kalibrasi kafein, sehingga diperoleh persamaan garis regresi pada

masing-masing kondisi, persamaan regresi garis tersebut disajikan pada Tabel 5.

Tabel 5. Persamaan Garis Regresi untuk Asam Benzoat dan Kafein Berdasarkan Kurva Kalibrasi

Perbandingan

Fase gerak

Asam Benzoat (222 nm) Kafein (272 nm)

Persamaan Regresi r Persamaan Regresi r

50:50 y = 69104x + 13492 0,998 y = 61944x + 83984 1

60:40 y = 85961x - 44554 1 y = 65545x + 16599 0,997

5. Hasil Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan

Sampel yang digunakan adalah dua macam kopi bubuk kemasan yang telah

mendapat perlakuan sehingga diperoleh ekstrak asam benzoat A dan B, serta ekstrak

kafein A dan B. Hasil analisis dengan KCKT adalah waktu retensi dan luas area. Data

luas area disubstitusikan ke persamaan garis regresi, selanjutnya dikalikan dengan

faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi asam benzoat dan kafein dalam

masing-masing sampel yang disajikan pada Tabel 6, 7, 8 dan 9.

Tabel 6. Data Konsentrasi Ekstrak Asam Benzoat dalam Sampel Kopi Kemasan A

Variasi fase gerak Konsentrasi (ppm)

Persamaan Regresi Faktor Pengenceran

50:50 222

0,41 20,5

60:40 0, 7 35

Tabel 7. Data Konsentrasi Ekstrak Asam Benzoat dalam Sampel Kopi Kemasan B

Variasi fase gerak Kadar Asam Benzoat (ppm)

Persamaan Regresi Faktor Pengenceran

50 : 50 222 0,24 12

60 : 40 0,83 41,5

Tabel 4.12 Data Konsentrasi Ekstrak Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan A

Variasi fase gerak Konsentrasi (ppm)

Persamaan Regresi Faktor Pengenceran

50;50 272

0,13 6,5

60:40 0,44 22

Tabel 4.13 Data Konsentrasi Ekstrak Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan B

Variasi fase gerak Kadar Kafein (ppm)

Persamaan Regresi Faktor Pengenceran

50;50 272

0,23 11,5

60:40 0,74 37

PEMBAHASAN

1. Ekstraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi

a. Ekstraksi Asam Benzoat

Bubuk kopi yang akan diekstraksi dilarutkan terlebih dahulu dalam larutan NaCl

jenuh yang disertai dengan pengadukan secara konstan selama 2 jam dengan tujuan

menjenuhkan larutan sampel agar asam benzoat yang terkandung dalam sampel terikat

dalam larutan sebagai natrium benzoat. Larutan selanjutnya ditambah larutan HCl agar

sifat larutan yang semula basa menjadi netral dan mengubah natrium benzoat yang

terlarut dalam larutan kembali ke bentuk semula yaitu asam benzoat. Tahap ekstraksi

dilakukan secara bertahap menggunakan kloroform dengan tujuan hasil ekstraksi lebih

maksimal. Fase organik yang dihasilkan dari ekstraksi ditambahkan air untuk mencuci

fase organik tersebut, selanjutnya dilakukan destilasi pada suhu 30oC untuk

menghilangkan fase organik (kloroform) dari campuran sehingga hanya tersisa fase air.

Suhu destilasi merupakan setengah dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan

agar penguapan terjadi secara perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan

baik. Fase air inilah yang dianalisis menggunakan KCKT.

b. Ekstraksi Kafein

Ekstraksi kafein dilakukan dengan metode soxhlet dengan pelarut yang berfungsi

untuk melarutkan kafein yang terkandung dalam sampel. Kafein bersifat polar sehingga

digunakan pelarut polar juga yaitu metanol agar kafein yang terdapat dalam sampel

terlarut dalam pelarut tersebut. Ekstrak kopi hasil soxhlet ditambah dengan MgO dan air

kemudian diaduk konstan selama 10 menit agar pencampuran merata sehingga zat

selain kafein yang terkandung dalam ekstrak kopi tersebut berikatan dengan MgO,

sehingga diperoleh larutan berwarna coklat orange. Saat pencampuran selesai,

campuran disaring untuk memisahkan antara residu dan dan filtrat.

Residu hasil penyaringan dibilas menggunakan air sebelum dibuang, tujuannya

agar filtrat yang masih terdapat dalam residu tersebut ikut terbawa air dan bercampur

dengan filtrat hasil penyaringan yang awal. Filtrat yang terkumpul ditambah dengan

H2SO4 10% untuk membuat larutan menjadi bersifat asam karena larutan tersebut

bersifat basa akibat adanya Mg(OH)2 yang terbentuk dari pelarutan MgO dalam air pada

tahap sebelumnya, kemudian diuapkan sampai tersisa 1/3 dari volume awal untuk

menghilangkan kandungan air dan asam berlebih. Sisa larutan yang diuapkan kemudian

diekstraksi menggunakan kloroform sehingga akan diperoleh fase organik yang akan

mendapat perlakuan selanjutnya. Fase organik hasil ekstraksi ditambah dengan larutan

NaOH 1% sampai warnanya memudar dan ditambah air sebanyak volume NaOH 1%

yang ditambahkan, setelah itu larutan didestilasi pada suhu 30oC untuk

menghilangkan fase organik (kloroform) dari campuran sehingga hanya tersisa fase air.

Suhu destilasi merupakan setengah dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan

agar penguapan terjadi secara perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan

baik. Fase air inilah yang dianalisis menggunakan KCKT.

2. Komposisi Fase Gerak pada Penetapan Kadar Asam Benzoat dan Kafein

Menggunakan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

Berdasarkan hasil analisis larutan standar asam benzoat dan kafein menggunakan

beberapa perbandingan komposisi fase gerak diperoleh komposisi fase gerak yang baik

untuk analisis sampel kopi kemasan menggunakan KCKT. Komposisi fase gerak baik

yang dimaksud didasarkan pada waktu retensi, puncak yang terbentuk, dan luas area

yang dihasilkan untuk asam benzoat dan kafein sebagaimana telah dijelaskan

sebelumnya.

Komposisi fase gerak yang terpilih dari beberapa komposisi fase gerak yang

digunakan untuk analisis yaitu 50:50 dan 60:40 pada panjang gelombang 222 nm untuk

asam benzoat dan pada panjang gelombang 272 nm untuk kafein dengan waktu retensi

masing-masing sebagaimana terdapat pada Gambar 5.3 dan 5.4. Komposisi fase gerak

60:40 lebih polar dibandingkan dengan komposisi fase gerak 50:50, kepolaran tersebut

berpengaruh terhadap waktu retensi yang dihasilkan untuk asam benzoat dan kafein.

Waktu retensi saat analisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 lebih cepat

daripada menggunakan fase gerak 50:50. Kepolaran fase gerak berpengaruh juga

terhadap hasil pemisahan, senyawa polar yang dipisahkan akan lebih banyak terbawa

oleh komposisi fase gerak yang lebih polar.

Waktu retensi asam benzoat lebih lama daripada waktu retensi kafein

dikarenakan kafein lebih polar dibandingkan dengan asam benzoat sehingga asam

benzoat tertahan lebih lama di fase diam. Komposisi tersebut menghasilkan

kromatogram yang lebih baik untuk asam benzoat dan kafein dibandingkan dengan

komposisi fase gerak yang lain yang menghasilkan kromatogram baik untuk salah satu

senyawa saja. Komposisi fase gerak terpilih sesuai dengan penelitian yang telah

dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) yang menggunakan

komposisi fase gerak 60:40, serta penelitian Saad, B dkk (2004) yang menggunakan

komposisi fase gerak 50:50. Kromatogram asam benzoat dan kafein pada komposisi

fase gerak 50:50 disajikan pada Gambar 1.

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 min-250

0

250

500

mVDetector A Ch2:222nm

/5.4

52

Gambar 1. Kromatogram Menggunakan Komposisi Fase Gerak 50:50 (a) Asam benzoat, (b) Kafein

Kromatogram asam benzoat dan kafein pada komposisi fase gerak 60:40 disajikan pada

Gambar 2.

Gambar 2. Kromatogram Menggunakan Komposisi Fase Gerak 60:40 (a) Asam benzoat, (b) Kafein

3. Analisis Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Kopi Kemasan dengan KCKT

Berdasarkan kromatogram asam benzoat yang dianalisis menggunakan

komposisi fase gerak 50:50 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 42.047 dan

sampel B adalah 30.732, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing

sampel dengan persamaan regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 yaitu

y = 69104x + 13492, maka diperoleh masing- masing konsentrasi untuk sampel A 0,41

ppm dan sampel B 0,24 ppm. Kromatogram asam benzoat yang dianalisis menggunakan

komposisi fase gerak 60:40 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 15.684 dan

sampel B adalah 26.915, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing

sampel dengan persamaan regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 60:40 yaitu

y = 85961x - 44554, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,7

ppm dan sampel B 0,83 ppm.

Berdasarkan kromatogram kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase

gerak 50:50 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 92.181 dan sampel B

adalah 45.466, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel

dengan persamaan garis regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 yaitu y =

61944x + 83984, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,13 ppm

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min

-250

0

250

500

mVDetector A Ch2:222nm

/4.1

30

dan sampel B 0,44 ppm. Kromatogram kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 98.680 dan sampel B

adalah 65.107, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel

dengan persamaan regresi kafein pada komposisi fase gerak 60:40 yaitu y = 65545x +

16599, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,16 ppm dan

sampel B 0,74 ppm.

Konsentrasi masing-masing sampel yang telah diperoleh melalui persamaan garis

selanjutnya dihitung berdasarkan banyaknya pengenceran yang dilakukan sebelum

sampel tersebut dianalisis menggunakan KCKT, hal tersebut bertujuan untuk

mengetahui konsentrasi asam benzoat dan kafein sebenarnya yang terkandung dalam 5

mL sampel yang telah diencerkan sebanyak 50 kali. Konsentrasi asam benzoat pada

analisis menggunakan komposisi fase gerak 50:50 adalah 20,5 ppm untuk sampel A dan

12 ppm untuk sampel B, sedangkan konsentrasi asam benzoat yang dianalisis

menggunakan komposisi fase gerak 60:40 adalah 35 ppm untuk sampel A dan 41,5 ppm

untuk sampel B. Konsentrasi kafein pada analisis menggunakan komposisi fase gerak

50:50 adalah 6,5 ppm untuk sampel A dan 22 ppm untuk sampel B, sedangkan

konsentrasi kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 adalah 22

ppm untuk sampel A dan 37 ppm untuk sampel B.

PENUTUP

Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan serta analisis data, maka diperoleh

kesimpulan sebagai berikut: (1) Fase gerak yang digunakan adalah campuran methanol

dan buffer asetat dengan perbandingan 50:50 dan 60:40. Komposisi fase gerak yang

memiliki tingkat kepolaran lebih tinggi mampu memisahkan asam benzoat dan kafein

lebih cepat, serta menghasilkan kadar asam benzoat dan kafein lebih banyak yaitu

komposisi fase gerak 60:40 (2) Kadar asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50

sampel A 20,5 ppm dan sampel B 12 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A

35 ppm dan sampel B 41,5 ppm. Kadar kafein pada komposisi fase gerak 50:50 sampel

A 6,5 ppm dan sampel B 11,5 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 22 ppm

dan sampel B 37 ppm.

Saran

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan serta kesimpulan, maka didapatkan

saran-saran berikut sebagai bahan pertimbangan untuk penelitian selanjutnya: (1)

Penggunaan metode selain ekstraksi pelarut untuk pretreatment dapat digunakan dalam

penelitian selanjutnya (2) Fase gerak selain methanol dan buffer asetat pH 4 dapat

digunakan pada penelitian selanjutnya untuk analisis menggunakan KCKT, serta

sebagai perbandingan hasil yang diperoleh pada penelitian sebelumnya.

DAFTAR RUJUKAN

El-ziney, M. G. 2009. Analysis of Benzoat and Sorbate in Saudi Dairy and Food

Product with Estimation of Daily Exposure. Journal of Food Technology, 7 (4):

127-134.

Johnson, E., and Stenvenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terjemahan dari

Basic Liquid Chromatography, oleh Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB

Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Terjemahan Saptorahardjo. Jakarta:

Universitas Indonesia Press. McDevitt, V. L. 1998. Analysis of Soft Drinks: UV Spectrophotometry,

Liquid Chromatography, and Capillary Electrophoresis. Journal of Chemical

Education, 75 (5): 625-629. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 772 Tahun 1988 tentang Bahan Pengawet

Makanan. 1988. Jakarta: Menteri Kesehatan.

Ree, M & Stoa, E. 2011. Simultaneous Determination of Aspartame, Benzoaic Acid,

Caffeine, and Saccharine in Sugar-Free Beverages using HPLC. Concordia

College Journal of Analytical Chemistry, (1): 73-77. Riyadi, W. 2009. Perbedaan Spektrometri dan Spektrofotometri, (Online),

(http://wahyuriyadi.blogspot.com/2008/10/perbedaan-spektrometri-dan.html),

diakses 30 Desember 2012. Saad, B., Bari, Md. F., Saleh, M. I., Ahmad, K., & Talib, M. K. M. 2004. Simultaneous

Determination of Preservatives (Benzoic Acid, Sorbic Acid, Methylparaben and

Propylparaben) in Foodstuffs Using High-Performance Liquid Chromatography.

Journal of Chromatography. 1073: 393-397. Techakriengkrai, I., & Surakarnkul, R. 2007. Analysis of Benzoic Acid and Sorbic Acid

in Thai Rice Wines and Distillates by Solid-Extraction and High Performance

Liquid Chromatography. Journal of Food Composition and Analysis. 20: 220-

225.

http://wahyuriyadi.blogspot.com/2008/10/perbedaan-spektrometri-dan.html