Peningkatan Somaklonal Melalui Kultur Kalus Pada Jagung_2
-
Upload
jakop-hutapea -
Category
Documents
-
view
351 -
download
5
Transcript of Peningkatan Somaklonal Melalui Kultur Kalus Pada Jagung_2
Peningkatan Somaklonal Melalui Kultur
Kalus Pada Jagung
O
L
E
H
NAMA : JAKOP E T HUTAPEA
NIM : 409141044
KELAS : PENDIDIKAN BIOLOGI B’09
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
2011
Peningkatan Somaklonal Melalui Kultur Kalus Pada Jagung
1. Pengertian Kalus
Kalus adalah sekumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau belum
terdiferensiasi) yang terbentuk dari sel-sel yang membelah terus menerus secara in
vitro atau di dalam tabung. Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman seperti akar,
batang dan daun. Secara histologi, kalus berasal dari pembelahan berkali-kali sel-sel
parenkim di sekitar berkas pengangkut dan beberapa elemen penyusun berkas
pengangkut kecuali xilem. Dalam teknik kultur jaringan (in vitro), kalus dapat
diinduksi dengan menambahkan zat pengatur tumbuh yang sesuai pada media kultur,
misalnya auksin dan sitokinin yang disesuaikan. Jika konsentrasi auksin lebih besar
daripada sitokinin maka kalus akan terbentuk, sedangkan jika konsentrasi sitokinin
yang lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi auksin maka yang terbentuk
bukanlah kalus, melainkan tunas. Selain zat pengatur tumbuh atau hormon
pertumbuhan, penambahan vitamin dan protein juga diperlukan untuk pertumbuhan
kalus. Induksi kalus dalam teknik kultur jaringan tanaman diperlukan untuk
memunculkan keragaman sel somatik di dalam kultur in vitro dan meregenerasikan
sel tersebut menjadi embrio somatic
Tanaman regenerasi dari kalus embrio yang diturunkan dari jagung pertama
kali dikembangkan oleh oleh Green dan Phillips (1975). Sejak itu, telah menjadi jelas
bahwa genotipe digunakan adalah penting bagi respon kultur jaringan. Somatik
embriogenesis dalam tipe kompak saya kalus yang berasal dari beberapa galur dan
hibrida disesuaikan dengan daerah beriklim sedang telah dilaporkan. Beberapa
jagung genotipe asal tropis dan subtropis juga telah terbukti menghasilkan kalus
embriogenik . Namun, hanya sedikit genotipe menimbulkan kalus tipe meremah II
mampu somatik embriogenesis. Inti serta efek genetik sitoplasmik pada jaringan
tanggapan budaya dan regenerasi tanaman telah dilaporkan Sejumlah penelitian telah
dilakukan pada genetik dan variasi sitogenetika pada tanaman regenerasi dari jagung
kultur jaringan. Walaupun variasi tersebut, disebut variasi, dapat berguna untuk
perbaikan tanaman, hal ini tidak diinginkan bila genetik stabilitas diperlukan.
Kerusakan kromosom yang terkait dengan daerah heterochromatin sering diamati
pada tanaman kultur jaringan. Meiosis penelitian jagung ulang telah menunjukkan
bahwa kebanyakan breakpoints pada lengan kromosom yang mengandung kenop
heterochromatic, dan telah diusulkan yang biasanya terlambat replikasi daerah
mungkin meniru bahkan kemudian di lingkungan budaya terkemuka pembentukan
jembatan anafase karena tertunda pemisahan kromatid kakak di lokasi tombol. Baru-
baru ini, beberapa peneliti menyelidiki terjadinya ketidakstabilan mitosis dalam
budaya kalus embriogenik berasal dari jagung inbrida memiliki komposisi tombol
yang sama. Jembatan akibat keterlambatan pemisahan kromatid kakak
diselenggarakan bersama-sama di lokasi tombol yang diamati, sehingga mendukung
hipotesis yang diusulkan oleh Lee dan Phillips (1987). Selanjutnya, kehadiran
jembatan khas dengan dan tanpa tombol terdeteksi oleh C-bandeng, dan sel metafase
menunjukkan kotor penyimpangan yang melibatkan lengan kromosom memiliki
tombol besar, menyarankan terjadinya kerusakan-fusion- jembatan (BFB) siklus
diprakarsai oleh lengan kromosom rusak selama acara utama.
Sejauh ini hampir semua kultur jaringan dan transformasi jagung melibatkan
penggunaan embrio zigotik belum menghasilkan sebagai sumber eksplan untuk
regenerasi. Namun, belum menghasilkan embrio yang musiman tersedia dan telah
sangat terbatas sesuai durasi budaya. Hal ini menyebabkan kegiatan kultur jaringan
membosankan rutin dalam kerangka waktu yang ditentukan dan berkesinambungan
tanam untuk kelangsungan penyediaan embrio belum menghasilkan. Sebaliknya,
embrio matang sudah tersedia sepanjang tahun dalam jumlah besar. Selanjutnya,
walaupun beberapa laporan tentang perlawanan dari tropis jagung baris dan embrio
matang untuk bekerja kultur jaringan Embrio matang jagung dapat digunakan untuk
menginduksi kalus tetapi tidak ada planlet yang diregenerasi. Berhasil kembali
tanaman dari matang
embrio dari dua inbreeds jagung, B73 dan Mo17, tetapi regenerasi adalah tergantung
genotipe dan frekuensi hanya 4 sampai 5%. Huang dan Wei (2004) melaporkan
regenerasi garis jagung beriklim dari embrio matang pada frekuensi berkisar 19,85-
32,4%. Sebagian besar baru-baru ini Al-Abed et al. (2006) melaporkan lebih efisien
regenerasi sistem untuk dua hibrida dan dua bawaan baris jagung sedang dengan split
biji matang sebagai eksplan. Di sini, kami melaporkan regenerasi dari satu tropis
jagung galur inbrida dan satu varietas bersari bebas dari embrio matang untuk
pertama kalinya menggunakan benih split teknik.
2. Pembuatan Kultur Kalus
a) Bahan yang diperlukan
Bahan yang digunakan dalam pembuatan kultur kalus adalah jagung, kemudian
media yang merupakan tempat pembuatan kultur kalus adalah garam LS, vitamin B5,
900 mg l-1 prolin, 250 mg l-1 kasein hidrolisat dan 10 mg l-1 filter steril AgNO3 30
g l-1
sukrosa dan 8 g l-1 dari agar. Media B: garam MS dan vitamin, 900 mg l-1 prolin,
250 mg l-1 hidrolisat kasein dan 10 mg l-1 filter steril AgNO3 30 g l-1 sukrosa dan 8
g l-1 dari agar.
b) Teknik Pembuatan Kultur Kalus Pada Jagung
Langkah-langkah yang dilakukan dalam pembuatan kultur kalus adalah
1. Sterilisasi Benih
Membran di sekitar gagang bunga dari biji kering telah dihapus dengan tindakan
pencegahan maksimum tidak mudah rusak atau mengekspos embrio ke pemutihan
agen. Biji kemudian dicuci dengan cair local deterjen dan dibilas tiga sampai empat
kali dengan air mengalir. Thedicuci benih direndam dalam larutan etanol 70%
selama 3 menit dan dibilas dengan air suling tiga sampai empat kali. Biji kemudian
direndam dalam 85% pemutih Jik komersial (Reclkit dan Colman, Kenya) atau 3%
larutan sodium hipoklorit selama 15 menit dua kali, setiap kali menggunakan larutan
segar diikuti oleh biji mencuci tiga sampai empat kali dalam air suling steril (dH2O)
untuk benar-benar menghapus sisa-sisa Jika. Kemudian biji menjadi sasaran salah
satu dari berikut perendaman skema; A) perendaman dalam dH2O steril semalam, B)
berendam di 28% komersial pemutih semalam, C) berendam di 28% pemutih
komersial untuk 6 jam diikuti dengan perendaman dalam dH2O steril selama 18 jam,
D) perendaman dalam 28% pemutih komersial untuk 2 - 3 jam diikuti dengan
merendam di steril dH2O untuk 21 - 22 jam dan E) perendaman dalam semalam
diikuti dH2O steril sterilisasi selama 20 menit dalam pemutih komersial 28%. Biji
dengan gagang bunga dikelilingi oleh membran juga disterilkan dan direndam dalam
steril dH2O semalam. Media, air dan budaya botol yang digunakan dalam percobaan
uap disterilkan pada 121 º C pada tekanan 15pound per square inch (psi) selama 21
menit. pH media disesuaikan dengan 5.8 menggunakan HCl / NaOH sebelum
sterilisasi.
2. Perendaman dan perkecambahan
Biji direndam dalam media perendaman terdiri media LS cair dilengkapi dengan 3
mg l-1 dari 2,4-D selama 48 jam Semi padat MS media dilengkapi dengan 2 mg l-1
dari 2,4-D digunakan untuk perkecambahan biji
3. Induksi kalus
Setelah 3 - 5 hari kecambah dibagi longitudinal untuk mengekspos meristem,
scutellum dan coleorhiza secara bersamaan, dan ditanam pada media induksi kalus
dengan sisi menghadap split media. Media induksi kalus media A dilengkapi dengan
0 - 6 mg l-1 dari 2,4-D atau 3 mg l-1 dari 2,4-D dikombinasikan dengan KT dalam
kisaran 0 - 2 mg l-1. Sepuluh biji split dikultur per piring dan diinkubasikan dalam
gelap pada 26 ± 2 º C. Dua hari kemudian, tumbuh radikula dan bulu kecil
dipindahkan untuk mendorong inisiasi kalus dan kembali kembali ke kamar
pertumbuhan selama 2 - 3 minggu inkubasi. Sangat berkembang biak Kalus
diinduksi menggunakan 2,4-D saja sudah dipindahkan ke Media Sebuah dilengkapi
dengan 2 mg l-1 dari 2,4-D sendirian sementara kalus diinduksi menggunakan 2,4-D
dikombinasikan dengan KT dialihkan kepada media A dilengkapi dengan 2 mg l-1
dari 2,4-D yang dikombinasikan dengan 0,5 mg l-1 dari KT. Kalus disubkultur setiap
dua minggu selama 6 - 8 minggu periode inkubasi dalam gelap pada 26 ± 2 º C.
A & B) Kalus diinduksi pada benih split
Gambar C. kalus embriogenik diinduksi.
4. Regenerasi
Organogenic Kalus dipindahkan ke media penembakan terdiri dari media MS
ditambah dengan 4 mg l-1 BAP dan 2 mg l-1 KT dan diinkubasi pada 26 ± 2 º C di
bawah 16 / 8 fotoperiode. Kalus embriogenik itu, bagaimanapun, dipindahkan ke
Media A dilengkapi dengan tambahan 30 l g-1 dari sukrosa untuk pematangan
embrio dan diinkubasi pada 26 ± 2 º C dalam gelap. Setelah pematangan, embrio
diinkubasi pada MS tanpa hormon pada 26 ± 2 º C media di bawah 16 / 8 fotoperiode
Gambar (D). embrio globular diinduksi pada pemeliharaan media. (E).Embrio
pada media pematangan
Gambar (F). Organogenic kalus diinduksi. (G). pucuk diinduksi pada dari kalus
organogenic
5. Aklimatisasi
Ketika planlet dikembangkan 2-3 daun, mereka transplantasi ke pot plastik
yang diisi dengan lumut pit lembab (Kekkilä Oyj,Tussula, Finlandia). Tanaman
disemprot dengan air dan ditutup dengan polietilen kantong kertas untuk menaikkan
kelembaban relatif dan memberi minum teratur di rumah kaca. Setelah dua minggu,
tanaman diaklimatisasi dipindahkan ke ember diisi dengan tanah lempung dicampur
dengan pasir dan Phytomix (Kenya Benih Co Ltd, Kitale, Kenya) dalam 2:1 dan
rasio dibawa kembali ke rumah kaca.
Gambar (H).Beberapa pucuk diinduksi pada kalus organogenic Katumani.( I) Tunas
pada media elongasi
Gambar (J) .Aklimatisasi
Secara umum diketahui bahwa induksi kalus embriogenik terjadi pada
permukaan scutellum. Zona inisiasi sel meristematik adalah diamati dari scutellum
embrio belum menghasilkan jagung. Namun, semua tanaman regenerasi dalam
penelitian ini adalah
diperoleh dari kalus organogenic induksi di dasar bulu kecil di mana ia melekat
scutellum tersebut. Demikian pula, Danson et al. (2006) melaporkan bahwa dengan
pengecualian mSv garis CYMMYT Pool A3-6 dan garis CMB5 dengan respon
embriogenik 12 dan 8%
masing, tidak ada baris yang tersisa jagung tropis maju melampaui 45 langkah
subkultur hari untuk pembentukan kalus Tipe II. Kultur jaringan awal bekerja pada
elit tropis CML72 baris jagung, CML216, CML323, dan CML327 juga diproduksi
hanya tipe I kalus (Bohorova et al, 1995). Alasan paling mungkin untuk ini bisa latar
belakang peran genetik dalam pembentukan Tipe II kalus. Kematangan tingkat
embrio dipanen dari biji kering juga bisa memainkan peran utama karena kurangnya
regenerasi melalui somatik embriogenesis. Mirip respon induksi kalus rendah
kemampuan dan regenerasi yang berpengalaman untuk dewasa embrio dipanen 21
DAP. Para 16,5 dan frekuensi regenerasi 21,2% dan 1 - 5 pucuk per kalus dilaporkan
dalam penelitian ini adalah rendah dibandingkan laporan. Namun, banyak pekerja
lain juga melaporkan frekuensi regenerasi yang lebih rendah untuk tropis genotipe
jagung. Regenerasi mengurangi frekuensi untuk baris jagung tropis dibandingkan
dengan beriklim baris dari embrio belum matang. Ini respon yang rendah
kemungkinan besar disebabkan oleh sifat perlawanan genotipe jagung tropis dengan
kondisi kultur jaringan dikembangkan menggunakan garis sedang. Namun,
mengingat sepanjang tahun ketersediaan dan kelimpahan, penggunaan embrio
dewasa sebagai sumber eksplan alternatif dapat berguna dalam kultur jaringan
jagung tropis dan transformasi studi. Selain itu, ini adalah laporan pertama mengenai
regenerasi garis jagung tropis dari embrio matang melalui jalur yang melibatkan
induksi kalus.