Post on 21-Jan-2016
description
LAPORAN GENETIKA MOLEKULER
ELEKTROFORESIS DAN KUANTIFIKASI DNA
Hari/Tanggal: Jum’at, 15 Juni 2012
Disusun Oleh:
1. Ira Nailas (081014097)2. Selva Rosyta Dewi (081014099)3. Nur Apriana (081014106)4. Dias Rizka Darisa (081014111)5. Indira Faya N (081014114)
Dosen Pembimbing
M. Hilman F.A, Ssi.,M.Si
PROGRAM STUDI BIOLOGIDEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNIVERSITAS AIRLANGGA
I. TUJUAN
Mengajarkan dan melatih kepada mahasiswa untuk dapat ampifikasi dan elektroforesis DNA
darah dan tumbuhan.
II. DASAR TEORI
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi
yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik
(titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran,
besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Campbell dkk. 2002: 396--398).
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas
ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfatkan
muatan listrik yang ada pada makro molekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium misalnya gel agarose,
kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul
tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein
(Yuwono, 2005).
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya
gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam
metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-
blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Elektroforesis gel merupakan
suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi
molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-
bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap
campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam
elektroforesis) (Finkelstein, 2007).
DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk
proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di
dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. (Sambrook & Russell
2001: 52--53).
III. ALAT dan BAHAN
Bahan : Alat :
Pewarna ethidium bromide Erlenmeyer
Agarosa Seperangkat alat elektroforesis
Buffer TAE Glove
Loading dye UV transluminator
IV. PROSEDUR KERJA
1. Pembuatan Gek agarosa
a. Timbang 0,5 gr Agarosa
b. Larutkan dalam 50 mL x 1 x Buffer TAE ke Erlenmeyer lalu larutkan
c. Panaskan Erlenmeyer hingga mendidih dan larutan jernih.
d. Dinginkan larutan agarosa (500C)x 2 µL Larutan ethidium bromide, campur hingga
homogen.
e. Siapkan tray, lalu tutup denganisolator pada ujung dan tuangkan larutan agarosa
dalam tray yang telah dipasang well-forming combs.
f. Tunggu sampai gel mengeras (± 25oC) lepas comb secara perlahan dan gel agarosa
siap digunakan.
2. Running Elektroforesis
a. Letakkan tray berisi gel agarosa dalam tanki elektroforesis dengan posisi gel terdapat
well pada kutub (-) DNA akan menuju kutub (+).
b. Tuang larutan 1x buffer TAE ke dalam tank elektroforesis sampai permukaan gel
terendam.
c. Ambil sampel 10 µL isolasi DNA dan letakkan di atas parafilm. Lalu campur dengan
2µL loading dye, lalu resuspen hingga homogeny.
d. Ambil 4-8 µL larutan, dan masukkan dalam well pada gel agarosa.
e. Tutup tank elektroforesis dan hubungkan ke arud listrik (100-120 V)
f. Tunggu selama ± 1 jam (running elektroforesis) sampai terlihat DNA migrasi
g. Matikan arus listrik dan ambil tray dengan glove setelah elektroforesis selesai.
h. Meletakkan tray pada UV transluminator (tampak pita DNA ) dan siapkan.
V. HASIL PENGAMATAN
No Gambar Keterangan
1. Hasil dari DNA yang telah
di UV. DNA sebelah kanan
merupakan gelombang 1 ,
dimana sampel dari
tumbuhan tidak ada DNA-
nya, sedangkan dari sampel
darah manusia DNA-nya
ada semua. Sedangkan
DNA sebelah kiri
merupakan gelombang 2,
dimana sampel dari
tumbuhan ada semua
bahkan ada RNA-nya dalam
jumlah yang cukup banyak ,
sedangkan dari sampel
manusia DNA-nya ada
semua namun tidak
sebanyak dengan DNA
milik gelombang 1.
2. Ini adalah sampel DNA dari
gelombang 2, dimana
sampel DNA dari tumbuhan
ada semua bahkan ada RNA
dalam jumlah yang cukup
banyak , sedangkan DNA
dari sampel darah manusia
DNA ada semua tetapi
sedikit sekali diketahui dari
pita DNA-nya yang sangat
tipis.
3. Ini adalah sampel DNA dari
gelombang 1, dimana
sampel DNA dari tumbuhan
ada yang tidak ada,
sedangkan DNA dari
sampel darah manusia DNA
ada semua diketahui dari
pita DNA yang tebal.
VI. PEMBAHASAN
DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan senyawa biomolekuler
pembawa sifat genetik yang tersusun dari asam nukleat dan pengatur
seluruh perkembangan biologis makhluk hidup. DNA hadir dalam bentuk
double helix (pilinan ganda) berupa dua pita yang saling berpasangan. Satu
pita DNA tersusun dari banyak nukleotida. Nukleotida merupakan monomer
dari DNA. Nukleotida terdiri dari gugus gula, basa nitrogen dan fosfat
(Irawan,2008). Komponen fosfat yang melekat pada atom C5' dari gula
memiliki dua atom O yang belum berpasangan. Keadaan demikian membuat
nukleotida bermuatan negatif sebagaimana gambar di bawah ini:
Nukleotida-nukleotida tersebut akan saling berikatan dengan ikatan
fosfodiester membentuk suatu pita DNA. Sekalipun pita DNA yang panjang
tidak mengalami kendala dalam ikatannya namun pita DNA tersebut akan
selalu bermuatan negatif.
Pada tahun 1947, sebelum ditemukannya struktur molekul DNA,
seorang ahli biokimia bernama Erwin Chargaff menganalisis komposisi basa
DNA sejumlah organisme yang berbeda. Hasil analisisnya adalah tiap spesies
organisme memiliki komposisi DNA yang berbeda-beda. Banyaknya keempat
basa nitrogen pada tiap spesies tidak sama, tetapi memiliki perbandingan
yang khas. Artinya, tiap spesies memiliki jumlah basa yang khas. Dalam DNA
setiap spesies yang ditelitinya, Chargaff mengemukakan bahwa jumlah
adenin hampir sama dengan jumlah timin dan jumlah sitosin hampir sama
dengan jumlah guanin. Selain itu, urutan basa dan panjang DNA pada tiap
spesies berbeda. Dengan 4 macam basa dan DNA yang panjang, akan
terbentuk berbagai kemungkinan urutan basa. Karena gen tersusun dari
urutan basa tertentu, maka jumlah gen pada DNA juga sangat banyak
kemungkinannya. Jadi, hanya dengan 4 macam basa akan terbentuk banyak
gen yang menentukan sifat individu.
Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA murni dari pengotor-
pengotor yang terdapat pada sel, misalnya organel-organel sel lainnya.
Sedangkan proses elektroforesis merupakan suatu migrasi partikel melalui
suatu media di bawah pengaruh medan listrik. Pada praktikum kali ini
menggunakan gel agarose sebagai medianya. pembuatan gel agarose
dilarutkan dalam buffer TAE hingga larut. Penambahan larutan buffer pada
pembuatan gel agarose berfungsi untuk mendukung proses elektroforesis
Kebanyakan gel agarosa dibuat antara 0,7% dan 2%. Sebuah gel 0,7%
akan menunjukkan pemisahan yang baik (resolusi) fragmen DNA besar (kb
5-10) dan gel 2% akan menunjukkan resolusi yang baik untuk fragmen kecil
(0,2-1 kb). Gel dalam persentase rendah bersifat sangat lemah dan bisa
pecah ketika diangkat. Gel dalam persentase yang tinggi sering rapuh dan
tidak larut secara merata. Pada praktikum kali ini menggunakan prosentase
1%.
Tujuan dari penggunaan gel ini untuk melihat DNA. DNA
divisualisasikan pada gel dengan penambahan etidium bromida pada saat
gel agarose yang telah didihkan mengalami penurunan suhu atau diberikan
pada suhu berkisar 50oC bertujuan untuk meminimalkan penguapan etidium
bromida. Etidium bromida sangat berbahaya atau bersifat mutagenik.
Kelebihannya, Etidium bromida dapat mengikat kuat DNA dengan
terinterkalasi antara dasar dan neon yang berarti bahwa ia menyerap sinar
UV tidak terlihat dan memancarkan energi sebagai cahaya oranye terlihat.
Sebelum gel agarose dituangkan dalam tray dipasang comb (yang telah
ditentukan jumlah well sesuai kebutuhan) terlebih dahulu untuk membuat
well. Dimana well tersebut digunakan untuk meletakkan hasil isolasi DNA.
Well merupakan kutub negatif yang merupakan tempat DNA. Telah kita
bahas di atas bahwa DNA bermuatan negatif.
Gel agarose yang telah dingin dalam tray dimasukkan dalam tank
elektroforesis. Namun sebelumnya comb harus dilepas secara perlahan agar
gel tidak rusak. Selanjutnya dilakukan penuangan buffer TAE ke dalam tank
elktroforesis. Penggunaan buffer TAE pada proses elektroforesis tersebut
digunakan sebagai media perantara katode yang dialirkan dari sumber listrik
ke dalam gel. Penggunaan larutan penyangga yang sama pada pembuatan
gel, sample dan media perantara katode dinamakan continuous buffer
system. Dalam sistem kontinu, muatan molekul dan ukuran pori gel adalah
satu-satunya faktor yang memiliki efek penting pada pemisahan dan
penyusunan atau konsentrasi sampel ke dalam sebuah band. Sebuah band
terkonsentrasi bentuk sampel dimana molekul melambat antara permukaan
buffer dan gel.
Sampel hasil isolasi DNA 10 µl dicampur dengan loading dye 2 µl,
kemudian di-resuspen hingga homogen. Penambahn loading dye pada
sample memiliki dua tujuan. Pertama, pewarna tersebut memberikan
muatan untuk membantu berat DNA, sehingga dapat tenggelam ke dasar
sumur dan tidak mengapung dalam larutan buffer. kedua, loading dye
bergerak lebih cepat dari bagian DNA yang sebenarnya sehingga dapat
dijadikan sebagai indikator untuk mengetahui kapan listrik pada ruang
elektroforesis harus dimatikan. Cairan tersebut juga membuat DNA terlihat
dengan mata telanjang, memberikan warna keunguan, dan membuat proses
elektroforesis lebih cepat berlangsung.Proses elektroforesis berlangsung
selama kurang lebih satu jam. Kemudian tray hasil dari proses elektroforesis
diletakkan dalam UV transluminator untuk melihat band-band DNA.
VII. KESIMPULAN
Proses elektorforesis ialah suatu proses migrasi molekul-molekul DNA
dari muatan negatif ke muatan positif melalui suatu larutan penyangga.
Proses ini bertujuan untuk melihat pita-pita DNA pada suatu sampel.
Penggunaan larutan penyangga atau buffer yang sama pada pembuatan gel,
sample dan media perantara katoda dinamakan continuous buffer system.
Penambah loading dye ialah untuk memberikan pewarnaan dan muatan
pada DNA agar tidak mengapung dalam larutan buffer.
VIII. DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Terj. dari Biology oleh
Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.
Academic Press, Inc., San Diego: xviii + 235 hlm.
David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC.
Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.
Sambrook, J. & D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual vol 2. 3rd ed.
Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York: xvii + 3.4--14.53 + 1.44
Skoog, A. D; F. J. Holler; and T. A. Nieman. 1998. Principle of Instrumental Analysis Fifth
Edition. Saunders College Publishing.
Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Penerbit Erlangga: Jakarta.
Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
XI. LAMPIRAN
No Gambar Keterangan1.
Ethidium Bromine
2.Buffer TAE
3.Tray yang masih kosong dan yang menutup isolator pada ujung
4.Proses pembuatan Gel Agarose
5.Penuangan agarose pada tray,yang telah di beri sisir.
6.Gel Agarose yang sudah mengeras
7.Agarose yang telah memadat dan diambil sisirnya,agar membentuk kolom-kolom
8.Saat penuangan larutan 1x buffer TAE ke tank elektroforesis sampai permukaan gel terendam
9.Sampel DNA tumbuhan maupun darah yang akan digunakan untuk elektroforesis
10.Pengambilan sampel DNA tumbuhan maupun darah
11.Saat pengambilan sampel 10 µl isolasi DNA tumbuhan maupun darah dan meletakkan diatas parafilm kemudian mencampurkannya atau meresuspen.
12.Saat akan memberikan larutan dan dimasukkan dalam well pada gel agarose
13.sampel dalam well pada agarose, yang siap untuk di elektroforesis
14.Saat menutup tank elektroforesis
15.Menghubungkan arus ke listrik (100 volt ) selama 2 jam (running elektroforesis sampai terlihat molekul DNA migrasi
16.Saat meletakkan Try pada UV transluminator (akan tampak pita DNA)
17.Pita DNA tumbuhan
18.Pita DNA hewan