TINJAUAN PUSTAKA

Botani Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC)

Tanaman andaliman adalah tanaman rempah yang tumbuh di pegunungan

kawasan Danau Toba dan sekitarnya. Diduga penyebaran tanaman secara liar

melalui media kotoran burung. Burung memakan buah andaliman, kemudian

melalui kotoran burung tersebut biji andaliman tersebar kemana-mana dan tumbuh

secara liar. Menurut Hasairin (1994) dan Siregar (2003), andaliman mempunyai

ciri-ciri berperawakan perdu, tegak dengan tinggi 3-8 meter, batang dan cabang

merah kasar beralur, berbulu halus dan berduri (Gambar 2.1).

Gambar 2.1 (a) Tanaman Andaliman Terdiri Batang, Cabang, Ranting Berduri

(b) Buah Andaliman

Buah andaliman berbentuk bulat kecil berwarna hijau, bila digigit

mengeluarkan aroma wangi dan ada rasa getir yang tajam dan khas, serta dapat

merangsang produksi air liur. Menurut Sirait et al. (1991) masyarakat Himalaya,

Tibet dan sekitarnya menggunakan tumbuhan ini dalam produk pangan sebagai

bahan aromatik, perangsang nafsu makan dan sebagai obat sakit perut.

Tumbuhan andaliman berasal dari daerah Himalaya Subtropis, dan

distribusi dari tanaman ini terdapat di India Timur, Nepal, Pakistan Timur,

Myanmar, Thailand, China, Sumatera Utara dan Jepang (Hsuan Keng 1978). Di

Sumatera Utara tanaman ini tumbuh liar pada berbagai tempat, yaitu di daerah

Humbang, Silindung, Dairi dan Toba Holbung. Aroma dan rasa yang khas bumbu

ini tidak dapat ditinggalkan bagi orang yang telah terbiasa memakannya.

(a) (b)

6

Menurut Hsuan Keng (1978) tanaman andaliman dengan nama latin

Zanthoxylum acanthopodium DC dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Geraniales

Famili : Rutaceae

Marga : Zanthoxylum

Spesies : Zanthoxylum acanthopodium DC.

Pemanfaatan andaliman sebagai sambal atau bumbu masakan berbagai

jenis masakan tradisional suku Batak semakin menurun dengan bergesernya pola

makan dan gaya hidup masyarakat yang cenderung menginginkan serba praktis.

Selama ini telah banyak upaya untuk membudidayakan tanaman andaliman, tetapi

tidak menunjukkan hasil yang memuaskan karena sulit tumbuh, walaupun ada

yang dapat tumbuh tetapi tidak berbuah. Pengembangbiakan melalui biji tidak

berlangsung baik, walaupun perlakuan-perlakuan fis ik dan kimia telah diteliti.

Penelitian yang dilakukan Sirait et al. (1991) melaporkan bahwa dari 74 biji

andaliman yang dicangkok ternyata hanya ada 7 yang menumbuhkan akar. Cara

yang tepat untuk pengembangbiakan tanaman andaliman sampai saat ini belum

diketahui. Penelitian ini merupakan dasar pemikiran untuk pengajuan manfaat

pengembangan tanaman andaliman pada Pemerintah Daerah.

Di sekitar kawasan Danau Toba Sumatera Utara terdapat tiga jenis varietas

tanaman andaliman yaitu :

1. Sihorbo - tanaman andaliman dengan bentuk buah besar, kurang aromatik

dan produksi rendah

2. Simanuk - tanaman andaliman dengan bentuk buah kecil, aroma dan rasa

lebih tajam dari Sihorbo, dan produksi lebih tinggi

3. Sitanga - tanaman andaliman dengan aroma buah sangat tajam hingga

mirip bau kepinding alias tanga, produksi tinggi, namun kurang disenangi

masyarakat sampai sekarang.

7

Senyawa Antibakteri dari Bahan Tanaman

Pada beberapa bagian tanaman mengandung senyawa yang dapat bersifat

sebagai antibakteri. Senyawa tersebut diproduksi secara biologis oleh tanaman,

dan dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba (Nychas 1995).

Senyawa antibakteri yang dewasa ini banyak dikenal sebagai bahan pengawet

merupakan senyawa kimia yang mempunyai kemampuan menghambat

pertumbuhan bakteri (bakteristatik) atau membunuh bakteri (bakterisidal)

(Surekha dan Reddy 2000).

Beberapa bahan lain seperti gula, garam, vinegar, rempah-rempah atau

ekstrak minyak dari rempah-rempah, zat-zat dari pengasapan kayu merupakan

bahan-bahan yang tidak tergolong dalam bahan pengawet kimia atau sintetik

menurut definisi dari Food and Drug Administration (FDA). Pemilihan jenis

antimikroba yang cocok tergantung dari beberapa faktor, yaitu sifat-sifat

antimikroba yang digunakan, sifat dan komposisi produk pangan yang akan

diawetkan, tipe sistem pengawetan lain yang ada pada bahan pangan, karakteristik

dan jumlah mikroorganisme awal, serta keamanan dan harga (Branen 1993).

Senyawa kimia yang digunakan untuk mencegah kerusakan pangan

memiliki sifat antiseptik pada kondisi tertentu. Jenis senyawa kimia yang banyak

digunakan sebagai bahan pengawet karena mempunyai daya antimikroba antara

lain adalah sulfit, nitrat dan nitrit. Senyawa biologis yang mempunyai aktivitas

antimikroba digolongkan dalam 3 kelompok, yaitu (1) senyawa antimikroba alami

yang berasal dari mikroorganisme seperti bakteriosin; (2) senyawa antimikroba

alami yang berasal dari hewan seperti fagosom, antibiotik, peptida, avidin, sistem

laktoperoksidase dan lisozim; (3) senyawa antimikroba alami yang berasal dari

tanaman seperti fitoaleksin, asam organik, minyak atsiri, senyawa fenolik, pigmen

dan senyawa kerabatnya (Gould 1995).

Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas antibakteri adalah: (1) jenis,

jumlah, umur dan latar belakang kehidupan bakteri, (2) konsentrasi zat antibakteri,

(3) suhu dan waktu kontak, (4) sifat fisiko-kimia substrat, seperti: pH, kadar air,

tegangan permukaan, jenis dan jumlah zat terlarut, koloid dan senyawa-senyawa

lainnya (Frazier dan Westhoff 1983).

8

Golongan Fenolik

Senyawa fenolik merupakan substansi yang mempunyai satu cincin

aromatik dengan satu atau lebih substitusi gugus hidroksi (-OH) yang termasuk

turunan fungsional. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena

umumnya akan berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat

dalam vakuola sel. Senyawa ini diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaitu (1)

golongan fenol sederhana (vanilin, gingerol, shogaol, guaiakol dan eugenol); asam

fenol (p-kresol, 3-etilfenol, hidrokuinon dan asam galat); (2) turunan asam

hidroksinamat (p-kumarin, kafein dan firulin); (3) flavonoid (antosianin, flavonon,

flavonol dan tanin) (Nychas 1995; Shahidi dan Naczk 1995).

Beberapa senyawa fenolik yang bersifat antibakteri, seperti senyawa fenol

sederhana, gingerol dan turunannya dapat menghambat pertumbuhan

Mycobacterium avium dan M. tuberculosis (Hiserodt et al.1998). Eugenol yang

juga merupakan fenol sederhana dapat menghambat pertumbuhan Bacillus

subtilis. Golongan fenolik dari turunan hidroksinamat seperti kafein diketahui

dapat menghambat pertumbuhan Listeria monocytogenes (Conner 1993).

Golongan fenolik pada flavonol seperti katekin dapat menghambat pertumbuhan

V. cholerae dan aktivitas toksin yang dihasilkan (Toda et al. 1991).

Kondisi-kondisi yang dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri adalah

struktur fungsional pada senyawa-senyawa fenolik sederhana, diantaranya: (1)

adanya peningkatan ikatan gugus n-alkil (<C5) dalam senyawa yang dapat

meningkatkan aktivitas antibakteri, (2) posisi ikatan gugus alkil diduga juga dapat

mempengaruhi aktivitas antibakteri, (3) turunan-turunan polihidroksi umumnya

lebih kecil pengaruhnya dibandingkan dengan komponen monohidroksi, dan (4)

pemisahan gugus alkil dengan oksigen (contohnya metoksi-) dari senyawa fenolik

dapat menurunkan aktivitas antibakteri (Branen dan Davidson 1993 ). Sebagian

besar senyawa-senyawa golongan fenolik dalam bentuk glikosida-glikosida

cenderung bersifat polar, karena adanya gugus-gugus hidroksil (-OH) pada

struktur dasar senyawa fenolik, sehingga mudah larut dalam pelarut polar seperti

etanol, metanol, dan air (Houghton dan Raman 1998).

Senyawa-senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas antimikroba, seperti:

licochalcone A, licochalcone B, licochalcone C, licochalcone D, dan echinatin

9

(Gambar 2.2) yang diisolasi dari akar tanaman Glycyrrhiza inflata, digolongkan

ke dalam retrochalcone yaitu khalkon dengan gugus oksigen pada posisi ikatan -2.

Gambar 2.2 Struktur licochalcone A (a), licochalcone B (b), licochalcone C (c),

licochalcone D (d), dan echinatin (e) (Haraguchi et al. 1998).

Senyawa retrochalcone seperti licochalcone A (Gambar 2.2-a) dan

licochalcone C (Gambar 2.2-c) terbukti memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi

khususnya terhadap bakteri-bakteri Gram positif seperti sel S. aureus, M. luteus

dan B. subtilis dengan nilai MIC rata-rata 5.21 µg/ml. Hal ini erat kaitannya

dengan keberadaan gugus prenil pada cincin B struktur retrochalcone yang lebih

bersifat hidrofobik, sehingga memudahkan licochalcone A dan licochalcone C

berpenetrasi ke dalam membran sel bakteri dibandingkan dengan licochalcone B

dan licochalcone D yang lebih bersifat hidrofilik akibat adanya dua gugus

hidroksil (-OH) tanpa adanya gugus prenil pada cincin B. Selanjutnya

licochalcone A dan licochalcone C yang berpenetrasi ke dalam membran sel

bakteri akan mengganggu sistem transport elektron (O 2) dengan cara menghambat

NADH oksidase pada membran sel yang mengakibatkan penghambatan proses-

proses respirasi sel bakteri secara keseluruhan (Haraguchi et al. 1998).

(b)

(c) (d)

(e)

(a)

10

Golongan Terpenoid

Golongan terpenoid dikenal sebagai senyawa utama pada tanaman yang

bersifat sebagai penyusun minyak atsiri. Terpenoid mempunyai rumus dasar yaitu:

(C5H8)n atau dengan nama lain adalah isoprene-2 metil-2,3 butadiena (Teisser

1994). Golongan terpenoid yang mempunyai aktivitas antibakteri antara lain

adalah borneol, sineol, pinene, kamfene, dan kamfor (Conner 1993), nerelidol,

linalool, indol dan kadinen (Kubo et al. 1993) dan jus apel (Friedman et al.

2004a). Golongan senyawa ini efektif untuk menghambat pertumbuhan B. subtilis,

S. aureus, Salmonella enterica dan E. coli.

Sebagian senyawa-senyawa antibakteri dalam tanaman terdapat dalam

fraksi minyak atsiri yang diperoleh dari bahan tanaman melalui destilasi uap atau

dengan perlakuan dingin dan destilasi vakum, serta ekstraksi dengan pelarut-

pelarut organik (Reineccius 1994). Minyak atsiri (essential oils) didefenisikan

sebagai suatu kelompok dari senyawa berbau (odorus), larut dalam alkohol, terdiri

dari campuran eter, aldehida, keton, dan terpen (Nychas dan Tassou 2000).

Minyak atsiri umumnya merupakan gabungan kelompok-kelompok senyawa

volatil yang membentuk aroma spesifik dari spesies tanaman tertentu. Kelompok-

kelompok senyawa kimia yang terkandung dalam minyak atsiri, diantaranya

adalah: (a) hidrokarbon dengan formula kimia (C5H8)n, sebagai senyawa terpen

rendah seperti monoterpen, diterpen dan seskuiterpen; (b) turunan oksigenasi dari

senyawa-senyawa terpen diatas; (c) senyawa-senyawa aromatik dengan struktur

benzoid; dan/atau (d) senyawa-senyawa yang mengandung nitrogen atau sulfur

(Reineccius 1994). Secara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan

terdapat di dalam sitoplasma sel tumbuhan. Kebanyakan terpenoid alam

mempunyai struktur siklik dan mempunyai satu gugus fungsi atau lebih (hidroksil,

karbonil, dan lain-lain) sehingga pada langkah akhir sintesis terjadi siklisasi dan

oksidasi atau pengubahan struktur lainnya (Harbone 1996). Secara rinci golongan

utama terpenoid tumbuhan dapat dilihat pada Tabel 2.1.

Senyawa terpen merupakan senyawa antibakteri utama dalam rempah-

rempah (Naidu dan Davidson 2000). Senyawa antibakteri aktif dalam sage dan

rosemary adalah borneol dan fraksi terpen. Senyawa ini memiliki daya hambat

terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif (Shelef 1983). Senyawa

11

monoterpen alkohol dan senyawa sesquiterpen alkohol seperti citronelal, geraniol,

linalool dan nerol terdapat pada sebagian besar minyak atsiri (Oyen dan Nguyen

1999). Senyawa-senyawa terpen ini telah dibuktikan memiliki sifat antibakteri

terhadap Campylobacter jejuni, E. coli, L. monocytogenes dan Salmonella

enterica (Friedman et al. 2002).

Tabel 2.1 Golongan Utama Terpenoid Tumbuhan

Jumlah Jumlah Golongan Jenis utama dan sumbernya Satuan karbon Isoprena 1 C5 Isoprena dideteksi dalam daun Hamamelis japobica

2 C10 Monoterpenoid monoterpena dalam minyak atsiri monoterpena lakton tropolon

3 C15 Seskuiterpenoid seskuiterpena dalam minyak atsiri seskuiterpena lakton absisin

4 C20 Diterpenoid asam diterpena dalam damar tumbuhan giberelin

6 C30 Triterpenoid sterol, triterpena, saponin, glikosida 8 C40 Tetraterpenoid karotenoid n Cn Poliisoprena karet

Sumber : Harbone 1996

Golongan Alkaloid

Secara umum alkaloid merupakan metabolit basa yang mengandung

nitrogen dan banyak sekali ragamnya termasuk struktur kimianya. Sebagian besar

alkaloid dibentuk dari asam-asam amino seperti lisin, ornitin, fenilalanin, tirosin

dan triptofan, serta kerangka asam-asam amino tersebut sebagian besar masih

tetap dalam struktur senyawa-senyawa alkaloid dan turunannya (Herbert 1988).

Banyak jenis alkaloid yang bersifat terpenoid atau sebagai terpenoid

termodifikasi. Beberapa jenis lainnya berupa senyawa aromatik seperti kolkhisina

yang mengandung gugus basa sebagai gugus rantai samping (Harbone 1996).

Banyak senyawa alkaloid yang khas dari suatu jenis tumbuhan atau

beberapa tumbuhan sekerabat. Oleh karena itu nama alkaloid seringkali

diturunkan dari nama sumber tumbuhan penghasilnya, misalnya alkaloid lupanin

dan albin yaitu alkaloid lupin dari biji Lupines albus L. (Mohamed et al. 1994 dan

Muzquiz et al. 1994) dan (+)-aphelandrine yaitu kelompok macrocyclic spermine

12

alkaloid dari akar tanaman Aphelandra fuscopunctata (Youhnovsky et al. 1999).

Saat ini, hanya ada beberapa kelompok peneliti yang telah berhasil menemukan

senyawa-senyawa antimikroba dan/atau antibakteri dari alkaloid tanaman,

diantaranya adalah: Bhattacharyya et al. (1993), Chakraborty et al. (1995), dan

Ramsewak et al (1999). Dari ketiga kelompok peneliti tersebut, semuanya

menemukan senyawa-senyawa antibakteri dari alkaloid tanaman yang termasuk

dalam kelompok senyawa alkaloid karbazol sebagai struktur dasar.

Secara umum alkaloid merupakan metabolit basa yang mengandung

nitrogen dan banyak sekali ragamnya termasuk struktur kimianya (Mann 1996).

Aktivitas senyawa-senyawa alkaloid atau senyawa yang mengandung N dari

tanaman sebagai senyawa antibakteri, belum banyak diketahui. Salah satu yang

telah diketahui mempunyai aktivitas antibakteri adalah senyawa alkaloid karbazol.

Senyawa antibakteri alkaloid karbazol terbukti memiliki aktivitas antibakteri,

diantaranya adalah (a) 3-metil-6,7-metilenadioksidakarbazol, (b) 1,8-d imetoksi-3-

formilkarbazol dan (c) beberapa senyawa alkaloid karbazol. Senyawa 3-metil-6,7-

metilenadioksidakarbazol (C 14H11NO2), bersifat antibakteri kuat dengan nilai MIC

terhadap B. subtilis sebesar 15 µg/ml, E. coli 25 µg/ml, dan S. aureus 33 µg/ml.

Senyawa ini diisolasi dari fraksi netral ekstrak dietileter kulit kayu tanaman

Clausena heptaphylla (Bhattacharyya et al. 1993). Senyawa 1,8-d imetoksi-3-

formilkarbazol (C15H13NO3), merupakan senyawa antibakteri dan antikapang yang

kuat dengan nilai MIC terhadap S. aureus 6 µg/ml, C. albicans 8 µg/ml,

P. aeruginosa dan S. Typhimurium sebesar 25 µg/ml, diisolasi dari fraksi netral

ekstrak etanol daun tanaman Clausena heptaphylla (Chakraborty et al. 1995).

Beberapa senyawa alkaloid karbazol lain seperti mahanimbina, mahanina, dan

murayanol, diisolasi dari ekstrak aseton daun tanaman Murraya koenigii, terbukti

memiliki aktivitas antibakteri, khususnya terhadap S. aureus, E. coli, dan

Streptococcus pyogenes (Ramsewak et al. 1999).

Penghambatan bakteri oleh suatu senyawa antibakteri dinyatakan dengan

nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) yaitu konsentrasi minimum yang

dapat menghambat pertumbuhan bakteri lebih dari 90%, sedangkan nilai

Minimum Bactericidal Concentration (MBC) menyatakan konsentrasi minimum

yang dapat membunuh bakteri sebanyak 99.9% atau lebih dari inokulum asal

13

selama inkubasi 24 jam (Baron et al. 1995; Carson dan Riley 1995). Nilai MIC

dan MBC senyawa antibakteri ekstrak rempah-rempah maupun tanaman lainnya

berbeda-beda tergantung pada jenis mikroba. Nilai MIC senyawa antibakteri yang

lebih rendah menunjukkan bakteri lebih rentan terhadap komponen tersebut.

Ekstraksi Komponen Bioaktif

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Senyawa

aktif yang terdapat dalam berbagai bahan alami dapat digolongkan ke dalam

golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Struktur kimia yang

berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan dan stabilitas senyawa-senyawa

tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat dan derajat keasaman.

Dengan diketahuinya senyawa aktif yang terkandung dalam bahan akan

mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Departemen

Kesehatan 2000).

Beberapa metode ekstraksi yang d ilakukan tergantung pada beberapa

faktor, antara lain: (1) tujuan dilakukan ekstraksi, (2) skala ekstraksi, (3) sifat-sifat

komponen yang akan di ekstraksi, dan sifat-sifat pelarut yang akan digunakan

(Houghton dan Raman 1998). Prinsip metode ekstraksi menggunakan pelarut

organik adalah bahan yang akan diekstrak kontak langsung dengan pelarut pada

waktu tertentu, kemudian diikuti dengan melakukan pemisahan dari bahan yang

telah diekstrak. Metode ekstraksi dengan refluks pelarut organik pada dasarnya

adalah ekstraksi dengan pengadukan yang dilakukan pada suhu cukup tinggi (60-

700C) dan dilengkapi dengan kondensor (Adawiyah 1998).

Senyawa antibakteri dapat diperoleh dari berbagai bagian tanaman seperti

umbi, batang, kulit, daun, rimpang dan biji. Bagian tanaman tersebut mengandung

senyawa antibakteri yang berbeda-beda dan aktivitas penghambatannya berbeda

pula terhadap setiap jenis bakteri. Masing-masing bagian tersebut dapat

diekstraksi dengan beberapa pelarut seperti yang disajikan pada Tabel 2.2.

Ekstraksi bagian dari tanaman (biji, buah, rimpang dan daun) dengan pelarut

heksana, etilasetat dan metanol efektif menghambat pertumbuhan bakteri patogen.

14

Tabel 2.2 Beberapa Bagian Tanaman yang Bersifat Antimikroba

Bagian dan jenis tanaman Ekstraksi Bakteri yang dihambat Pustaka

Biji Lada Ekstrak metanol S. aureus, C. albican Sutedja dan

Agustina 1994 Atung Ekstrak etilasetat S. aureus, P. fluorescens Moniharapon 1991;

Murhadi 2002; Lavlinesia 2004

Buah Andaliman Ekstrak heksana

Ekstrak etilasetat Ekstrak metanol

E. coli, A. flavus, Fusarium S. aureus, P. fluorescens, S. Typhimurium, E. coli, P. fluorescens B.stearothermophilus S. Typhimurium,

Mulia 2000 Ardiansyah 2001

Mobe Ekstrak heksana Ekstrak etilasetat Ekstrak metanol

E. coli, A. flavus, Fusarium S. aureus, P. fluorescens, S. Typhimurium, E. coli, P. fluorescens B.stearothermophilus S. Typhimurium,

Yasni et al. 2004

Rimpang Lengkuas Ekstrak metanol V. cholerae, S. aureus,

L. monocytogenes Rahayu 1999

Daun Teh Ekstrak metanol Streptococcus mutan Sakanaka et al.

1989 Sirih Ekstrak metanol E. coli, S. Typhimurium,

S. aureus. L. monocytogenes Sukarminah 1997

Pemilihan pelarut organik yang akan digunakan dalam ekstraksi

komponen bioaktif tanaman merupakan faktor penting dan menentukan untuk

mencapai tujuan dan sasaran ekstraksi komponen. Beberapa pelarut yang dapat

digunakan dalam ekstraksi dapat dilihat pada Tabel 2.3. Semakin tinggi nilai

polaritas, konstanta dielektrik, titik didih dan kelarutan dalam air maka pelarut

akan semakin polar.

Berdasarkan sifat fisik tersebut pelarut heksana bersifat nonpolar, etilasetat

bersifat semipolar dan metanol bersifat polar. Menurut Houghton dan Raman

(1998) pelarut dikelompokkan berdasarkan kekuatan pelarutnya. Heksana

merupakan pelarut paling nonpolar sedangkan air merupakan pelarut paling polar.

Ekstraksi dilakukan secara maserasi (tidak menggunakan panas) dan perkolasi

(menggunakan panas), dimana ekstraksi dengan menggunakan panas lebih cepat

mengekstrak senyawa yang diinginkan, karena pemanasan akan memperbesar

kelarutan. Biasanya untuk senyawa yang stabil dapat digunakan ekstraksi

15

sinambung dengan alat soxhlet, yang merupakan cara yang cepat dan hemat

(Hostettmann et al. 1997).

Tabel 2.3 Beberapa Sifat Pelarut Organik Untuk Ekstraksi

Pelarut Polaritas

(e) a)

Konstanta dielektrik (Debye) b)

Titik didih (0C) a)

Kelarutan dalam air

(%) b) • Karbondioksida 0.00 - -56.60 - • Pentana 0.00 1.84 36.20 0.010 • Heksana* 0.00 2.00 68.70 0.010 • Toluen* 0.29 2.40 11.06 0.046 • Benzen* 0.32 2.30 80.10 0.058 • Etilasetat 0.38 6.00 77.10 9.800 • Aseton 0.47 20.70 56.20 larut • Propan-2-ol (IPA) 0.63 18.30 82.30 larut • Etanol 0.68 24.30 78.30 larut • Metanol* 0.73 32.60 64.80 larut • Air 0.90 78.50 100.00

a)Moyler (1995); b) Houghton dan Raman (1998); * bukan pelarut bahan pangan

Sifat penting yang harus diperhatikan adalah kepolaran senyawa dilihat

dari gugus polarnya (seperti gugus OH, COOH dan lain -lain). Senyawa polar

lebih mudah larut dalam pelarut polar dan senyawa nonpolar lebih mudah larut

dalam pelarut nonpolar. Derajat polaritas tergantung pada tetapan dielektrik,

makin besar tetapan dielektrik semakin polar pelarut tersebut. Ekstraksi bertingkat

dilakukan secara berturut-turut dimulai dengan pelarut nonpolar (heksana) lalu

dengan pelarut yang kepolarannya menengah (etilasetat atau dietileter), kemudian

dengan pelarut polar (metanol atau etanol). Dengan cara demikian akan diperoleh

ekstrak awal (crude extract) yang mengandung berturut-turut senyawa nonpolar,

kepolaran menengah dan polar (Hostettmann et al. 1997).

Bakteri Uji Aktivitas Antibakteri

Bakteri yang dapat digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri pada

pangan meliputi bakteri Gram positif dan Gram negatif. Mikroba-mikroba

tersebut dapat digolongkan dalam mikroba patogen dan atau perusak karena kedua

golongan mikroba tersebut yang akan dicegah pertumbuhannya dengan antibakteri

yang terdapat pada rempah-rempah.

16

Bakteri Pembentuk Spora

Bacillus cereus merupakan bakteri penyebab keracunan yang terjadi di

Eropa sejak tahun 1906 (Jay 1996). Bakteri ini berbentuk batang, bersifat aerob

sampai aerob fakultatif, katalase positif dan kebanyakan bersifat Gram positif.

B. cereus dapat tumbuh pada suhu minimum 4-50C, suhu maksimum 48-500C,

dan suhu optimal pertumbuhannya 30-450C, serta pada pH antara 4.9-9.3 (Jay

1996; Granum dan Baird-Parker 2000). Bakteri ini memproduksi spora tahan

panas dan tahan radiasi, dan tetap aktif setelah pemanasan selama 4 jam pada suhu

1350C (Cary et al. 2000).

Bacillus cereus dapat menyebabkan beberapa penyakit infeksi dan

intoksikasi. Spora sel B. cereus bertunas dan sel vegetatif menghasilkan toksin

selama fase eksponensial pertumbuhan atau selama masa sporulasi. Munculnya

diare terjadi setelah masa inkubasi 1-24 jam dan terlihat sebagai diare yang terus

menerus disertai nyeri dan kejang perut; jarang terjadi demam dan muntah.

Enterotoksin dapat ditemukan pada bahan pangan atau dibentuk dalam usus

(Granum dan Baird -Parker 2000).

Dua galur B. cereus (CIP 51.27 dan Z 4234) merupakan bakteri yang

paling sensitif diantara bakteri Gram positif dengan nilai MIC dan Minimum

Lethal Concentration (MLC) pada ekstrak rosemary masing-masing sama yaitu

konsentrasi 6 mmol/l (Campo et al. 2000). Contoh lainnya adalah karvakrol yang

banyak terdapat pada oregano (Origanum vulgare) dapat mematikan B. cereus

pada konsentrasi 1 mmol/l, sedangkan konsentrasi minimun yang dapat

menghambat pertumbuhan B. cereus adalah 0.75 mmol/l (Ultee et al. 1998).

Bakteri Gram positif

Staphylococcus aureus merupakan mikroba flora normal yang terdapat

pada permukaan tubuh, seperti pada permukaan kulit, rambut, hidung, mulut dan

tenggorokan. S. aureus banyak mencemari pangan karena tindakan yang tidak

higienis dalam penanganan pangan (Adam dan Moss 1995). S. aureus mampu

memproduksi enterotoksin yang tahan panas. Menurut Cary et al. (2000),

enterotoksin yang dapat menimbulkan penyakit dihasilkan bila jumlah sel

mencapai > 1.0 x 106 cfu/g.

17

S. aureus pada ekstrak rosemary dengan konsentrasi 0.25-1.0% dapat

menghambat dan bersifat bakterisidal (Campo et al. 2000). Bakteri Gram positif

seperti S. aureus dan L. monocytogenes lebih sensitif terhadap 21 jenis minyak

atsiri tumbuh-tumbuhan, seperti minyak kayu putih, kayu manis, cengkeh

dibandingkan bakteri Gram negatif seperti Salmonella enteritidis dan E. coli

(Palmer et al. 1998).

Suhu optimum pertumbuhan S. aureus adalah 35-370C, suhu minimum

6.70C dan suhu maksimum 45.50C. Bakteri ini dapat tumbuh pada pH 4.0-9.8

dengan pH optimum sekitar 7.0-7.8. Pertumbuhan pada pH mendekati 9.8 hanya

mungkin bila substratnya mempunyai komponen yang baik untuk

pertumbuhannya (Supardi dan Sukamto 1999).

Bakteri Gram negatif

Salmonella Typhimurium merupakan bakteri patogen Gram negatif yang

banyak menimbulkan gangguan kesehatan manusia. Salmonella Typhimurium

merupakan bakteri Gram negatif, selnya berbentuk batang, dan tidak membentuk

spora. Bakteri ini bersifat motil dan flagella peritrikat, menghasilkan asam hasil

fermentasi dari glukosa, maltosa, manitol, dan sorbitol. Bakteri ini menggunakan

sitrat sebagai sumber karbon, tidak dapat memfermentasi salisin, selulosa dan

laktosa (Jay 1996). Salmonella Typhimurium tumbuh dengan suhu optimum

370C, meskipun dapat tumbuh pada suhu dibawah 100C, dan pH optimum

pertumbuhan adalah 6.5-7.5 walaupun dapat tumbuh pada interval pH 4.5-9.0.

Salmonella mempunyai ketahanan panas yang tinggi pada pH 5.5, aw rendah, dan

terdapat pada makanan dengan kandungan lemak tinggi, serta viabilitasnya akan

menurun selama penyimpanan beku (Portillo 2000).

Mekanisme Kerja Penghambatan Senyawa Antibakteri

Kemampuan rempah-rempah untuk menghambat pertumbuhan bakteri

merupakan salah satu kriteria pemilihan suatu senyawa antibakteri untuk

diaplikasikan sebagai pengawet bahan pangan. Semakin kuat efek

penghambatannya semakin efektif digunakan.

18

Pengaruh komponen antibakteri terhadap sel bakteri dapat menyebabkan

kerusakan sel yang berlanjut pada kematian. Kerusakan sel yang ditimbulkan

komponen antibakteri dapat bersifat mikrosidal (kerusakan bersifat tetap) atau

mikostatik (kerusakan yang dapat pulih kembali). Suatu komponen akan bersifat

mikrosidal atau mikostatik tergantung pada konsentrasi komponen dan kultur

yang digunakan (Bloomfield 1991).

Penghambatan aktivitas mikroba oleh komponen bioaktif tanaman dapat

disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: (1) gangguan pada senyawa

penyusun dinding sel, (2) peningkatan permeabilitas membran sel yang

menyebabkan kehilangan komponen penyusun sel, (3) menginaktifasi enzim

metabolik, dan (4) destruksi atau kerusakan fungsi material genetik (Brannen dan

Davidson 1993). Menurut Kanazawa et al. (1995) terjadinya proses tersebut diatas

karena pelekatan senyawa antimikroba pada permukaan sel mikroba atau senyawa

tersebut berdifusi ke dalam sel.

Fase pertumbuhan bakteri berpengaruh pada kerentanan bakteri terhadap

senyawa antibakteri. Menurut Thomson dan Hinton (1996) bakteri pada fase

stasioner lebih rentan terhadap antibakteri asam lemak rantai pendek dari pada

bakteri fase pertumbuhan eksponensial.

Kerusakan bakteri merupakan hasil interaksi senyawa antibakteri dengan

bagian tertentu pada sel bakteri (Gilbert 1984). Interaksi senyawa antibakteri

tersebut dapat menyebabkan sejumlah perubahan atau kerusakan pada sel bakteri

yang berpengaruh pada pola inaktivasi bakteri. Pada dosis yang tidak mematikan,

bakteri akan mengalami luka (injury), terjadi sejumlah perubahan dan kerusakan

struktur sel bakteri yang akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel,

pada kerusakan yang parah akan menyebabkan kematian. Bentuk dan besarnya

perubahan atau kerusakan struktur sel dipengaruhi oleh jenis senyawa antibakteri,

jenis bakteri dan besarnya konsentrasi yang digunakan. Perubahan dan kerusakan

struktur sel oleh senyawa antibakteri dapat berupa perubahan morfologi sel,

perubahan ultrastruktur sel, ukuran sel, kebocoran dinding dan membran sel,

ketebalan dinding dan penampakan sitoplasma (Gemmel dan Lorian 1996).

Kerusakan sel bakteri oleh beberapa jenis antibiotik seperti polimiksin B,

penisilin G dan streptomisin telah dipelajari oleh Lin et al. (2000), seperti terlihat

19

pada Tabel 2.4. Polimiksin B merusak membran sel, penisilin G merusak dinding

sel, sedangkan streptomisin merusak ribosom. Penisilin G bersifat aktif terutama

terhadap bakteri Gram positif dan negatif , sedangkan bakteri Gram negatif pada

umumnya resisten terhadap penisilin G dan streptomisin. Secara umum,

mekanisme kerja antibiotik adalah dengan mengganggu sintesis dinding sel,

sintesis protein, sintesis asam nukleat dan juga pada fungsi membran (Best 1999).

Tabel 2.4 Mekanisme Antibiotik Polimiksin B, Penisilin G dan Streptomisin

terhadap Kerusakan Sel Bakteri Antibiotik Kerusakan Mekanisme Fase Pertumbuhan Polimiksin B Membran sel Masuk melalui pori pada Semua fase pertumbuhan membran sel dan induksi kebocoran sel Penisilin G Dinding sel Menghambat pembentukan Eksponensial dinding sel dan lisis pada sel Streptomisin Ribosom Menyebabkan misreading Eksponensial mRNA dan produksi polipeptida yang salah Sumber: Lin et al. (2000)

Merusak Dinding Sel

Sel bakteri dilindungi oleh dinding sel yang terdiri dari peptidoglikan,

ruang periplasma yang merupakan tempat enzim-enzim ekstraseluler dan

membran sitoplasma yang terlibat dalam proses respirasi. Peptidoglikan tersusun

dari N-asetilglukosamin dan N-asetilmuramat yang saling berikatan satu sama lain

serta asam-asam amino L-alanin, D-alanin, D-glutamat dan lisin (Fardiaz 1992).

Sintesis dinding sel melibatkan sejumlah enzim untuk menggab ungkan

fosfoenolpiruvat dengan N-asetilglukosamin.

Lapisan peptidoglikan merupakan suatu molekul raksasa (Gambar 2.3).

S. aureus merupakan bakteri Gram positif, yang memiliki 40 lapisan

peptidoglikan, merupakan 50% dari bahan dinding sel, sedangkan pada Gram

negatif hanya ada 1-2 lapisan peptidoglikan dan merupakan 5-10% dari bahan

dinding sel. Setiap zat yang menghambat salah satu langkah dalam biosintesis

peptidoglikan akan menyebabkan dinding sel bakteri yang tumbuh menjadi lemah

dan sel akan mengalami lisis (Jawetz et al. 1996).

20

Gambar 2.3 Struktur Peptidoglikan S. aureus (a) Satu Lapisan Peptidoglikan (b) Dua Lapisan Peptidoglikan (Jawetz et al. 1996)

Rangka dasar polimer dinding sel terdiri atas rangkaian subunit asam N-

asetilglukosamin dan N-asetilmuramat yang berselang-seling, dihubungkan

dengan ikatan ß-1,4 (Gambar 2.3a). Residu asam muramat dihubungkan dengan

peptida pendek, yang susunannya bervariasi menurut spesies bakteri. Pada

beberapa spesies, residu L-lisin digantikan oleh asam diaminopimelat, suatu asam

amino yang di alam hanya terdapat pada dinding sel prokariotik (Jawetz et al.

1996). Asam D-amino juga merupakan bagian khas dari dinding sel prokariotik.

Rantai peptida pada peptidoglikan dihubungkan menyilang antara rangka-rangka

dasar polisakarida yang sejajar seperti terlihat pada Gambar 2.3b. Peptidoglikan

yang terbentuk karena adanya ikatan silang, yang terdiri atas rantai peptida

pentaglisin, menghubungkan a-karboksil residu D-alanin ujung dari satu rantai

dengan kelompok e-amino dari L-lisin rantai berikutnya (De Jounge et al. 1996).

a

b

21

Struktur dinding sel bakteri Gram positif berbeda dengan dinding sel Gram

negatif (Gambar 2.4). Pada bakteri Gram positif dinding sel mengandung 90%

peptidoglikan serta lapisan tipis asam teikoat dan asam teikuronat yang bermuatan

negatif. Pada bakteri Gram negatif, pada lapisan di luar dinding sel ada yang

mengandung 5-10% peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein,

lipopolisakarida dan lipoprotein. Lapisan ini merupakan lapisan lipid kedua, yang

disebut lapisan lipopolisakarida (LPS). Lapisan ini tidak tersusun semata-mata

oleh fosfolipid saja, seperti yang terdapat pada membran sitoplasma, tetapi juga

mengandung polisakarida dan protein (Madigan 2003).

Gram positif Gram negatif

Gambar 2.4 Struktur Dinding Sel Bakteri Gram Positif dan Gram Neg atif (Moat et al. 2002)

Sebagian besar dinding sel bakteri Gram positif mengandung sejumlah

besar asam teikoat yang dapat merupakan 50% dari bobot kering dinding sel.

Selain itu, mengandung protein M yang merupakan molekul panjang bersama

dengan lipoteikoat membentuk mikrofibril yang memudahkan pelekatan (Madigan

et al. 2003). Dinding sel bakteri Gram negatif mengandung tiga polimer yang

terletak di luar lapisan peptidoglikan: lipoprotein, porin matriks dan

lipopolisakarida. Lipopolisakarida dinding sel Gram negatif terdiri atas suatu lipid

kompleks yang disebut Lipid A. Lipid A terdiri atas suatu rantai satuan disakarida

glukosamin yang dihubungkan dengan ikatan pirofosfat, tempat melekat sejumlah

asam lemak berantai panjang.

Lipoprotein Porin

Flagela

Asam lipoteikoat

Hook Protein M Lipopolisakarida

Membran Luar Lipid A

Lapisan Peptidoglikan

Membran Sitoplasma

Fosfolipid

Membran Protein

Rotor Flagela

Gel Periplasma

Ikatan Peptida

22

LPS, sangat beracun dinamakan endotoksin yang terikat kuat pada

permukaan sel bakteri Gram negatif dan hanya dilepaskan bila sel mengalami

lisis. Bila LPS dipecah menjadi lipid A dan polisakarida, semua sifat racun

terdapat pada lipid A. Sebaliknya, polisakarida merupakan antigen permukaan

utama sel dan disebut antigen O. LPS terdiri dari antigen O, inti bagian luar

(N-asetilglukosamin, glukosa dan galaktosa) dan inti bagian dalam (heptosa dan

ketodeoksioktonat). Bakteri Gram negatif memiliki lapisan tambahan pada

dinding sel yang disebut membran luar (Gambar 2.5) (Madigan et al. 2003).

Membran tersebut terdiri dari lapisan lipopolisakarida (LPS) yang terikat satu

sama lain dengan kation divalent Ca++ dan Mg++ (Murray et al. 1998). Membran

luar berfungsi sebagai penghalang masuknya senyawa-senyawa yang tidak

diperlukan sel (bakteriosin, enzim dan senyawa hidrofobik) (Alakomi et al. 2000).

Gambar 2.5 Struktur Membran Luar Bakteri Gram Negatif (Madigan et al. 2003)

Asam-asam organik seperti etilen diamin tetraacetic acid (EDTA), asam

sitrat, asam malat, asam tartarat, asam laktat (Gao et al. 1999; Stratford 2000) dan

asam klorida (Alakomi et al. 2000) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram

negatif dengan mengkelat kation bivalen Ca++ dan Mg++. Terlepasnya kation-

Lipopolisakarida

Lipoprotein

Membran Luar

Periplasma

Membran Sitoplasma

Sitoplasma Protein

Fosfolipid

Miristatdeoksioktonat

Peptidoglikan

Lipid A

Ketodeoksioktonat

Inti Bagian Luar

Porin

Antigen O

N-asetil glukosamin

Glukosa Galaktosa

Heptosa Inti Bagian

Dalam

23

kation tersebut dari membran luar akan memudahkan masuknya senyawa

antibakteri ke dalam sel (Stratford 2000). Mekanisme kerja antibakteri dari

komponen fenolik diantaranya dapat bereaksi dengan komponen fosfolipid dari

membran sel (P. aeruginosa ), sehingga menyebabkan peningkatan status

permeabilitas sel membran atau dapat menyebabkan perubahan dalam komponen

asam lemak dan kandungan fosfolipid, dan selanjutnya dapat menyebabkan

kekacauan pada sistem membran sel (Nychas 1995).

Membran sel yang mengalami kebocoran parsial atau gangguan fungsi

permeabilitas tidak menyebabkan kematian sel mikroba, tetapi diduga hanya

memperlambat proses metabolik dalam sel mikroba sehingga hanya menghambat

pertumbuhan sel. Minyak atsiri dapat menghambat enzim yang terlibat pada

produksi energi dan pembentukan komponen struktural sehingga pembentukan

dinding sel bakteri terganggu. Alisin pada bawang diketahui dapat menghambat

enzim yang mempunyai peranan utama dalam metabolisme baik enzim yang

mempunyai gugus S-H maupun beberapa yang tidak mempunyai gugus S-H

(Conner 1993). Enzim sulfhidril yang dapat dihambat oleh alisin adalah protein

yang mempunyai komponen –SO-S tetapi bukan dari kelompok yang mempunyai

komponen –SO-, S-S atau –S-. Penghambatan terhadap enzim tersebut disebabkan

oleh oksidasi gugus tiol menjadi disulfhidril pada sisi alosterik enzim, yaitu pada

gugus sistein. Selain itu diketahui bahwa alisin mengganggu aliran elektron dalam

sistem reduktase disulfhidril dan menghambat fungsi reduktase dengan

mengoksidasi gugus sulfhidril dalam dinding sel, sehingga pembentukan dinding

sel tidak sempurna pada proses pembelahan sel (Nychas 1995).

Dalam upaya untuk mencapai sasaran, senyawa antibakteri dapat

menembus LPS dari dinding sel tersebut. Molekul-molekul yang bersifat

hidrofilik lebih mudah melewati LPS dibandingkan dengan yang hidrofobik. Pada

bakteri Gram positif, tidak ada lapisan LPS, sehingga fungsi penghalangnya tidak

ada dan molekul senyawa antibakteri yang bersifat hidrofilik maupun yang

hidrofobik dapat melewatinya (Best 1999). Pada bakteri Gram negatif terdapat sisi

hidrofilik yaitu karboksil, asam amino dan hidroksil (Gorman 1991).

Penghambatan komponen antibakteri adalah kemampuan suatu senyawa

antibakteri untuk mempengaruhi dinding sel mikroba (Ultee et al. 1998).

24

Mekanisme ini dapat disebabkan oleh adanya akumulasi komponen lipofilat yang

terdapat pada dinding sel atau membran sel, sehingga menyebabkan perubahan

komposisi penyusun dinding sel. Terjadinya akumulasi senyawa antibakteri

dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosias i. Pada konsentrasi rendah molekul-

molekul fenol yang terdapat pada minyak thyme kebanyakan berbentuk tidak

terdisosiasi, lebih hidrofobik, dapat mengikat daerah hidrofobik membran protein,

dan dapat melarut baik pada fase lipid dari membran bakteri. Dengan adanya

mekanisme ini dapat dinyatakan bahwa semakin banyak bentuk tidak terdisosiasi,

maka senyawa antibakteri semakin efektif daya antibakterinya. Pada Gambar 2.6

dapat dilihat mekanisme penghambatan bakteri oleh beberapa senyawa

antibakteri.

Gambar 2.6 Mekanisme Penghambatan Bakteri Oleh Beberapa Senyawa

Antibakteri (Madigan et al. 2003)

Beberapa senyawa kimia dan antibakteri seperti EDTA, fenol,

formaldehid, kationik dan alkohol dapat mengganggu dan menghambat sistem

metabolisme sel. Target penghambatan senyawa-senyawa antibakteri tersebut

berbeda-beda pada setiap sel bakteri.

Konsentrasi tinggi: - Hg2+ - Fenol - Klorheksidin

Sistem transpor elektron

Heksaklorofan

Klorheksidin

Fenol

Sitoplasma

Dinding sel Membran Sitoplasma

Karbanilid Salisilanilid Fenol dan bisfenol Paraben Asam lipofilat lemah

Proton motive force

Akridin Klorheksidin

Alkohol

Bahan Kationik

EDTA

Proses Transport

Paraben 2-pheniletanol

Hg2 + Fenol

Asam lipofilat lemah

Komponen sitoplasma, K+, Bahan 260 nm, Ribosa

DNA -COOH Group

Koagulasi -NH2 Group

-SH Group

-SH Group

Membran ATPase

Formaldehid

Hg2+

Formaldehid

25

Antibiotik yang telah diketahui dapat menghambat pembentukan dinding

sel adalah fosfomisin. Senyawa ini dapat bergabung dengan senyawa penyusun

dinding sel yang lain karena mempunyai analog struktur dengan fosfoenolpiruvat.

Fosfomisin berikatan secara enzimatik dengan fosfoenolpiruvat yang

mengakibatkan penghambatan sintesis asam muramat (Salyers dan Whitt 1994).

Selain itu, antibiotik penisilin, cefalosporin, carbapenem dan monobaktam

membunuh bakteri dengan menghambat sintesis peptidoglikan pada reaksi

transpeptidasi yang membentuk ikatan silang rantai samping peptida dari

kerangka peptidoglikan polisakarida (Salyers dan Whitt 1994). Lisozim dapat

memecah ikatan antara N-asetilglukosamin dan N-asetilmuramat. Bakteri Gram

positif lebih sensitif terhadap lisozim dibandingkan dengan bakteri Gram negatif,

karena bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tebal dari

bakteri Gram negatif

Target penghambatan senyawa antibiotik penisilin G terutama terhadap

reseptor Penicillin Binding Proteins (PBPs), diantaranya terhadap enzim

transpeptidase. Enzim ini berperan sebagai katalis pada saat biosintesis

peptidoglikan (Lewis et al. 2004). Tahap awal sintesis dinding peptidoglikan

terjadi dalam sel, meliputi sintesis disakarida-pentapeptida, yang terdiri dari dua

gula amino, yaitu N-asetil glukosamin (G) dan N-asetil-asam muramik (M) dan

pentapeptida primer, yang terdiri dari L-ala-D-glut-L-lys-D-ala-D-ala. Tahap awal

dan tahap akhir dari biosintesis peptidoglikan ini dapat dihambat oleh antibiotik

penisilin G. Proses ini menyangkut kerja enzim transpeptidase yang bertugas

untuk melepaskan satu D-ala dari subunit peptida dalam proses pembentukan

rantai-rantai peptida (ikatan silang). Mekanisme kerja senyawa antibiotik penisilin

G adalah menghambat sintesis dinding sel bakteri, yakni dengan menghambat

kerja enzim transpeptidase (Gambar 2.7). Penisilin G mirip dengan D-ala dan

dapat berperan sebagai substrat yang menempati sisi aktif serin dari enzim

transpeptidase.

Ikatan yang terjadi antara penisilin G dan enzim transpeptidase merupakan

ikatan kovalen yang bersifat irreversibel. Jika subunit peptida tidak terintegrasi

dengan polimer peptida yang telah terbentuk, maka akan dapat memicu terjadinya

aktivitas enzim autolitik yang tidak normal pada sel perifer dinding sel. Enzim

26

autolitik sebenarnya secara normal termasuk dalam proses biosintesis dinding sel

bakteri. Enzim tersebut bertugas untuk membuat patahan tertentu pada

peptidoglikan yang telah terbentuk agar subunit peptida baru dapat ditambahkan

pada titik-titik pertumbuhan dinding sel.

Ikatan peptida D-ala-D-ala

D-ala D-ala

G H CH3 O H CH3

M L-ala D-glu DAP N C C N C COOH

H H

Transpeptidase

(dihambat penisilin G) NH3

DAP D-glu L-ala M

D-ala G

D-ala D-ala

G H CH3 O H NH3

M L-ala D-glu DAP N C C N DAP D-glu L-ala M

H D-ala G

H CH3

+ D-ala N C COOH

H H

Gambar 2.7 Mekanisme Kerja Antibiotik Penisilin G terhadap Enzim

Transpeptidase (Murray et al.1998)

Pada saat aktivitas transpeptidase yang normal dihambat oleh senyawa

antibiotik penisilin G, inhibitor atau regulator normal dari sifat enzim autolitik

hilang, sehingga enzim tersebut tidak mampu mengendalikan aktivitasnya dan

membuat patahan lebih banyak pada peptidoglikan yang terbentuk. Akibatnya

dinding sel tersebut terdegradasi. Selanjutnya karena tekanan sitoplasma yang

hipertonik terhadap lingkungan, membran sitoplasma hancur kemudian terjadi

kebocoran sel dan diikuti oleh kematian sel bakteri (Murray et al.1998; Lin et al.

2000).

27

Untuk pertumbuhan, sel bakteri perlu mensintesis berbagai protein.

Sintesis protein berlangsung di dalam ribosom, dengan bantuan mRNA dan

tRNA. Pada bakteri, ribosom terdiri atas dua sub unit yang berdasarkan konstanta

sedimentasi dinyatakan sebagai ribosom 30S dan 50S. Untuk berfungsi pada

sintesis protein, kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA

menjadi ribosom 70S. Salah satu penghambatan sintesis protein yaitu dengan

antibiotik streptomisin (Gambar 2.8). Antibiotik streptomisin ini berikatan dengan

komponen ribosom 30S dan menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh

tRNA pada saat sintesis protein. Akibatnya akan terbentuk protein yang abnormal

dan nonfungsional bagi sel bakteri.

Gambar 2.8 Mekanisme Kerja Antibotik pada Sel Bakteri (Murray et al. 1998)

Mengganggu Permeabilitas Membran Sel

Komponen bioaktif dapat menyerang membran sitoplasma dan

mempengaruhi integritasnya. Kerusakan pada membran ini mengakibatkan

Metabolisme asam folat

Ruang periplasma: ß-laktamase

aminoglikosida enzim modifikasi

Sulfonamida

Trimetoprim

Sintesis protein (menghambat 50S)

kloramfenikol kladomisin

Sintesis protein (menghambat 30S)

tetrasiklin, spektinomisin, streptomisin, gentamisin,

Sintesis dinding sel: sikloserin penisilin

vankomisin teikoplasin basitrasin

sepalosporin monobaktam karbapenam

PABA

Sintesis protein: (tRNA)

mupirosin

kloramfenikol transasetilase

Membran sel: polimiksin

DNA gyrase quinolon

DNA-RNA polimerase: rifampin

Dinding sel

Ribosom

28

peningkatan permeabilitas dan terjadi kebocoran sel, yang diikuti dengan

keluarnya materi intraseluler. Mekanisme antimikroba minyak atsiri (karvakrol,

sitral, dan geraniol) dan fenolik adalah mengganggu lapisan fosfolipid dari

membran sel yang menyebabkan peningkatan permeabilitas dan kehilangan unsur

pokok penyusun sel (Kim et al. 1995). Reaksi antara komponen membran

fosfolipid dengan minyak atsiri atau senyawa fenolik mengakibatkan perubahan

komposisi asam lemak dan fosfolipid dengan minyak atsiri atau senyawa fenolik

mengakibatkan perubahan nyata pada komposisi asam lemak dan kandungan

fosfolipid membran, yang diikuti dengan pembengkakan sel. Selanjutnya terjadi

kerusakan membran sitoplasma dan mengakibatkan keluarnya kandungan

intraseluler sebanyak 50% Na-glutamat-3,4 14C dan 12% NaH232PO4 dari E. coli.

Adanya bahan yang terkandung dalam sel menunjukkan pertahanan permeabilitas

lemah atau rusak, yang selanjutnya menghambat ikatan ATP-ase pada membran.

Sel bakteri dikelilingi oleh suatu struktur kaku yang disebut dinding sel,

yang melindungi membran protoplasma, baik osmotik maupun mekanik. Oleh

karena itu setiap zat yang mampu merusak dinding sel atau mencegah sintesisnya,

akan menyebabkan terbentuknya sel-sel yang peka terhadap tekanan osmotik.

Tekanan osmotik dalam sel akan menyebabkan terjadinya lisis, yang merupakan

dasar efek bakterisidal pada bakteri yang peka (Setiabudy dan Gan 1995).

Komponen membran sel atau membran sitoplasma terdiri dari fosfolipid

dan protein. Fosfolipid membentuk fase dua lapisan nonpolar kontinyu (lipid

bilayer). Nutrien, ion dan air yang diperlukan oleh sel harus melewati membran

sel yang bersifat permeabilitas selektif. Molekul-molekul dan ion-ion yang akan

diekskresikan harus melewati membran tersebut (Armstrong 1995). Membran

sitoplasma merupakan tempat berlangsungnya respirasi karena enzim-enzim yang

terlibat dalam respirasi terdapat dalam membran tersebut (Fardiaz 1989).

Membran sel (selaput sel) mempunyai barrier osmotik untuk difusi bebas

diantara lingkungan luar dan lingkungan dalam sel. Membran sitoplasma

melakukan fungsi pengangkutan aktif sehingga dapat mengendalikan komponen

internal sel. Bila integritas fungsi membran sitoplasma terganggu, makromolekul

dan ion akan lolos dari sel, sehingga terjadi kerusakan atau kematian sel.

29

Beberapa senyawa antibakteri dapat merusak satu atau lebih fungsi

tersebut dan menyebabkan gangguan utama pada kelangsungan hidup sel. Aksi

senyawa antibakteri yang memiliki sasaran utama membran sel tersebut tidak

tergantung pada fase pertumbuhan sel, dan dengan segera memulai aksinya ketika

sel dan antibakteri saling kontak. Aktivitas antibakter i dari ekstrak polar biji

picung segar dengan konsentrasi 60% terhadap sferoplas meningkat 77.8%

dibandingkan dengan sel utuh Salmonella Typhimurium (Nuraida et al. 1999).

Penggunaan enzim lisozim bertujuan untuk menghilangkan dinding sel bakteri,

sehingga yang tersisa adalah membran sitoplasma yang rapuh dan dapat

menyebabkan senyawa-senyawa antibakteri berpenetrasi masuk ke dalam sel.

Kebocoran sel bakteri dapat disebabkan karena rusaknya ikatan hidrofobik

komponen penyusun membran sel seperti protein, fosfolipid serta larutnya

komponen-komponen yang berikatan secara hidrofilik. Hal ini berakibat

meningkatnya permeabilitas membran sel, dan memungkinkan masuknya

senyawa-senyawa fenol dan ion-ion organik dalam sel, serta keluarnya substansi

sel seperti protein dan asam nukleat yang berakibat kematian sel (Ingram 1981).

Beberapa senyawa antibakteri seperti alilisotiosianat (Lin et al. 2000),

butylated hydroxyanisole (BHA) (Degre dan Sylvestre 1983), butylated

hydroxytoluena (BHT), asam p-kumarat dan asam kafeat (Nychas 1995) juga

dapat merusak membran sel dan menyebabkan kebocoran metabolit seluler.

Gangguan pada membran sel mengakibatkan terganggunya proses-proses

metabolisme dalam membran sel, seperti penyerapan nutrien, produksi energi dan

transpor elektron (Nychas 1995).

Antibiotik peptida nisin yang dihasilkan oleh beberapa galur Lactococcus

lactis (Adams dan Smid 2003) dapat membunuh bakteri spesies lain melalui

reaksi dengan fosfolipid membran sitoplasma. Antibiotik tersebut berinteraksi

dengan membran sitoplasma melalui ikatan elektrostatik dengan fosfolipid

membentuk pori pada membran sitoplasma. Ion-ion, asam amino dan ATP dapat

dengan mudah keluar melalui pori, mengakibatkan rusaknya proton motive force

(PMF) transmembran serta mengakibatkan kematian sel (Adams dan Smid 2003;

Ray dan Miller 2003).

30

Menghambat Sintesis Asam Nukleat dan Protein

Sintesis protein adalah pembentukan rantai polipeptida oleh asam-asam

amino melalui ikatan peptida (Prindle 1983). Proses sintesis tersebut terdiri atas

beberapa tahap seperti: inis iasi, penggabungan komplek asam-asam amino,

pembentukan ikatan peptida, translokasi dan terminasi. Beberapa senyawa

antibakteri mempunyai komponen bioaktif yang dapat menghambat sintesis

protein bakteri. Komponen bioaktif tersebut bereaksi dengan komponen sel

ribosom 50S yang akan membentuk kompleks pada tahap inisiasi (tahap awal

sintesis protein), sehingga menstimulasi pembacaan yang salah. Selanjutnya

terjadi penyimpangan dalam ribosom, yang mengakibatkan terjadinya sintesis

protein, dilanjutkan dengan pasangan yang tidak tepat dan akhirnya mengganggu

pembentukan protein.

Umumnya prinsip yang terjadi pada perubahan germinasi endospora

meliputi suatu tahap inisiasi RNA, sintesis protein dan membran. Adanya

senyawa fenolik dari minyak zaitun seperti klorokresol dapat mendenaturasi

enzim dan menghambat penggunaan l-alanin dan asam amino lain oleh enzim

subtilopeptidase. Penghambatan terhadap penggunaan asam amino tersebut

mengakibatkan sintesis protein yang diperlukan pada proses germinasi juga

terhambat (Nychas 1995).

Sintesis protein merupakan hasil akhir dari proses transkripsi (sintesis

asam ribonukleat, tergantung DNA) dan proses translasi (sintesis protein

tergantung RNA). Suatu komponen senyawa antibakteri yang menghambat salah

satu dari kedua proses tersebut akan menghambat sintesis protein (Best 1999).

Menurut Kim et al. (1995), komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan

asam nukleat (DNA dan RNA), sehingga transfer informasi genetik akan

terganggu karena komponen ini menghambat aktivitas enzim RNA polimerase

dan DNA polimerase, yang selanjutnya akan menginaktivasi atau merusak materi

genetik dan mengganggu proses pembelahan sel untuk pembiakan. Bunduki et al.

(1995) menyatakan bahwa terjadinya kerusakan sel bakteri selain ditandai dengan

berkurangnya aktivitas metabolisme yang menyebabkan terganggunya

pertumbuhan bakteri tersebut, juga ditandai adanya kebocoran protein (sebagai

senyawa pembangun struktur inti sel) keluar sel atau medium di sekitarnya.

31

Menghambat Enzim-Enzim Metabolik

Enzim yang berperan dalam metabolisme dan pertumbuhan sel mikroba

dapat dihambat aktivitasnya oleh komponen antibakteri yang berakibat

terganggunya aktivitas maupun pertumbuhan mikroba. Konsentrasi antibakteri

yang tinggi dapat juga menyebabkan koagulasi enzim. Beberapa gangguan

aktivitas enzim dapat juga terjadi pada saat mikroba mensintesis asam

dihidrofolat dari p-aminobenzoat. Pada proses sintesis p-aminobenzoat dapat

terjadi penghambatan karena adanya sulfonamida yang akan menghambat enzim

dihidropteroat (Brown 1962).

Coral et al. (1988) melaporkan bahwa komponen bioaktif dapat merusak

sistem metabolisme di dalam sel dengan cara menghambat sintesis protein bakteri

dan menghambat kerja enzim intraseluller. Selain itu Kim et al. (1995),

menemukan bahwa dengan terpengaruhnya sistem enzim akan mempengaruhi

produksi energi penyusun sel dan sintesis komponen secara struktural. Senyawa

fenol dapat bereaksi dengan enzim dehidrogenase, sehingga mengakibatkan

hilangnya aktivitas enzim tersebut (Fuller 1991).

Komponen antibakteri dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh

mikroorganisme melalui inaktivasi enzim-enzim metaboliknya. Senyawa

antibakteri sulfit, nitrit dan asam benzoat dapat menginaktivasi berbagai enzim

metabolik bakteri. Nitrit dapat menghambat sistem enzim fosfat dehidrogenase,

sehingga mengakibatkan reduksi ATP dan ekskresi piruvat dalam bakteri

S. aureus (Friedman et al. 2004b). Sulfit dapat berikatan dengan glutation dari

berbagai enzim membentuk tiosulfonat. Reaksi in i dapat menginaktifkan enzim-

enzim yang memiliki ikatan disulfida (Davidson 1997). Asam benzoat dapat

menghambat aktivitas a-ketoglutarat dehidrogenase dan suksinat dehidrogenase

sehingga menghambat konversi a-ketoglutarat menjadi suksinil Co-A dan suksinat

menjadi fumarat. Senyawa tersebut dapat juga menghambat aktivitas enzim

6-fosfofruktokinase yang terlibat dalam oksidasi glukosa (Ogbadu 2000).

Senyawa bioaktif isotiosianat dilaporkan dapat mengoksidasi ikatan

disulfida enzim (Delaquis dan Sholberg 1997), dan dapat berikatan dengan rantai

samping sistein pada enzim-enzim yang memiliki gugus sulfhidril (Ekstrand

1994).