FOTO 3 x 4...iv PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2020 PRAKATA Buku petunjuk praktikum mikrobiologi...

FOTO

3 x 4

ii

PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2020

BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

DAN

LAPORAN AKHIR MIKROBIOLOGI

DISUSUN OLEH:

TIM PENGAJAR MIKROBIOLOGI

NAMA MAHASISWA :

NIM :

KELOMPOK :

GELOMBANG :

KELAS :

KATA PENGANTAR

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2020

iii


DOSEN PENGAMPU

Prof. Dr. Ir. Lilik Eka Radiati, MS., IPU.

Prof. Dr. Ir. Hendrawan Soetanto, M.Rur.Sc.

Prof. Dr. Ir. Djalal Rosyidi, MS., IPU.

Dr. Ir. Osfar Sjofjan, M.Sc., IPU.

Dr.drh.Rositawati, MS

Dr. Ir. Marjuki, M.Sc

Dr.Ir. Siti Nurul Kamaliyah, MP.

Dr. Ir. Mustakim, MP., IPM.

Dr.Ir. Abdul Manab, S.Pt., MP.

Dr. Herly Evanuarini, S.Pt., MP.

Dr. Dedes Amertaningtyas, S.Pt., MP.

Dr. Khotibul Umam A, S.Pt., Msi.

Ria Dewi Andriani, S.Pt., MP, M.Sc.

Mulia Winirsya Apriliani, S.Pt., MP.

Premy Puspitawati R, S.Pt., MP.

ASISTEN PENDAMPING

M. Bahrul Ulum

Nadila Pratiwi

Agryanti Kirana Angkat

Yudhistira Aryo Pamuncak

iv


PRAKATA

Buku petunjuk praktikum mikrobiologi dasar disusun dengan tujuan

untuk membantu mahasiswa S1 dalam mempelajari mikrobiologi. Materi

yang ada dalam buku penuntun ini telah disesuaikan dengan kebutuhan

Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya.

Buku ini merupakan gambaran dari perkuliahan yang telah diberikan

secara umum, serta melengkapi pedoman teknis yang ditetapkan oleh

pengajar yang bersangkutan. Sedangkan untuk penguasaan lebih lanjut

diharapakan dapat mempelajari dari literatur yang ada.

Penyusun mengharapakan agar dengan buku ini mahasiswa dapat

lebih mudah menggunakan peralatan, bahan kimia yang diperlukan dan

melakukan pelatihan.

Malang, Oktober 2020

Penyusun

v


DAFTAR ISI

Praktikum Mikrobiologi Dasar ....................................................... 1

1.Pendahuluan ............................................................................. 1

1.1. Tujuan Dan Kegunaan Praktikum ................................. 1

1.2. Tata Tertib Praktikum .................................................... 1

2. Ciri Praktek Mikrobiologi...................................................... 3

Pelatihan 1 Peralatan Praktikum Mikrobiologi ................................. 5

Pelatihan 2 Sterilisasi ...................................................................... 16

Pelatihan 3 Cara Pembuatan Media ................................................ 23

Pelatihan 4 Isolasi Dan Pembiakan Mikroba .................................. 30

Pelatihan 5Identifikasi Sel dan Koloni Bakteri ............................... 42

Pelatihan 6Identifikasi Sel dan Koloni Khamir .............................. 46

Pelatihan 7Identifikasi Sel dan Koloni Kapang .............................. 50

Pelatihan 8 Menentukan Jumlah Mikroorganisme (Enumerasi) ..... 56

Pelatihan 9 Pewarnaan Gram .......................................................... 64

Pelatihan 10 Protozoa Rumen ......................................................... 68

Pelatihan 11 Slide Culture (Teknik Biakan Kaca Objek) ............... 70

Tabel Hasil Pengamatan ................................................................. 72

Format Laporan Akhir Praktikum Mikrobiologi 2020.................... 82


1

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

1.Pendahuluan

1.1. Tujuan dan kegunaan praktikum

Dalam textbook dibicarakan teori dan pengetahuan tentang

kehidupan dan aktifitas mikroba. Dalam praktikum dipelajari:

a. Konsep dasar mikrobiologi

b. Teknik dan prosedur mikrobiologi

Secara singkat dapat dikatakan bahwa textbook lebih dititikberatkan pada

knowledge (pengetahuan) sedangkan praktikum pada skill (ketrampilan)

dari mikrobiologi. Dasar dari praktikum adalah fakta – fakta dan dasar

penilaiannya (analisisinya) adalah kemampuan menginterpretasikan fakta –

fakta itu. Skill banyak dipakai pada riset, pekerjaan di pabrik, pengendalian

mutu dan aplikasi lainnya. Riset – riset yang mendalam terhadap suatau hal

akan menghasilkan teori – teori baru.

Dengan demikian dalam perkembangan ilmu pengetahuan dan

aplikasinya terdapat perkembangan berdasarkan hubungan causeand effect

antara teori (knowledge, science) dan praktek (skill, teknologi). Sehingga

dapat disimpulkan kedua hal tersebut sama penting bobotnya, oleh karena

itu praktikum perlu diperhatikan dan dilaksanakan dengan sungguh –

sungguh dan perlu dikembangkan mengikuti kebutuhan dan kepentingan

kita serta kemajuan teknologi.

1.2. Tata tertib praktikum

a. Praktikan wajib mengikuti serangkaian praktikum(briefing,

asistensi, praktikum, hingga UAP). Bagi praktikan yang tidak


2

melaksanakan serangkaian praktikum/berbuat curang maka

dinyatakan tidak lulus untuk praktikum mikrobiologi.

b. Praktikan wajib mengikuti rangkaian praktikum 3 hari berturut-

turut. Ijin absen hanya diperkenankan apabila sakit dan bukti

dengan surat keterangan dokter serta izin khusus yang berkaitan

dengan almamater dan dibuktikan oleh surat izin dari wakil

dekan 3 \ wakil rektor 3. Tidak dilaksanakan praktikum dan ujian

susulan kecuali permohonan absensi yang disetujui.

c. Pergantian gelombang praktikum paling lambat 3 hari sebelum

praktikum dimulai dan mencari pengganti serta sepengetahuan

asisten pendamping kelas atas persetujuan koordinator / wakil

koordinator asisten praktikum mikrobiologi.

d. Praktikan diwajibkan untuk datang 10 menit sebelum praktikum

dimulai. Sanksi keterlambatan akan diberikan ketika terlambat.

e. Praktikan diwajibkan mengerjakan tiket masuk yang telah

ditetapkan.

f. Praktikan diwajibkan mengenakan jas laboratorium saat berada di

laboratorium mikrobiologi dan yang berambut Panjang WAJIB

untuk diikat

g. Praktikan memakai sepatu dan membawa peralatan

individu/kelompok yang telah ditetapkan selama praktikum.

Sanksi pelanggaran akan diberikan.

h. Apabila praktikan merusakkan atau menghilangkan alat

laboratorium pada saat praktikum berlangsung, maka praktikan

wajib mengganti dengan barang dan merek yang sama dan bukan

uang maksimal 3 hari setelah kejadian. Apabila tidak mengganti

sampai pada waktu yang ditentukan maka nilai tidak keluar.


3

i. Praktikan dilarang bermain handphone saat praktikum,

dokumentasi menggunakan kamera.

j. Praktikan wajib membawa obat pribadi bagi yang sakit saat

berlangsungnya praktikum.

k. Praktikan dilarang berbicara kotor atau sejenisnya.

l. Praktikan dilarang membuang sampah sembarangan.

m. Praktikan dilarang membuat gaduh saat berlangsungnya

praktikum

n. Praktikan dilarang makan, minum, di dalam laboratorium

o. Praktikan dilarang merokok saat praktikum berlangsung

p. Praktikan dilarang mencontek praktikan lain saat pre-test maupun

post-test bila diketahui maka dianggap nilai 0.

q. Praktikan dilarang mengenakan perhiasan yang berlebihan dan

wajib menjaga keamanan barang pribadi.

r. Isi laporan tidak diperbolehkan sama dengan sesama praktikan

s. Praktikan wajib menaati peraturan dalam serangkaian kegiatan

praktikum mikrobiologi.

t. Aturan-aturan atau tata tertib yang belum tercantum akan

diputuskan kemudian.

2. Ciri praktikum mikrobiologi

Ciri utama praktikum mikrobiologi baik di laboratorium maupun di

lapangan ada 3 hal, yaitu :

- Praktek perlu dilakukan dalam keadaan bebas kontaminasi.

- Biaya relatif lebih mahal jika dibandingkan dengan bidang ilmu lain.

- Data pengamatan seringkali tidak dapat diperoleh seketika, melainkan

masih menunggu sampai beberapa hari karena perlu diinkubasikan

dahulu agar respon percobaan terlihat.


4

Guna memperoleh suasana bebas kontaminasi, maka dikenal suatu

prosedur baku yang perlu dilakukan pada setiap percobaan yaitu teknik

aseptik. Teknik aseptik adalah semua usaha dan prosedur yang perlu

dilakukan untuk mencegah terjadinya kontaminasi pada suatu macam

praktek (seperti pelatihan, percobaan, penelitian, dan sebagainya) dibidang

mikrobiologi.Prosedur yang termasuk dalam teknik aseptik antara lain:

- Sterilisasi media dan alat yang akan digunakan.

- Pengambilan sampel secara aseptik

- Penggunaan api bunsen dalam inokulasi mikroba.

- Pembersihan meja praktek dengan alkohol 70%.

- Ruang praktek yang bebas kontaminasi, contohnya pemakaian laminar

air flow.

- Dan lain sebagainya.


5

PELATIHAN 1

PERALATAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

1.1. Mikroskop

Mikrobiologi adalah suatu ilmu untuk mengenal makhluk hidup

yang mempunyai ukuran sedemikian kecil, sehingga setiap individu sel

tidak mungkin dapat terlihat oleh mata. Oleh karena itu, ilmu mengenai

mikrobiologi dimulai dengan penemuan suatu alat yakni mikroskop yang

dapat digunakan untuk melihat sel mikroba melalui suatu sistem lensa

pembesar. Mikroskop dibedakan menjadi beberapa jenis, tetapi mekanisme

kerja setiap mikroskop memiliki prinsip yang sama, yaitu terdiri dari suatu

sistem optikal atau sistem pembesaran dan sistem iluminasi yang

menyebabkan terlihatnya obyek. Bagian – bagian mikroskop dapat dilihat

pada Gambar 1a :

Gambar 1a. Mikroskop cahaya


6

Gambar 1b. Mikroskop cahaya

• Jenis mikroskop

1. Mikroskop cahaya

2. Mikroskop darkfield

3. Mikroskop fase kontras

4. Mikroskop fluorescence

5. Mikroskop electron

6. Mikroskop confocal

• Tujuan

Mengenal bagian-bagian mikroskop dan cara penggunaannya.

• Alat dan bahan

1. Mikroskop 2. Slide kultur (kultur awetan)

• Prosedur penggunaan mikroskop

1. Periksalah bagian dan kebersihan mikroskop sebelum

menggunakannya. Bila ternyata ada bagian yang rusak, laporkan

pada staf pengajar atau laboran yang bertugas. Bila ada bagian

yang kotor, bersihkan terlebih dulu. Gunakan kertas lensa untuk


7

membersihkan lensa obyektif dan gunakan kain untuk

membersihkan bagian-bagian yang lain.

2. Biasakan melihat mikroskop dengan kedua mata terbuka. Bila

terasa susah, tutuplah salah satu mata dengan tangan tetapi

biarkan kedua mata terbuka. Letakkan object glass diatas meja

benda (stage) kemudian jepit dengan penjepit specimen. Jika meja

benda belum turun, turunkan dengan sekrup kasar. Cari bagian

dari objek glass yang terdapat preparat ulas (dicari dan dipastikan

memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan

horizontal.

3. Cahaya yang paling baik adalah cahaya matahari yang tidak

langsung. Bila keadaan tidak memungkinkan dapat digunakan

cahaya lampu. Cermin datar digunakan untuk melengkapi

penerangan apabila menggunakan cahaya matahari, sedangkan

cermin cekung digunakan untuk memusatkan cahaya lampu pada

specimen yang dilihat.

4. Kondensor dan difragma digunakan untuk mengatur intensitas dan

sudut penerangan. Melalui pengalaman, seseorang dapat belajar

untuk mengatur jumlah cahaya optimum.

5. Cara memfokuskan bayangan specimen, gunakanlah lensa

obyektif dengan pembesaran paling kecil terlebih dahulu (4x)

selanjutnya gunakan pembesaran yang dikehendaki (10x, 40x atau

97x).Memfokuskan suatu specimen dapat dilakukan dengan

mengatur jaraknya, lensa harus jauh dengan spesimen dengan

maksud menghindari kerusakan lensa obyektif. Berikut adalah

tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa

objektif jika fokus telah didapatkan


8

Perbesaranobjektif 4X 10X 40X 60X

Jarak A(mm) 29 6,3 0,53 0,29

Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu,

misal 40x, dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x, maka

meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir

bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat

sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa

objektif (lihat tabel diatas).

6. Penggunaan lensa obyektif dengan pembesaran 97X diperlukan

minyak emersi pada specimen, tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes.

Putarlah hingga lensa menyentuh minyak emersi dan lihatlah

melalui okuler specimen yang akan diamati. Semakin kecil nilai

daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa untuk

memisahkan dua titik yang berdekatan pada preparat sehingga

struktur benda terlihat lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat

dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya

yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek.

7. Membersihkan minyak emersi pada lensa. Setelah menggunakan

mikroskop hendaknya dibersihkan menggunakan kertas lensa dan

kemudian bersihkan lagi dengan kertas lensa yang mengandung

xylol dan selanjutnya bersihkan lagi dengan kertas lensa.

8. Laporkan apa yang saudara lakukan. Ukuran specimen yang

diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran lensa

okuler dengan lensa objektif. Misal: Okuler (10x) x Objektif (40x)

= 400x

9.


9

1.2. Inkubator (Incubator)

Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba

pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu

dan pengatur waktu. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus

B5042 misalnya adalah 10-70˚C. Inkubator ada 2 jenis, inkubator aerob

untuk memeram mikroba aerob, sedangkan untuk memeram mikroba

anaerob menggunakan inkubator anaerob.

1.3. Hot plate stirrer dan Stirrer bar

Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk

menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang

terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat

proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet hot

plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu

menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat lambat

sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 4250C.

1.4. Colony counter

Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang

tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawan karena adanya kaca

pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/kuadran

yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni yang

sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan petri dapat ditandai dan

dihitung otomatis dan dapat di-reset.

1.5. Biological Safety Cabinet

Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar

Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis

karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara


10

sehingga menjadi steril dan aplikasi sinar ultraviolet (UV) beberapa

jam sebelum digunakan.

1.6. Mikropipet (Micropippete) dan Tip

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume

cukup kecil, biasanya kurang dari 1000μl. Banyak pilihan kapasitas

dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume

pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1μl sampai 20μl,

atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu

pilihan volume (fixedvolume pipette) misalnya mikropipet 5μl. Dalam

penggunaanmikropipet diperlukan tip.Cara penggunaan:

1. Sebelum digunakan,Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali

untuk memastikan lancarnya mikropipet.

2. Masukkan tip bersih ke dalam ujung mikropipet (nozzle).

3. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama (first stop), jangan

ditekan lebih ke dalam lagi.

4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4mm.

5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari

Thumb Knob maka cairan akan masuk ke tip.

6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.

7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua (second stop) atau

tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari

ujung tip.

8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan

ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau

menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar.


11

1.7. Cawan Petri (Petrie Dish)

Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)

mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan

cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam

berbagai macam ukuran, diameter cawan biasa yakni 15cm yang dapat

menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter

9cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10ml.

1.8. Pipet Ukur (Measuring Pippete)

Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan

volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas

pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1ml, 5ml dan 10ml. Cara

penggunaan:

1. Cairan disedot menggunakan pipet ukur dengan bantuan filler

sampai volume yang diinginkan.

2. Volume yang dipindahkan dikeluarkan mengikuti skala (dilihat

bahwa skala harus sejajar denganmeniskus cekung cairan) dengan

menyamakan tekanan fillerdan tekanan udara sekitar.

1.9. Pipet tetes (Pasteur Pippete)

Fungsinya sama dengan pipet ukur, namun volume yang

dipindahkan tidak diketahui. Salah satu penerapannya adalah dalam

menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media, penambahan

reagen pada uji biokimia, dll.

1.10. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)

Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji

biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi

media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas,

tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang


12

dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut

fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring

(slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang

kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara

tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media

yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena dapat memperbesar

resiko kontaminasi. Untuk alasan efisiensi, media yang ditambahkan

berkisar 10-12 ml tiap tabung.

1.11. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan. Labu

Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan

bahan-bahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba

dalam kultur cair, dll. Terdapat beberapa pilihan labu erlenmeyer

berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50

ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.

1.12. Gelas ukur (Graduated Cylinder)

Berguna untuk mengukur volume suatu cairan. Seperti labu

erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala

volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume

tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan.

1.13. Batang L (L Rod)

Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar

bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini

juga disebut spreader.

1.14. Mortar dan Pestle / Mortar dan penumbuk (Pastle)

Alat ini digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi

cuplikan (misal daging, roti atau tanah) sebelum diproses lebih lanjut.


13

1.15. Beaker Glass

Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi.

Digunakan untuk preparasimedia, menampung akuades, dll.

1.16. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)

Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi steril

adalah pembakar bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran

udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan

kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Pada

sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk

memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas).

Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol.

1.17. Glass Beads

Glass Beads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk

meratakansuspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas

permukaan agar dan digoyang merata. Glass beads digunakan pada

teknik spread plate yang fungsinya sama dengan batang L atau

Spreader.

1.18. Tabung Durham

Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun

ukurannya lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas

yang terbentuk akibat metabolisme pada bakteri yang diujikan.

Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam

sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).

1.19. Jarum Inokulum

Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk

ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat

dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena


14

panas. Bentuk ujung jarum yakni lingkaran (loop) dan disebut ose atau

inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut

inoculating needle/transfer needle. Inoculating loop cocok untuk

melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle

cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab

inoculating). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat

membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.

1.20. Pinset

Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk

mengambil benda dengan menjepit, misalnya saat memindahkan

cakram antibiotik.

1.21. pH Indikator Universal

Berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini

sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media

berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH indikator

dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna

dicocokkan dengan skala warna acuan.

1.22. Pipet Filler / Rubber Bulb

Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang

pada pangkal pipet ukur. Karet sebagai bahan filler merupakan karet

yang resisten bahan kimia. Filler memiliki 3 saluran yang masing-

masing saluran memiliki katup. Katup yang bersimbol A (aspirate)

berguna untuk mengeluarkan udara dari gelembung. S (suction)

merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari ujung pipet akan

tersedot ke atas. Kemudian katup E (exhaust) berfungsi untuk

mengeluarkan cairan dari pipet ukur.


15

1.23. Waterbath

Merupakan wadah yang berisi air yang fungsi utamanya

mempertahkan suhu air dengan pemanasan pada kisaran suhu 30°-

100° C. Pada saat saklar diposisi “on” maka arus listrik masuk ke

heater. Heater yang mendapat arus listrik akan menghasilkan panas

pada waterbath, suhu akan naik dan stabil sampai pada suhu yang telah

diatur di pengatur suhu.

1.24. Vortex Mixer

Vortex mixer digunakan untuk homogenisasi atau menyeragamkan

cairan, untuk pekerjaan di laboratorium mikrobiologi, vortex mixer

memiliki kegunaan spesifik yaitu untuk memisahkan mikroorganisme

yang masih dalam bentuk koloni memisah menjadi individu. Jumlah

cairan yang dapat dihomogenkan vortex mixer terbilang kecil, karena

hanya mampu menampung wadah kecil seperti tabung reaksi, tabung

sentrifuse, atau ependorf.


16

PELATIHAN 2

STERILISASI

Penyelidikan suatu spesies mikroba selalu didasarkan atas biakan

spesies tersebut. Oleh karena itu, untuk dapat memisahkan mikroba yang

satu dengan lainnya atau untuk memelihara suatu biakan murni perlu

digunakan alat dan media yang steril. Sterilisasi adalah suatu usaha untuk

membebaskan bahan atau alat dari semua bentuk kehidupan terutama

mikroba. Praktek sterilisasi alat-alat dan media dapat dikerjakan secara:

1. Mekanik: melakukan penyaringan terhadap bahan, contoh: alat

filter porselin, asbes, dll. Semua mikroba dapat dipisahkan kecuali

virus. Oleh karena itu setelah disaring perlu dipanaskan.

2. Kimia: menggunakan disinfektan.

3. Fisik: menggunakan panas, sinar ultraviolet, dll.

Apabila melakukan sterilisasi dengan menggunakan zat kimia

maka erat kaitannya dengan mikrobiosida dan mikrobiostatik. Mikrobiosida

ialah suatu zat yang dapat membunuh mikroba antara lain; bakterisida,

virusida dan fungisida. Mikrobiostatik adalah suatu zat yang dapat

menghambat pertumbuhan mikroba antara lain: virustatik, fungistatik dan

bakteristatik.

Mekanisme Sterilisasi

1. Denaturasi, koagulasi dan hidrolisis, dengan cara ini dapat terjadi

penggumpalan protein mikroba akibat pemanasan, sehingga

kemungkinan besar protein dapat mengalami denaturasi.

2. Oksidasi, beberapa disinfektan dan mikrobiosida seperti KMnO4 dan

HCl mempunyai daya mengoksidasi yang sangat besar, dimana


17

senyawa-senyawa ini dapat membebaskan oksigen dan senyawa-

senyawa lain. Senyawa ini dapat mengoksidasi organik sel.

3. Perubahan permeabilitas dinding sel. Beberapa zat kimia dapat

mempengaruhi permeabilitas didnding sel dan membrane sitoplasma

sehingga dapat menimbulkan gangguan pada metabolisme mikroba.

4. Pembentukan ikatan kimia nonspesifik dan spesifik. Zat kimia seperti

formaldehid, fenol, dan iodine dapat menyebabkan ikatan-ikatan

langsung dengan bagian sel tertentu sehingga dapat menyebabkan

denaturasi atau koagulasi protoplasma, dan hal yang demikian dapat

mengakibatkan mikroba mati.

Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi antara lain:

1. Macam mikroba

2. Bentuk pertumbuhan mikroba

3. Waktu sterilisasi

4. Temperatur

5. Kepekaan mikroba atau ketahanan mikroba

6. pH medium

Sterilisasi alat-alat gelas dan logam

Mensterilisasi alat-alat gelas seperti tabung biakan (culture tube),

cawan petri, dllsebagai perlakuan pendahuluan dapat dicuci dengan air

bersih atau direndam dalam larutan bikromat selama 12 jam dengan susunan

kimia sbb: 60 g kalsium bikarbonat, 60 cc asam sulfat pekat dan 1000 cc

aquades. Kemudian dapat dilakukan sterilisasi dengan cara:

1. Sterilisasi dengan udara kering

Pada cara ini, alat-alat tersebut dimasukkan kedalam oven

(Gambar 2) dengan suhu 170-180oC selama 2 jam, maka alat tersebut

sudah steril. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari


18

kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi. Perlu diperhatikan bahwa

lama sterilisasi tergantung jumlah alat dan ketahanan alat terhadap

panas.

Gambar 2.Oven sterilisator

2. Sterilisasi menggunakan uap panas bertekanan

Pada cara ini alat-alat gelas atau media dimasukkan kedalam

autoklaf (Gambar 3). Cara ini merupakan cara yang paling baik, jika

dibanding dengan cara yang lain. Cara yang demikian ini juga dapat

digunakan pada semua jenis alat yang tidak rusak karena

pemanasan dan tekanan tinggi serta dapat pula digunakan untuk

sterilisasi media. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi

atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121ºC (250ºF). Jadi tekanan

yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2

(15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang

dilakukan biasanya 15 menit untuk 121ºC.

Cara penggunaan autoklaf

1. Dipastikan autoklaf dalam keadaan mati, bersih dan siap

digunakan.

2. Dibuka penutup autoklaf

3. Dibuka/diangkat sarangan


19

4. Dituang aquadest hingga menutupi heater (posisi aquadest

sedikit dibawah sarangan).

5. Diletakkan kembali sarangan

6. Diletakkan alat dan bahan yang akan disterilisasi di atas

sarangan (alat dan bahan yang mempunyai luas permukaan

besar ada di bawah).

7. Ditutup autoklaf dan dikunci

8. Dirapatkan katup uap manual

9. Diatur pengatur tekanan 1,5 sampai 2 ATM

10. Dihubungkan kabel ke arus listrik

11. Diatur waktu 15-20 menit

12. Ditekan tombol on, lampu akan menyala berwarna merah

13. Autoklaf akan melakukan sterilisasi

14. Lampu indikator akan menyala berwarna merah dan hijau

15. Proses sterilisasi selesai, indikator lampu berwarna merah

16. Diangkat pengatur tekanan, dimatikan autoklaf.

17. Dilonggarkan katup uap manual, ditunggu suhunya turun

(agak dingin).

18. Dibuka pengunci autoklaf, dibuka tutup autoklaf,

19. Diambil alat dan bahan yang sudah disterilisasi.

20. Dibuang aquadest melalui kran.


20

Gambar 3. Autoklaf

3. Sterilisasi dengan pemijaran

Pemijaran dengan membakar alat pada api secara

langsung, cara ini dilakukan hanya untuk sterilisasi jarum platina,

ose, pinset, batang L dsb (Gambar 4).

Gambar 4. Sterilisasi dengan pemijaran

4. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa

desinfektan antara lain alkohol.


21

Sterilisasi Media

Ada beberapa macam cara sterilisasi media yang pada

dasarnyatergantung pada faktor-faktor sbb:

1.Jenis media 2.Bentuk media (padat/cair)

Sterilisasi media dengan cara:

1. Sterilisasi dengan penyaringan

Bahan yang peka terhadap panas misalnya serum, enzim, antibiotik

dan toxin dapat dilakukan sterilisasi dengan menggunakan filter

bakteri (Gambar 5). Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan

suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45

mikron) sehingga mikroba tertahan pada filter.

2. Menggunakan uap bertekanan

Tujuan : Sterilisasi peralatan untuk membebaskan suatu peralatan dan

bahan dari semua bentuk kehidupan terutama mikroba.

Bahan dan Alat

1. Pipet 3. Cawan Petri 5. Kapas

2. Kertas kraf 4. Benang kasur 6. Autoklaf

Prosedur

1. Bersihkan alat yang akan disteril.

2. Berikan kapas pada pangkal pipet, jangan terlalu dekat.

3. Kemudian beberapa pipet dijadikan satu dan pada bagian ujung

diberibantalan kapas dan selanjutnya dibungkus dengan kertas kraf

kemudian dilipat sedemikian rupa.

4. Cawan petri diletakkan terbalik diatas kertas kraf kemudian dilipat

sedemikian rupa.

5. Masukkan kedalam autoklaf.

6. Pertahankan pada suhu 1210C selama 15 menit.


22

7. Setelah sterilisasi selesai, matikanlah aliran listrik dan biarkan suhu

dan tekanan turun.

8. Alat siap dipakai untuk praktikum selanjutnya.

Gambar 5. Sterilisasi dengan penyaringan


23

PELATIHAN 3

CARA PEMBUATAN MEDIA

Media dapat didefinisikan sebagai bahan yang terdiri atas

campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain untuk

menumbuhkan mikroba, media dapat digunakan pula untuk isolasi,

memperbanyak, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan jumlah populasi

mikroba (Gambar 6).

Gambar 6. Media pertumbuhan mikroorganisme

Syarat-syarat pembuatan media :

1. Media harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan

oleh mikroba.

2. Media harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan

dan pH yang sesuai.

3. Media tidak mengandung zat-zat penghambat.

4. Media harus steril.

Klasifikasi Media berdasar :

1. Susunan kimia

a. Media organik: media yang tersusun dari bahan-bahan organik.

b. Media anorganik: media yang tersusun dari bahan-bahan

anorganik.


24

c. Media sintetik: media yang susunannya dapat diketahui dengan

pasti atau dipakai untuk mengetahui kebutuhan makan atau unsur

dari mikroba.

d. Media nonsintetik: media yang susunan kimianya tidak dapat

diketahui dengan sempurna atau banyak dipakai untuk

menumbuhkan atau mempelajari taksonomi mikroba.

2. Komposisi

a. Medium sintesis: media yang komposisi zat kimianya diketahui

jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac

Conkey Agar.

b. Medium semi sintesis: media yang sebagian komposisinya

diketahui secara pasti, misalnya PDA (Potato Dextrose Agar) yang

mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan

ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang

komposisi senyawa penyusunnya. PCA (Plate Count Agar) dibuat

dengan melarutkan semua bahan casein enzymic hydrolisate, yeast

extract, dextrose, agar.

c. Medium non sintesis: media yang dibuat dengan komposisi yang

tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak

dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart

Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Konsistensi

a. Media cair (liquid media): media berbentuk cair yang tidak

mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB

(Lactose Broth).


25

b. Media padat (solid media): media berbentuk padat yang berupa

media organik atau alamiah misalnya media wortel, kentang atau

anorganik (silica gel).

c. Media padat yang dapat dicairkan (semi solid media): media yang

dalam keadaan panas berbentuk cair kemudian menjadi padat bila

dingin, hal tersebut dikarenakan mengandung agar-agar atau

gelatin sehingga setelah dingin media menjadi padat.

4. Fungsi

a. Media diperkaya (enriched medium): suatu media yang ditambah

zat-zat tertentu seperti darah, serum, kuning telur,atau tumbuh-

tumbuhan sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba

heterotrof tertentu. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk

mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak

hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak,

tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood

Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.

b. Media selektif (selective medium): suatu media yang diberi zat

kimia tertentu yang bersifat selektif untuk menekan pertumbuhan

mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang

diinginkan, seperti kristal violet yang menghambat pertumbuhan

bakteri gram positif tetapi tidak menghambat bakteri gram negatif.

Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk

merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan

yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4%

digunakan untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran

terhadap garam.


26

c. Media diferensial (diferential medium): suatu media yang diberi zat

kimia tertentu untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya

berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial

atau perubahan tertentu yang mengakibatkan dapat diketahuinya

tipe–tipe mikrobanya seperti media agar darah yang dapat

membedakan bakteri hemolitik dan non – hemolitik, TSIA (Triple

Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria

berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna

media di sekeliling koloni.

d. Media untuk perhitungan jumlah mikroba media spesifik:

digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan.

Contoh: media untuk menghitung jumlah bakteri actinomycetes,

dsb.

e. Media khusus: suatu media untuk menentukan tipe pertumbuhan

dan kemampuan mikroba untuk mengadakan suatu perubahan

kimia tertentu.

f. Media pengencer: media untuk mengencerkan bahan supaya

memperoleh penghitungan jumlah mikroba yang tepat.

g. Media untuk isolasi: mengandung semua senyawa esensial untuk

pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

h. Media untuk peremajaan kultur: media umum atau spesifik yang

digunakan untuk peremajaan kultur.

i. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik: media ini

digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme

suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium yang

digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat

sebagai sumber karbon.


27

j. Media untuk karakterisasi bakteri: media yang digunakan untuk

mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang

indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya

perubahankimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,

Arginine Agar.

Bahan-bahan media pertumbuhan

1. Bahan dasar

a. Air (H2O) sebagai pelarut.

b. Agar (dari rumput laut) sebagai pemadat media. Agar sulit

didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair

pada suhu 450C.

c. Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin

adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen.

Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu

menguraikannya dibanding agar.

d. Silica gel sebagai pemadat media bagi mikroorganisme autotrof

obligatyang mengandung natrium silikat.

2. Nutrisi atau zat makanan

Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk

metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P dan

unsur mikro seperti Fe, Mg serta unsur pelikan (trace element).

a. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa

organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad

heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari

karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.


28

b. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa

bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber

N anorganik seperti urea.

c. Vitamin-vitamin.

3. Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium

dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa)

ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam

organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk

menghambat pertumbuhan mikroba nontarget atau kontaminan.

4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media

a. Agar.

Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk

dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah

sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh

Fraw&Walther Hesse untuk membuat media. Agar ditambahkan

dalam media dengan konsentrasi 1-2%. Jika dicampur dengan air

dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diaduk

dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi

yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada

pH yang asam.

b. Peptone.

Peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti

otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.

Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara

memperolehnya.


29

c. Meat extract.

Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa,

plasenta dan daging sapi.

d. Yeast extract.

Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat

alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap &

vitamin (B complex).

e. Karbohidrat.

Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam

amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya

digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa,

manitol, dll.

Tujuan: pembuatan media pengencer dan media agar cawan.

Bahan dan alat:

1. Plate count agar 6. Cawan Petri 11. Gelas ukur

2. Kertas kraf 7. Karet gelang 12. Tabung reaksi

3. Autoklaf 8. Aquades 13. Neraca

4. Gelas pengaduk 9. Erlenmeyer 14. Pipet

5. Kapas 10. Pepton 15. Bunsen

Prosedur pembuatan media pengencer :

1. Timbanglah 1 gram peptone. Larutkan ke dalam 1 L aquades, yang

berarti diperoleh larutan peptone 0,1 %.

2. Larutan peptone tersebut dibagi menjadi beberapa bagian:

a. 45 ml larutan ke dalam erlenmeyer 150 ml.

b. 9 ml larutan ke dalm tabung reaksi 1,2.

c. 9 ml larutan ke dalm tabung reaksi 3,4.

d. 9 ml larutan ke dalam tabung reaksi 5, 6.


30

3. Tutuplah masing-masing tabung reaksi yang berisi media dengan

kapas sampai rapat, kemudian bungkus dengan kertas kraf dan

selanjutnya di sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC

selama 15 menit dan tekanan 2 atm atau 20 menit dan tekanan 1,5 atm.

4. Larutan pepton steril didinginkan terlebih dulu sebelum digunakan.

Prosedur pembuatan media agar cawan :

1. Timbanglah Plate count agar sesuai kebutuhan.

2. PCA sebanyak 3 gram dilarutkan ke dalam 150 ml aquades dalam

erlenmeyer 250 ml.

3. Aduk sampai homogen lalu panaskan sampai larutan menjadi bening

dengan hotplate stirer.

4. Tutuplah dengan penutup rapat dan bungkus dengan kertas kraf pada

bagian yang disumbat.

5. Sterilkan dengan autoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit dan

tekanan 2 atm atau 20 menit dan tekanan 1,5 atm

6. PCA steril dalam erlenmeyer diletakkan di waterbath yang sudah

diatur shuhunya antara 50-60°C

7. Media yang berada dalam erlenmeyer, dalam keadaan panas tuangkan

ke dalam Cawan Petri masing-masing ± 10 ml.

8. Media dibiarkan hingga dingin dan membentuk gel, lalu dibalik. Siap

digunakan praktikum lebih lanjut.


31

PELATIHAN 4

ISOLASI DAN PEMBIAKAN MIKROBA

Pada keadaan sebenarnya (di alam bebas) dapat dikatakan tidak ada

bakteri atau mikroba lainnya yang hidup sendiri terlepas dari spesies lain.

Begitu pula dalam penangkapan mikroba akan diperoleh piaraan campuran

(Gambar 8).

Isolasi secara definitive adalah memisahkan suatu mikroba dari

lingkungannya, kemudian ditumbuhkan sebagai biakan murni pada media

buatan dengan metode aseptis (Gambar 8).

Saran-saran kerja aseptis :

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam

tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang

memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih

dahulu.

2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu

lalu dibakar.

3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin

dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk

mempercepat transfer panas yang terjadi.

4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan

ke bagian api.

5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen

tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api

maka semakin terjamin kondisi aseptisnya.


32

Gambar 7. Pembiakan mikroba secara aseptis

Gambar 8. Pemisahan koloni mikroba melalui pengenceran


33

Tujuan : Isolasi mikroba dari suatu bahan.

Bahan dan alat

1.Susu sapi 4. Media agar cawan

2.Daging 5. Aquades

3.Media peptone pengencer 6. Inkubator

Teknik Pengambilan Sampel

Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan

sampel. Berikut merupakan contoh prosedur pengambilan sampel.

1. Sampel daging

Sample daging/karkas segar dan beku dapat berupa sample

permukaan(swab/ulas, excision/tusuk, rinse technique/diiris) dan

sample jaringan(diiris pada jaringan yang diperlukan dengan

kedalaman 0.5 - 1 cm daripermukaan jaringan atau mengambil seluruh

jaringan). Sample permukaan digunakan untuk pengujian

mikrobiologis, sedangkan sample jaringan digunakan untuk pengujian

residu dan mikrobiologis.

2. Sampel susu sapi

Sampel diambil sekita 2-5 ml setiap puting dimulai dari puting

yang terdekat, tabung sampel posisi miring 35-600 dan tidak

menyentuh permukaan puting atau tangan. Sampel Susu harus

dipertahankan kondisinya dalam keadaan dingin dengan cara

menyimpan di lemari pendingin (refrigerator/freezer) sebelum diuji,

untuk sampel cair seperti susu dikocok terlebih dahulu agar homogen.


34

Teknik Preparasi Suspensi

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades

steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau

melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah

penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel:

a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada

sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit

dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah

meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton

bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud

kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika

cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan

semisal pepton water.

b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang

menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relative

berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan

prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades

dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil

dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang

terdapat dalam beaker glass.

c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat

ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada

dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke

dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll.

Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama

adalah 1 : 9 (ω/ν). Untuk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi.


35

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

1. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau

mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan

besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada

perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1:9

untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga

pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganismedari

pengenceran sebelumnya.

Cara Kerja :

a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung

pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi

suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung

pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika

memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.

Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya.

b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian

dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok

dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen.

Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir

dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur

yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat

pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru.

Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan

cairan dari sumber yang sama.


36

Gambar 9. Pengenceran Suspensi Bakteri

Teknik Penanaman

1. Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran

bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran

mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni

tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

a. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan

suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.

Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukanadalah sebagai

berikut:

• Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur

kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.

• Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot

alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian

didinginkan dan ditunggu beberapa detik.


37

• Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada

permukaan supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan

lebih efektif bila cawan ikut diputar.

• Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat

menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

b. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45˚C) untuk

dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu

kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan

menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar

saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga

terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada

yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak

mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan

adalah sebagai berikut :

• Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam

dan media padat yang masih cair (>45˚C)

• Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan

kosong

• Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar

cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media,

kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate

dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk

menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate

membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya

sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.


38

Gambar 10. Metode Penanaman Pour Plate dan Spread Plate

2. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau

meremajakan kultur ke dalam medium baru.

a. Goresan Sinambung (Sinambung Streak)

• Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara

kontinyu sampai setengah permukaan agar.

• Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan

sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan

untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk

peremajaan ke cawan atau medium baru.


39

b. Goresan T (T Streak)

• Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker

• Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag

• Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian

lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar).

Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna

• Lakukan hal yang sama pada daerah 3

c. Goresan Kuadran (QuadrantStreak)

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan

yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan

awal sehingga masih mengandung banyak sel

mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau

disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit

dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

d. Goresan Radian

• Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan

• Pijarkan ose dan dinginkan kembali

• Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai

dari bagian pinggir lempengan

• Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas

goresan sebelumnya

Prosedur Isolasi dan pembiakan mikroba (Gambar 11)

1. Persiapan sampel susu

a. Sampel susu tanpa pengenceran (suspensi sc)

b. Sampel sebanyak 1 ml susu tanpa pengenceran masukkan ke

dalam larutan pengencer 1, dikocok (suspensi A)


40

c. Ambillah sebanyak 1 ml suspensi A, masukkan ke dalam larutan

pengencer 2, dikocok (suspensi B)

Gambar 11. Metode pengenceran sampel

2. Persiapan sampel daging

a. Ambillah sebanyak 5 gram daging, masukkan ke dalam larutan

pengencer 1 (45 ml) (suspensi 2a).

b. Ambillah 1 ml suspensi 2a, masukkan ke dalam larutan

pengencer 2 (9ml) (suspensi 2b).

c. Ambillah 1 ml suspensi 2b, masukkan ke dalam larutan

pengencer 3 (9ml) (suspensi 2c)

3. Pemindahan dengan kawat inokulasi

Ujung kawat yang terbuat dari platina, baik yang lurus maupun yang

berkolong (diameter ± 3mm), terlebih dulu dipijarkan, kemudian

setelah dingin disentuhkan pada koloni atau bahan yang hendak

diketahui mikroba yang dikandung. Gunakan sampel susu tanpa

pengenceran, sedangkan sampel daging gunakan sampel suspensi 2a.

Mulut tabung tempat suspensi dipanaskan setelah sumbatnya diambil.

Setelah pengambilan inokulum, mulut tabung disumbat kembali.


41

Ujung kawat yang membawa inokulum digesekkan pada media agar

cawan yang sudah tersedia (Gambar 12, 13 dan 14).

Gambar 12. Metode isolasi mikroba dengan streak

Goresan T Goresan Kuadran

Goresan Radian Goresan Sinambung

Gambar 13. Contoh beberapa jenis streak


42

Gambar 14. Hasil isolasi mikroba menggunakan metode streak plate

4. Pemindahan dengan pipet

Suspensi yang mengandung mikroba pada suspensi 1b, 1c, 2a, 2b

diambil sebanyak 0,1 ml dengan pipet. Kemudian dicampur dengan

media yang dalam keadaan cair (Gambar 13). Selanjutnya dikenal

dengan istilah biakan adukan. Bisa juga penanaman dilakukan atau

pemindahan suspensi dengan pipet pada media agar yang sudah

memadat, yang dikenal “Streak Plate culture” (biakan gores).

Gambar 15. Inokulasi ke media di cawan petri

5. Inkubasilah media yang sudah mengandung inokulum pada suhu

370C selama 24 jam.

6. Amati sifat koloni yang terbentuk


43

PELATIHAN 5

IDENTIFIKASI SEL DAN KOLONI BAKTERI

A. SEL BAKTERI

Sifat sel bakteri berbeda-beda (menurut strain dan spesiesnya) bila

dideteksi di bawah mikroskop dengan menggunakan preparat hidup dan

preparat mati (awetan atau slide).

Tujuan :

Untuk mengenal sifat-sifat sel bakteri baik pathogen maupun non pathogen

yang terlihat dengan menggunakan mikroskop.

Bahan dan alat:

1. Koleksi kultur bakteri (hati-hati jika memakai bakteri pathogen).

2. Koleksi slide bakteri.

3. Metilen biru dan Gliserin (jika diperlukan).

4. Ose, bunsen, mikroskop, object glass, dan cover glass.

Prosedur :

• Preparat Hidup

1. Buat preparat basah (wet mount preparation) dari koleksi kultur

bakteri.

2. Periksa melalui mikroskop dengan pembesaran rendah (okuler

10x) dulu, lalu dengan pembesaran sedang (okuler 40x).

3. Amatilah sifat-sifat sel bakteri yang tampak di bawah mikroskop.

4. Gambar dengan jelas!

• Preparat Mati(Awetan)

1. Sediakan slide bakteri dari koleksi yang ada.

2. Periksa dan amati seperti pada prosedur diatas.


44

Pengamatan

Sifat-sifat sel bakteri (Gambar 14) yang perlu diamati dan

dilaporkan adalah:

1. Bentuk sel (kokus, basil, spiral, kokobasil).

2. Susunan sel (diplokokus, tetrad, streptokokus, sarkina, stafilokokus,

diplobasil, streptobasil).

3. Spora (bentuk, posisi, sentral, terminal, spora menyebabkan sel

menggelembung , tidak menggelembung).

4. Gerakan (cepat, lambat).

5. Flagela (dari slide)

6. Ukuran (panjang, lebar, diameter dalam micron)

7. Gambar dan beri keterangan!

a. Bentuk sel bakteri b. Susunan sel bakteri.

Gambar 16. Sifat sel bakteri


45

B. KOLONI BAKTERI

Sel bakteri tumbuh normal pada medium standar. Setiap sel akan

tumbuh menjadi suatu koloni. Sifat-sifat koloni bakteri berbeda-beda

menurut strain dan spesiesnya. Kegiatan ini merupakan tindakan pertama

kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk

tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang

diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri

koloninya.

Tujuan :

Untuk memperoleh ketrampilan menumbuhkan koloni bakteri pada

medium standar (Nutrient Agar atau Plate Count Agar), serta mempelajari

sifat-sifat koloni bakteri.

Bahan dan alat :

1. Koloni kultur bakteri.

2. Nutrient Agardan Plate Count Agar.

3. Kaca pembesar, ose, bunsen burner, stereomikroskop.

Prosedur :

1. Buat media cawan Nutrient Agar dan sterilkan memakai otoklaf pada

temperatur 1210C selama 15 menit.

2. Transfer dengan cara streaking kultur bakteri dari koleksi ke cawan

Nutrient Agar, lalu inkubasikan pada temperatur 300C selama 3 hari.

3. Amati terbentuknya koloni dan sifat-sifat koloni tersebut pada hari ke

3 inkubasi.


46

Pengamatan

Sifat-sifat koloni bakteri (Gambar 17) yang perlu diamati dan

dilaporkan adalah:

1. Bentuk koloni (bulat, tidak teratur, berfilamen, berakar, radial).

2. Tepi koloni (rata, berduri, berakar, bergelombang, berambut, dan

sebagainya).

3. Elevasi koloni (cembung, lempeng, pipih, gunung, bukit).

4. Kilap koloni (cemerlang, opak).

5. Tembus cahaya (transparan, translusen).

6. Permukaan (halus, kasar)

7. Warna (putih, krem, kuning, hitam, abu-abu, merah, hijau, coklat, dan

sebagainya).

8. Gambar dan beri keterangan! Koloni masing-masing spesies bakteri

dari koleksi yang ada yaitu :

a. Pandangan atas serta ukurannya (mm atau cm).

b. Pandangan samping.

Gambar 17. Morfologi koloni bakteri


47

PELATIHAN 6

IDENTIFIKASI SEL DAN KOLONI KHAMIR

21. SEL KHAMIR

Sifat sel khamir yang tampak di bawah mikroskop berbeda-beda

(tergantung strain dan spesiesnya) bila dideteksi memakai preparat hidup

dan preparat mati (preparat awetan).

Ciri-ciri khamir:

1. Uniseluler

2.Memiliki sedikit miselium atau miselium semu

3. Bereproduksi dengan tunas

4. Fakultatif anaerob

Contoh : Saccharomyces sp., Candida albicans

Tujuan :

Untuk mengenal sifat-sifat sel khamir yang terlihat dengan menggunakan

mikroskop.

Bahan dan alat :

1. Koleksi kultur khamir(hati-hati jika memakai kultur khamir patogen,

contohnya Candida albicans)

2. Koleksi slide khamir.

3. Metilen biru dan gliserin (bila diperlukan).

4. Ose, bunsen, mikroskop, object glass dan cover glass.

Prosedur :

• Preparat Hidup

1. Buat preparat basah dari koleksi kultur khamir


10x) dulu, lalu dengan pembesaran sedang (okuler 40x).

3. Amatilah sifat-sifat sel bakteri yang tampak di bawah mikroskop



48

• Preparat Slide (mati atau awetan)

1. Sediakan slide khamir dari koleksi yang ada.

2. Periksa dan amati seperti pada prosedur diatas.

Pengamatan

Sifat-sifat sel khamir yang perlu diamati dan dilaporkan adalah:

1. Bentuk sel (bulat, oval, memanjang, limau, buah pir, segitiga, silindris,

batang, dan sebagainya)

2. Kuncup atau bud (unipolar, bipolar, multi lateral)

3. Pseudohifa (terbentuk atau tidak)

4. Spora (terbentukatau tidak, jumlahnya berapa, bentuknya bulat, oval,

bulan sabit, saturnus, topi, dsb.)

5. Gambar dan beri keterangan:

a. Sel khamir b. Kuncup c. Pseudohifa

6. Apakah perbedaan antara sel khamir Saccharomyces dan Candida?

22. KOLONI KHAMIR

Sel khamir (Gambar 18) tumbuh normal pada medium standar.

Setiap sel khamir akan tumbuh menjadi satu koloni. Sifat-sifat koloni

khamir berbeda-beda menurut strain dan spesiesnya.

Gambar 18. Sel khamir

Yeast

• Fungi bersel tunggal

• Adaptasi ke cairan

– Water films

– Jaringan hewanlembab

CandidaSaccharomyces


49

Tujuan :

Untuk memperoleh ketrampilan menumbuhkan koloni khamir

pada medium standar (Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar),

serta mempelajari sifat-sifat koloni khamir.

Bahan dan alat :

1. Koleksi kultur khamir.

2. Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar.

3. Kaca pembesar, ose, bunsen burner, stereomikroskop

Prosedur :

1. Buat media cawan Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar

dan sterilkan memakai autoklaf pada 1150 C selama 10 menit.

2. Transfer dengan cara streaking kultur khamir dari koleksi ke

cawan Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar, lalu

inkubasikan pad temperatur 300C selama 3 hari.

3. Amati terbentuknya koloni dan sifat-sifat koloni tersebut pada

hari ke-3 inkubasi.

Pengamatan

Sifat-sifat koloni khamir (Gambar 19) yang perlu diamati dan

dilaporkan adalah:

1. Bentuk koloni (sirkel, tidak teratur).

2. Tepi koloni (rata, berduri, rhizoid, berombak, berambut, dan

sebagainya).

3. Elevasi koloni (cembung, lempeng, pipih, gunung, bukit).

4. Kilap koloni (cemerlang, opak).


6. Permukaan (halus, kasar)

7. Warna (putih, krem, merah, coklat).


50

8. Gambar dan beri keterangan! Koloni masing-masing spesies

khamir dari koleksi yang diperiksa pada:



Gambar 19. Koloni khamir


51

PELATIHAN 7

IDENTIFIKASI SEL DAN KOLONI KAPANG

A. SEL KAPANG

Sifat sel kapang dibawah mikroskop berbeda-beda (menurut strain

dan spesiesnya) bila dideteksi menggunakan preparat hidup dan preparat

mati (preparat awetan atau slide).

Ciri-ciri kapang:

1.Multiseluler

2.Memiliki banyak miselium (kumpulan hifa)

3. Bereproduksi dengan spora

4. Aerob

Contoh : Rhizopus sp., Aspergilus sp.

Gambar 20. Sel kapang


52

Gambar 21. Hifa

Tujuan :

Untuk mengenal sifat-sifat sel kapang yang terlihat denganmenggunakan

mikroskop.

Bahan dan alat :

1. Koleksi kultur kapang (misalnya Mucor, Rhizopus, Aspergillus,

Penicillium).

2. Koleksi slide kapang.

3. Lactofuchsin dan gliserin (bila diperlukan).

4. Ose, bunsen, mikroskop, object glass, dan cover glass.

Prosedur :

• Preparat Hidup

1. Buat preparat basah dari koleksi kultur kapang.


10x) terlebih dahulu, lalu dengan pembesaran sedang (okuler

40x).

3. Amatilah sifat-sifat sel kapang, hifa dan miseliumnya yang

tampak di bawah mikroskop.

From Medical Microbiology, 1990, Murray, et al., p. 299, Fig. 28-1


53


• Preparat Slide (mati atau awetan)

1. Sediakan slide kapang dari koleksi yang ada.

2. Periksa dan amati bagian vegetatif (sel, hifa, miselium) dan

bagian generatif (spora, askus, basidium dan sebagainya),

sklerotis, klamidiospora.

Pengamatan

Sifat-sifat bagian generatif dan vegetatif kapang yang perlu diamati

dan dilaporkan adalah:

1. Bentuk hifa (ada sekat atau tidak, stolon, rhizoid).

2. Sklerotia, klamidiospora.

3. Spora (sporaspongiospora, konidia, artrospora, oospora, zygospora,

askospora, basidiospora, masing-masing bentuknya).

4. Gambar dan beri keterangan :

a. Skema secara utuh dari bagian vegetatif dan generatif kapang

(Gambar 22) dari genera Mucor, Rhizopus, Aspergillus,

Penicillium, Fusarium, dan sebagainya.

b. Macam-macam kepala spora (spora head) dari Penicillium.

c. Sebutkan perbedaan sifat-sifat bagian generatif dan vegetatif dari

berbagai genera kapang (misalnya Mucor dan sebagainya).

Gambar 22. Skema utuh kapang


54

B. KOLONI KAPANG

Spora, hifa atau miselium kapang akan tumbuh normal pada medium

standar (Gambar 23). Satu spora, sepotong hifa, atau sepotong miselium

akan tumbuh menjadi suatu koloni kapang. Sifat-sifat koloni kapang

berbeda-beda menurut strain dan spesiesnya.

Gambar 23. Pertumbuhan hifa

Gambar 24. Jenis kapang

Hifa

• Tubular

• Dinding dari chitin

• Crosswalls dapat membentuk kompartments ( sel)

• Multinukleus

• Tumbuh di ujung

Modifikasi hifa

Fig 30.2 (don’t worry

about the terms)

Pertumbuhan Hifa

• Hifa tumbuh dari ujungnya

• Miselium = ekstensif, feeding web of hyphae

• Miselia merupakan bagian tubuh fungi yg aktif secara ekologis

Dindningnya rigid Hanya ujung dindning yang plastis dan mulur

Video of time lapse growth in a Zygomycote, Phycomyces

Pertumbuhan Hifa dari spora

• Mycelia have a huge surface area

miselium

Germinasi

spora


55

Tujuan :

Untuk memperoleh keterampilan menumbuhkan koloni kapang pada

medium standar (Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar), serta

mempelajari sifat-sifat koloni dari berbagai spesies kapang.

Bahan dan alat :

1. Koleksi kultur kapang.

2. Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar.

3. Kaca pembesar, ose jarum, bunsen, stereomikroskop.

Prosedur :

1. Buat media cawan Malt Extract Agar atau Potato Dextrose Agar dan

sterilkan memakai autoklaf pada 1150C selama 10 menit.

2. Transfer spora, sepotong hifa, atau sepotong miselium kapang dari

kulturyang tersedia dengan memakai cara aseptik dan memakai jarum.

3. Inkubasikan pada temperatur 300C selama 3 hari.

4. Amati setiap hari dari saat transfer dilakukan.

5. Amati terbentuknya koloni dam sifat-sifat koloni tersebut pada hari ke-

3 inkubasi.

Pengamatan

Sifat-sifat koloni kapang (Gambar 25) yang perlu diamati dan dilaporkan

adalah:

1. Bentuk koloni (sirkel, tidak teratur).

2. Tepi koloni (rata, rhizoid, berambut, dan sebagainya).

3. Elevasi koloni ( cembung, lempeng, pipih, gunung, bukit).

4. Kilap koloni (cemerlang, kusam).


6. Permukaan (beludru, halus, kasar).

7. Berlendir atau tidak.


56

8. Ada titik-titik air atau tidak.

9. Warna (beberapa warna dalam suatu koloni, hijau, hitam, putih,

kuning, coklat muda, coklat tua, merah, orange).

10. Gambar dan beri keterangan! Koloni masing-masing spesies kapang

yang diperiksa pada:



Gambar 25. Koloni kapang


57

PELATIHAN 8

MENENTUKAN JUMLAH MIKROORGANISME

(ENUMERASI)

1. Penghitungan Jumlah Bakteri Hidup (Tidak Langsung)

a.1. Plate Count (hitungan cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel

mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni

setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang

sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan

merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam

suspensi tersebut.

Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel

mikroorganisme karenabeberapa mikroorganisme tertentu cenderung

membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan

istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal

dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari

sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.

Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut :

• Satu koloni dihitung 1 koloni.

• Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.

• Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.

• Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung

2 koloni.

• Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan)

tidah dihitung.

• Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1

koloni.


58

Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml

CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran

Misal: penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10-6 dengan metode

Spread Plate dan Pour Plate.

Spread plate :

Koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 0,1 ml

Fp = 1/10-6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml

SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml= 5x108 CFU’s / ml

Pour plate :

Koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 1 ml

Fp = 1/10-6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml

SP = 1 ml = 5x107 CFU’s / ml

a.1.1. Standard Plate Count (SPC)

Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC

memiliki syarat khusus berdasarkan statistic untuk memperkecil kesalahan

dalam perhitungan. Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan

yang telah ditentukan. Syarat-syaratnya sebagai berikut :

• Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni.

> 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu

Banyak Untuk Dihitung). < 30 = TFTC (Too Few To Count).

• Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka

satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10

(eksponensial), misal 2,3 X 104, bukan 2,34 X 104. Pembulatan

keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih

besar dari lima, misal 2,35 X 104 menjadi 2,4 X 104atau 2,34 X 104

menjadi 2,3 X 104.


59

• Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran, maka

hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan.

• Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka

hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan.

• Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan

tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi

dari jumlah koloni mengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2, maka

jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata. Jika hasil bagi dari

pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang

dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.

• Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo), maka

jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai

jumlah masing-masing setelah diperhitungkan.

a.1.2 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate

Count.

• Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab,

maserasi dan rinse) (jika perlu).

• Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk

pengenceran pertama, selanjutnya diencerkan sampai tingkat

pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu.

• Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA

(Nutrient Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali

tiap pengenceran (duplo). Plating dapat secara Spread Plate atau

Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat digunakan batang L

atau glass beads.

• Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.


60

• Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah

diuraikan di depan.

Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-

bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan

spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat

bervariasi, tergantung kebutuhan. Penghitungan akan lebih mudah bila

memakai Colony Counter. Jika penghitungan sudah selesai, maka cawan

petri beserta media agar dimasukkan plastik tahan panas, kemudian di

destruksi atau sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121°C selama

15 menit.

a.2 Most Probable Number (MPN)

Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan

metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan).

Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri

pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang

merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu

bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora,

memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu

24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung

sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3

tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri.

Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan

pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung

berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media

LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi beef extract

(3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per

liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS


61

(Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar

laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. Berdasar sifat coliform, maka

bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang

dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN

ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap

serinya setelah diinkubasi.

Cara kerja :

• Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung

berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham.

Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar).

• Kocok botol yang berisi air sampel.

• Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing

tabung seri pertama (3 tabung LBDS), secara aseptis.

• Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing

tabung seri kedua (3 tabung LBSS), secara aseptis.

• Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing

tabung seri ketiga (3 tabung LBSS), secara aseptis.

• Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam.

• Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu

hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung

positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu

dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh

jumlah mikroba sebenarnya.

B. Perhitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)

Perhitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis

yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.


62

Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau

Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara cover glass dan alat

ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu

bujur sangkar juga tertentu.

Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu

kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2

mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan

demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang

hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi

volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume

dapat diketahui.

Luas kotak sedang :

= p x l

= 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2

Volume kotak sedang :

= p x l x t

= 0,04 mm2 x 0,1 mm

= 0,004 mm3

Karena 1 ml = 1cm2, maka:

= 0,004 mm3

= 0,000004 cm3

= 4x10-6 ml

Sel/ml = jumlah sel/4x10-6 ml

= (jumlah sel/4) x 106

= jumlah sel x (¼) x 106

= jumlah sel x 2,5 x 105

Kotak sedang :


63

Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105

Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk

Kotak Besar :

Jumlah sel/ml = jumlah sel x 1 x 104

Kotak Kecil :

Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106

Cara kerja (digunakan kotak sedang) :

• Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau

Haemocytometer dengan alkohol 70% lalu keringkan dengan

tissue.

• Letakkan cover glass di atas alat hitung.

• Tambahkan 50 μl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan

cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel

akan menyebar karena daya kapilaritas.

• Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran

air dari efek kapilaritas).

• Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya

pada perbesaran 40x10.

• Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran

atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang

banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan

diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.

Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih

baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan

rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml

dikalikan faktor pengenceran.


64

PELATIHAN 9

PEWARNAAN GRAM

Bakteri dan khamir dapat memberikan reaksi terhadap metode

pewarnaan gram, sedangkan kapang tidak. Prosedur pewarnaan gram pada

umumnya hanya diberlakukan terhadap bakteri saja karena erat

hubungannya dengan prosedur identifikasi. Bakteri gram positif mempunyai

kemampuan menahan zat warna kristal ungu sedangkan bakteri gram

negatif tidak, hal ini disebabkan oleh perbedaan sifat dinding sel bakteri

(Gambar 26 dan 27).

Gambar 26. Morfologi dinding sel bakteri Gram + dan Gram -

Gram +

Gram -

Dinding sel

Membrane sel bag dalam Membran luar

Ribosom

Granula

Dinding sel

NucleoidMembran sel

Kapsul

Flagell

Pili

Gram, C. 1884. Ueber die isolirte

Farbung der Schizomyceten in

SchnittÄund Trockenpraparaten.

Fortschritte der Medicin, Vol. 2,

pages 185-189.

1884: Christian Gram: Publikasi pertama untuk metode pewarnaan Gram)


65

Gambar 27. Struktur dinding sel bakteri Gram + dan Gram -

Tujuan :

Untuk membedakan reaksi gram positif, gram negatif dan gram variabel.

Bahan dan alat :

1. Koleksi kultur bakteri baik yang patogen maupun non patogen.

2. Object glass, ose, bunsen, zat warna kristal ungu/biru, safranin,iodium,

alkohol 95 %, mikroskop, penyangga kaca preparat, kertas hisap.

Prosedur (Gambar 28):

1. Disiapkan alat dan bahan

2. Dipijarkan kawat ose bulat pada bunsen

3. Diambil inokulan bakteri (dari streak plate)

4. Diletakkan di atas obyek glass

5. Dilakukan fiksasi

6. Diberi methilen blue 1 tetes

7. Ditunggu 1 menit

8. Dibilas dengan aquadest

9. Diberi iodine 1 tetes

10. Ditunggu 1 menit


12. Diberi alkohol 95% 1 tetes

Dinding sel


66

13. Ditunggu 30 detik


15. Ditetesi safranin 1 tetes

16. Ditunggu 1 menit


18. Diamati dibawah mikroskop

Gambar 26. Prosedur pewarnaan Gram

Gambar 28. Tata Cara Melakukan Pewarnaan Gram

Pengamatan

Periksa preparat yang telah diwarnai dengan prosedur gram itu

dibawah mikroskop (Gambar 27). Pakai pembesaran rendah. Bila

diperlukan pakai pembesaran sedang.

1. Bakteri gram positif akan tampak dengan warna biru keunguan (blue

purple in colour).

2. Bakteri gram negatif akan tampak dengan warna merah muda (pink

red in colour).

3. Bakteri gram variabel menunjukkan campuran warna biru ungu merah.

Karena sifat ini amat jarang terjadi maka sebaiknya bila didapatkan

pengamatan gram variabel perlu diulang beberapa kali agar yakin.

Perlu diperhatikan bahwa umur kultur yang diperiksa amat

menentukan hasil penilaian pengamatan. Bila umur kultur terlalu tua,

besar kemungkinan diperoleh gram variabel dan ini merupakan

penilaian yang salah.


67

Gambar 29. Hasil pewarnaan Gram

Pewarnaan Differensial

• Pewarnaan Gram

– Crystal violet: pewarnautama

– Iodine: mordant

– Alcohol atau acetone-alcohol: decolourizer

– Safranin: counterstain

– Gram positive: ungu

– Gram negative: merah-pink

Staphylococcus aureus

Escherichia coli


68

PELATIHAN 10

PROTOZOA RUMEN

Mikroba yang berperan dalam proses fermentasi rumen yaitu fungi,

bakteri dan protozoa. Protozoa merupakan salah satu mikroba yang hidup

secara anaerob di dalam rumen dan ikut mempengaruhi proses fermentasi.

Protozoa yang ada dalam rumen ternak ruminansia sebagian besar adalah

ciliata, meskipun ditemukan juga beberapa spesies flagellata yang termasuk

ke dalam kelas mastigofora. Ada 2 grup utama ciliata yaitu Oligotricha dan

Holotricha (Ogimoto dan Imai, 1981). Ciliata ini merupakan non pathogen

dan anaerobic microorganism. Pada kondisi rumen yang normal dapat

dijumpai ciliata sebanyak 105 -106/ml cairan rumen. Dari hasil serangkaian

studi, diperoleh informasi bahwa ciliata diduga mempunyai peranan sebagai

sumber protein dengan keseimbangan kandungan asam amino yang lebih

baik dibandingkan dengan bakteri sebagai pakan ternak ruminansia. Selain

ituciliata atau protozoa juga menelan partikel-partikel pati sehingga

memperlambat terjadinya fermentasi. Guna melangsungkan hidup, ciliata

memakan bakteri sebagai sumber protein untuk tubuhnya (Harison dan

Allan 1980 dalam Jusmaldi 2002)

A. Sistem Reproduksi dan Siklus Hidup Ciliata

Reproduksi pada protozoa dapat terjadi secara aseksual atau seksual.

Reproduksi aseksual ada tiga tipe yaitu pembelahan ganda (biner),

pembelahan multiple (skizogoni) dan tunas (budding). Pembelahan ganda

biasanya terdapat pada flagellata, amoeba dan ciliata. Pada pembelahan

multiple atau skizogoni, inti membelah berulang-ulang, sitoplasma

bergabung mengelilingi setiap inti, kemudian sitoplasma membelah.

Pertunasan adalah sel anak yang kecil secara individu memisahkan dari


69

sisiinduk dan kemudian tumbuh menjadi ukuran penuh. (Levine, 1990

dalam Ismail, 2006).

Reproduksi seksual ada dua tipe yaitu singami dan konjugasi.

Singami adalah persatuan dari dua gamet, sedangkan konjugasi adalah

penggabungan secara temporer dua individu yang berasal darisatu spesies

dengan maksud pertukaran materi inti.

B. Klasifikasi Ciliata

Menurut Hungate (1966) ciliata dapat dibagi menjadi dua kelompok

yaitu Holotricha (cilia ada di sekitar tubuhnya) dan Oligotricha (cilia hanya

ada di sekitar mulut). Kelompok Holotricha memiliki morfologi yang

sederhana meliputi spesies Isotricha dan Daystricha, sebaliknya kelompok

Oligotricha memiliki bentuk yang kompleks meliputi spesies Entodinium,

Epidinium, Diplodinium, dan Ophryoscolex.

Protozoa yang terdapat dalam rumen berasal dari dua famili dan

termasuk ciliata. Famili yang pertama adalah Isotrichidae termasuk dalam

golongan Holotricha, dari golongan ini dikenal dua genus, yaitu Isotricha

dan Dasytricha. Famili yang ke dua adalah Ophryoscolecidae dan termasuk

dalam Oligotrichs. Ophryoscolecidae terdiri dari genus Entodinium,

Eudiplodinium,Diplodinium, Epidinium dan Ophryoscolex. Golongan

Oligotrichs dapat memecah partikel makanan dan dapat memanfaatkan

karbohidrat sederhana maupun yang komplek termasuk selulosa, sedangkan

golongan Holotrichs tidak dapat mencerna partikel makanan maupun

selulosa (Soepraniondo, 1994).


70

Gambar 30. Protozoa Rumen


71

PELATIHAN 11

SLIDE CULTURE (TEKNIK BIAKAN KACA OBJEK)

Tujuan Slide Culture

Mengetahui pertumbuhan mikroorganisme (kapang) pada aspek morfologi

sempurna.

Versi 1 (Versi PDA Padat)

Alat

1. Cawan petri

2. Kertas saring atau kapas

3. Object glass dan cover glass

4. Potato Dextrose Agar (PDA)

5. Kawat ose lurus (batang L)

6. Penyangga

Bahan

1. Hifa tempe (inokulan kapang)

2. Aquades

Prosedur


2. Diletakkan kertas saring di atas cawan petri

3. Diletakkan penyangga di atas kertas saring

4. Diletakkan obyek glass di atas penyangga

5. Diletakkan PDA padat berbentuk kubus (1x1x1 cm) di atas obyek

glass

6. Dipijarkan kawat ose lurus di atas bunsen

7. Diambil koloni kapang dan ditusukkan di keempat sisi PDA

padat

8. Ditutup dengan cover glass

9. Ditetesi kertas saring dengan aquadest hingga lembab

10. Diinkubasi selama 3 x 24 jam

11. Diamati pertumbuhan kapang


72

Versi 2 (Versi PDA Cair)

Alat

1. Cawan petri

2. Kertas saring atau kapas

3. Object glass dan cover glass

4. Potato Dextrose Agar (PDA)

5. Kawat ose bulat

6. Penyangga

Bahan

1. Hifa tempe (inokulan kapang)

2. Aquades

Prosedur


2. Diletakkan kertas saring di atas cawan petrie

3. Diletakkan penyangga di atas kertas saring

4. Diletakkan obyek glass di atas penyangga

5. Diletakkan 1 tetes PDA cair di atas obyek glass

6. Dipijarkan kawat ose bulat diatas bunsen

7. Diambil koloni kapang dan diletakkan di atas PDA cair

8. Ditutup dengan cover glass

9. Ditetesi kertas saring dengan aquadest hingga lembab

10. Diinkubasi selama 3 x 24 jam

11. Diamati pertumbuhan kapang

Gambar 31. Metode Pembuatan Slide Culture (A : padat, B : cair)


73

TABEL HASIL PENGAMATAN PRAKTIKUM

MATERI I

STERILISASI

A. HASIL PENGAMATAN

GAMBAR AUTOKLAF NAMA BAGIAN AUTOKLAF

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

TEKANAN UAP (ATM) :

SUHU (0C) :

WAKTU (MENIT) :


74

MATERI II

CARA PEMBUATAN MEDIA

A. HASIL PENGAMATAN

NAMA MEDIA FUNGSI TAKARAN

(gram/liter)


75

MATERI III

ISOLASI DAN PEMBIAKAN MIKROBA

A. HASIL PENGAMATAN

SAMPEL

METODE ISOLASI

HASIL:

(+) Jelek,

(+ +) Baik,

(+ + +) Sangat Baik

Pour Plate 10-

Pour Plate 10-

Pour Plate 10-

Spread Plate 10-

Spread Plate 10-

Spread Plate 10-

Streak Plate

Agar Tegak Kapang

Agar Tegak Khamir

Agar Tegak Bakteri

Agar Miring Kapang

Agar Miring Khamir


76

MATERI IV

IDENTIFIKASISEL DAN KOLONI BAKTERI

A. BENTUK PERTUMBUHAN PADA AGAR TEGAK

GAMBAR PERTUMBUHAN KOLONI BAKTERI

(AGAR TEGAK)

Bentuk :

B. BENTUK PERTUMBUHAN PADA AGAR CAWAN

KOLONI BAKTERI SIFAT KOLONI GAMBAR

KOLONI

BENTUK KOLONI

TEPI KOLONI

ELEVASI KOLONI

KILAP KOLONI

TEMBUS CAHAYA

PERMUKAAN

WARNA

UKURAN KOLONI


77

MATERI V

IDENTIFIKASI SEL DAN KOLONI KHAMIR

A. HASIL PENGAMATAN SEL KHAMIR

SEL KHAMIR GAMBAR HASIL PENGAMATAN

PREPARAT NATIF

UMUR SEL:

…….jam

PEMBESARAN

BENTUK SEL

KUNCUP

PSEUDOHIFA

SPORA

B. HASIL PENGAMATAN KOLONI KHAMIR

• Bentuk Pertumbuhan pada Agar Tegak dan Agar Miring

GAMBAR PERTUMBUHAN KOLONI KHAMIR

AGAR TEGAK AGAR MIRING

Bentuk : Bentuk :


78

MATERI VI

IDENTIFIKASI SEL DAN KOLONI KAPANG

A. HASIL PENGAMATANSEL KAPANG

SEL KHAMIR GAMBAR HASIL PENGAMATAN

PREPARAT ULAS

UMUR SEL:

…….jam

PEMBESARAN

BENTUK SEL

HIFA

SPORA

B. HASIL PENGAMATAN KOLONI KAPANG

• Bentuk Pertumbuhan pada Agar Tegak dan Agar Miring

GAMBAR PERTUMBUHAN KOLONI KAPANG

AGAR TEGAK AGAR MIRING

Bentuk : Bentuk :


79

MATERI VII

MENENTUKAN JUMLAH MIKROORGANISME (ENUMERASI)

A. HASIL PENGAMATAN

METODE

ISOLASI

JUMLAH KOLONI PENGENCERAN KE- STANDARD

PLATE COUNT (CFU/g atau CFU/ml)

10- 10- 10-

Pour Plate

Spread Plate

SAMPEL :

WAKTU INKUBASI :


80

MATERI VIII

PEWARNAAN GRAM

A. HASIL PENGAMATAN

GAMBAR HASIL PENGAMATAN

PEMBESARAN : PEMBESARAN :

BAKTERI GRAM : BAKTERI GRAM :


81

MATERI IX

PROTOZOA RUMEN

A. HASIL PENGAMATAN


PROTOZOA : PROTOZOA :


82

MATERI X

SLIDE CULTURE

A. HASIL PENGAMATAN


PEMBESARAN : PEMBESARAN :

VERSI: VERSI:

WAKTU: WAKTU:


83

FOTO 3 x 4...iv PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2020 PRAKATA Buku petunjuk praktikum mikrobiologi...

Documents

Transcript of FOTO 3 x 4...iv PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI 2020 PRAKATA Buku petunjuk praktikum mikrobiologi...