1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penggunaan herbal untuk penanganan penyakit ikan sudah menjadi tradisi

masyarakat pembudidaya ikan di beberapa Daerah Istimewa Yogyakarta. Berbagai

penggunaan herbal dipercaya mampu menanggulangi penyakit ikan. Pembudidaya ikan

di daerah Cangkringan mengenal penggunaan daun ketapang, batang pisang, klorosede,

rondolenguk, dan sambiloto untuk penanggulangan penyakit ikan (Rosyid, komunikasi

personal September 2013). Pembudidaya ikan di daerah Minggir mengenal penggunaan

daun ketapang, daun johar, daun sembung, rondonoleh, dan batang pisang untuk

penanggulangan penyakit ikan (Sukijo, komunikasi personal Oktober 2013).

Pembudidaya ikan di daerah Sewon mengenal penanggulangan penyakit ikan

menggunakan batang pisang (Sulis, komunikasi personal Oktober 2013). Pembudidaya

ikan di daerah Wates mengenal penanggulangan penyakit ikan menggunakan batang

pisang dan jantung pisang (Wagiran, komunikasi personal Oktober 2013).

Berbagai herbal yang digunakan masyarakat dalam penanganan penyakit ikan

seperti daun sembung, daun ketapang, dan batang pisang dilaporkan memiliki

kandungan senyawa aktif seperti tannin, flavonoid, dan saponin. Beberapa herbal

tersebut juga dilaporkan memiliki kemampuan antibakteri terhadap Staphylococcus

aureus, Escherischia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, B. cereus, dan

Candida albicans. Herbal tersebutjuga digunakan sebagai obat tradisional untuk

berbagai penyakit manusia seperti epilepsi, disentri, diarrhea, lepra, sakit mata, scabies,

pusing, batuk, dan obat luka (Dalimartha, 2008; Chen et al., 2009; Jawla et al., 2012;

Rakholiyaet al., 2012; Karuppiyahet al., 2013).

Herbal yang digunakan masyarakat untuk menanggulangi penyakit ikan masih

perlu diteliti secara ilmiah dan diuji aktivitas antibakterinya secara spesifik terhadap

bakteri patogen ikan. Penelitian perlu dilakukan untuk membuktikan dan mengetahui

kemampuan antibakteri terhadap bakteri patogen ikan dari herbal yang dipercayai dan

masih digunakan masyarakat. Penelitian terhadap bahan herbal ini berpeluang

memunculkan dan mengembangkan alternatif baru untukmenanggulangi penyakit ikan.

2

Beberapa bakteri patogen ikan seperti Aeromonas hydrophila, Streptococcus sp. dan

Vibrio sp. dapat menjadi bakteri uji dalam penelitian karena menurut Irianto (2005)

ketiga bakteri ini banyak menyerang berbagai jenis ikan.

B. Tujuan

1. Mengetahui aktivitas antibakteri daun ketapang, batang pisang, dan daun sembung

terhadap tiga bakteri patogen ikan yakni Aeromonas hydrophila, Streptococcus sp. dan

Vibrio sp.

2. Mengetahui ekstrak herbal yang memiliki aktivitas antibakteri terbaik

3. Mengetahui golongan senyawa yang aktif menghambat bakteri

C. Manfaat

1. Memberikan gambaran tentang aktivitas antibakteri daun ketapang, batang pisang, dan

daun sembung terhadap tiga bakteri patogen ikan yakni Aeromonas hydrophila,

Streptococcus sp. dan Vibrio sp.

2. Memberikan informasi mengenai ekstrak herbal yang memiliki aktivitas antibakteri

terbaik

3. Memberikan informasi mengenai golongan senyawa yang aktif menghambat bakteri

D. WaktudanTempat

Survei sederhana mengenai berbagai herbal yang digunakan masyarakat untuk

menanggulangi penyakit ikan dilakukan pada bulan September-Oktober 2013 di

Kabupaten Sleman, Bantul, dan Kulonprogo. Uji kadar air, ekstraksi bahan herbal, uji

aktivitas antibakteri, uji MIC dan MBC, uji bioautografi, dan identifikasi golongan

senyawa yang menghambat bakteri dilakukan pada bulan Maret-September 2014 di

Laboratorium Hidrobiologi, Laboratorium Nutrisi dan Pakan Alami, Laboratorium

Hama dan Penyakit Ikan, dan Laboratorium Teknologi Ikan Jurusan Perikanan UGM.

3

II. TINJAUAN RUJUKAN

A. Bakteri Patogen Ikan

Menurut Afrianto dan Liviawaty (1992) beberapa bakteri patogen ikan di

antaranya adalah Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Flexibacter sp., dan Vibrio sp.

yang termasuk bakteri golongan Gram negatif. Selain itu ada juga bakteri golongan

Gram positif yang patogen atau dapat menginfeksi ikan, salah satunya adalah

Streptococcus sp.

A.1. Aeromonas hydrophila

Bakteri Aeromonas termasuk ke dalam famili Pseudomonadaceae dan terdiri

dari tiga species utama, yaitu A. hydrophila, A. punctata, dan A. liuiefacieus. Bakteri

ini hidup di air tawar, terutama yang mengandung bahan organik tinggi, dengan suhu

15-30oC dan pH 5,5-9. Morfologinya berbentuk batang dengan ukuran 1-4,4x0,4-1

mikron, termasuk golongan Gram negatif, fakultatif aerobik, tidak berspora, dan

bersifat motil karena memiliki satu flagel (Afrianto dan Liviawaty, 1992).

Bakteri Aeromonas dapat menyerang semua jenis ikan air tawar dan jenis

penyakitnya disebut Motil Aeromonas Septicemia (MAS) atau sering juga disebut

Hemorrhage septicemia. Serangan bakteri ini bersifat berkepanjangan sehingga baru

dapat dijumpai apabila ketahanan tubuh ikan menurun akibat stres yang disebabkan

penurunan kualitas air, kekurangan pakan, atau penanganan yang kurang cermat.

Penularan penyakit MAS dapat berlangsung melalui air, kontak badan, kontak

peralatan, atau pemindahan ikan yang terinfeksi bakteri Aeromonas ke tempat lain.

Gejala yang akan timbul berupa warna tubuh yang berubah menjadi gelap, kulit

menjadi kasat, dan timbul pendarahan yang akan menjadi hemorrhage, kemampuan

berenang menurun dan sering megap-megap di permukaan air karena insang rusak,

sering terjadi pendarahan pada organ dalam, perut terlihat kembung, seluruh siripnya

rusak, insang menjadi keputih-putihan, serta mata rusak dan agak menonjol (Afrianto

dan Liviawaty, 1992).

A.2. Streptococcus sp.

Salah satu bakteri yang dapat menyerang ikan adalah Streptococcus sp.

sehingga penyakitnya disebut Streptococciasis. Penyakit ini menyerang beberapa ikan

4

budidaya air tawar maupun laut di beberapa negara dan cukup berbahaya karena

menyebabkan kematian ikan. Penyakit ini dapat menyerang ikan nila, stripped bass,

rabbitfish, rainbow trout, dan barramundi (Evans et al., 2000). Bakteri Streptococcus

sp. termasuk ke dalam famili Streptococcaceae. Bakteri ini termasuk golongan Gram

positif, berbentuk bulat hingga lonjong, diameter ≤ 2 µm, dan dapat melakukan

pembelahan sel (Kuntaman, 2007).

A.3. Vibrio sp.

Bakteri Vibrio sp. merupakan penyebab penyakit Vibriosis pada ikan. Ikan yang

terinfeksi akan menunjukkan gejala berupa kehilangan nafsu makan, kulit menjadi

gelap, insang pucat, sering muncul bisul yang mengeluarkan cairan bewarna kuning

kemerahan, dan terjadi pendarahan pada dinding perut serta permukaan jantung. Jika

dilakukan pembedahan maka akan terlihat pembengkakan dan kerusakan pada hati,

ginjal, dan limpa (Ghufron dan Kordi, 2013).

B. Kemampuan Antibakteri Daun Ketapang

Ketapang memiliki nama ilmiah Terminalia catappa L. Ketapang dalam bahasa

Inggris disebut Indian almond atau Singapore almond. Ketapang berasal dari Asia

Tenggara dan sudah dikenal secara umum di Indonesia. Ketapang ditanam di Australia

Utara, Polinesia, Pakistan, India, Afrika Timur dan Barat, Madagaskar, serta dataran

rendah Amerika Selatan dan Tengah. Ketapang tumbuh alami pada pantai berpasir atau

berbatu. Pohon ketapang berukuran moderat, mudah gugur, bentuk seperti pagoda,

terutama bila pohon masih muda. Batang sering berbanir pada pangkal, pepagan coklat

abu-abu tua, merekah, sementara cabang tersusun dalam deretan bertingkat dan

melintang. Daun berseling, bertangkai pendek, mengumpul pada ujung cabang,

biasanya membundar telur sungsang, kadang-kadang agak menjorong, mengertas

sampai menjangat tipis, dan mengkilap. Bunga berbulir tumbuh pada ketiak daun,

sebagian besar adalah bunga jantan, bunga biseksual terdapat ke arah pangkal, sangat

sedikit, warna putih-kehijauan dengan cakram berjanggut. Buah pelok membulat telur

atau menjorong, agak pipih, hijau-kekuningan dan berwarna merah saat matang. Buah

batu dikelilingi lapisan daging berair setebal 3-6 mm. Jenis ini dapat dikenali langsung

5

dari cabangnya yang kaku dan daun-daun besarnya yang tersusun dalam roset (Prohati,

2013).

Daun ketapang digunakan secara luas sebagai obat tradisional di Asia Tenggara

untuk dermatosis dan hepatitis. Banyak studi farmakologi melaporkan bahwa ekstrak

daun dan buah ketapang memiliki kemampuan antikanker, antioksidan, anti-HIV-

reserve-transcriptase, anti-inflammantory, anti-diabetic dan memiliki aktivitas

hepatoprotektif (Jing et al., 2004). Ketapang juga dikenal sebagai obat tradisional

dalam mencegah hepatitis dan hepatoma di Taiwan (Chen et al., 2000). Ketapang juga

digunakan sebagai obat tradisional untuk mengatasi demam dan disentri di wilayah

hutan Amazon (Watson, 2008).

Uji antibakteri dari ekstrak metanol daun ketapang yang dilakukan oleh

Rakholiya dan Chanda (2012) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Micrococcus

Flavus, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Proteus

morganii, P. vulgaris, P. mirabilis, Klebsiella pneumoniae, dan Enterobacter aeorgenes

dengan zona hambat antara 9-15 mm. Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun

ketapang yang dilakukan oleh Kloucek et al., (2005) menunjukkan aktivitas antibakteri

terhadap Bacillus cereus, B. subtilis, Bacteroides fragilis, Enterococcus faecalis,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S. epidermidis,

dan Streptococcus pyogenes dengan minimum inhibitory concentration (MIC) antara

0,25 mg/ml hingga 16 mg/ml.

Uji aktivitas antimikrobia dari ekstrak N,N-dihylformamide, acetone, dan

metanol Terminalia catappa sudah diuji melawan 91 strain mikrobia yang penting

secara klinis yang terdiri dari 20 bakteri Gram positif, 55 strain bakteri Gram negatif

dan 16 strain fungi, termasuk 19 strain dari spesies bakteri Pseudomonas. Hasil uji

tersebut menunjukkan ketiga ekstrak Terminalia catappa aktif melawan 70% dari

semua bakteri Gram positif, 63% dari semua bakteri Gram negatif, dan 25% dari

semua strain fungi yang diuji (Chanda, 2011). Kemampuan antibakteri daun ketapang

terhadap Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus

Enterobacteraerogenes juga diujikan oleh Neelavathi (2012) dengan hasil yang sangat

efektif dibandingkan dengan antibiotik Ciprofloxacin.

6

Hasil analisis fitokimia kualitatif dari daun ketapang yang dilakukan Neelavathi

(2012) menjelaskan bahwa daun ketapang mengandung senyawa alkaloid, flavonoid,

tannin, saponin, senyawa fenol, triterpenoid, fitosterol, protein, karbohidrat dan

glikosida, resin, lemak dan fixed oil.Kandungan senyawa flavonoid pada ketapang

sudah diisolasi dan diuji aktivitas antibakterinya oleh Ariyanti dkk. (2013) dengan zona

hambat yang dihasilkan terhadap Staphylococcus epidermidis berkisar antara 11 mm

hingga 23 mm dan terhadap Pseudomonas aeroginosa berkisar antara 10 mm hingga

29 mm.

C. Kemampuan Antibakteri Batang Pisang

Buah, daun, kulit, akar, dan batang pisang (Musa sp.) sudah digunakan sebagai

obat untuk penyakit diarrhea dan disentri, intestinal colitis, antilithic, inflamasi, luka

dan gigitan ular, protein abolic disorder, antimikrobia, antiulcerogenic, antihelmintic,

hypoglycemic, dan antioksidan (Jawla et al., 2012).Berdasarkan uji fitokimia yang

dilakukan oleh Suarsa (2011) ekstrak etanol, aseton, dan n-heksana dari batang pisang

kepok dan pisang susu mengandung tannin dan flavonoid. Kandungan dari pisang yang

diperkirakan memiliki kemampuan antibakteri adalah alkaloid, tannin, flavonoid,

saponin, dan steroid (Zafar, 2011).

Penelitian yang dilakukan oleh Hastari (2012) menyimpulkan bahwa ekstrak

batang dan pelepah pisang (Musa acuminata) memiliki aktivitas antibakteri terhadap

bakteri Staphylococcus aureus. Penambahan ekstrak batang dan pelepah pisang

dengan konsentrasi 6,25 %, 12,5 %, dan 25 % menunjukkan adanya pengaruh

penurunan koloni bakteri S. aureus. Rerata jumlah koloni bakteri pada kontrol tanpa

ekstrak berjumlah 537,33 koloni, sedangkan rerata jumlah koloni pada ekstrak batang

pisang dengankonsentrasi 6,25 % berjumlah 69,33 koloni, konsentrasi 12,5 %

berjumlah 6,67 koloni, dan konsentrasi 25 % berjumlah 5 koloni. Rerata jumlah koloni

pada ekstrak pelepah pisang dengan konsentrasi 6,25 % berjumlah 17,67 koloni,

konsentrasi 12,5 % berjumlah 13,33 koloni, dan konsentrasi 25 % berjumlah 2,6

koloni. Bhattacharjee dkk. (2013) melakukan uji antibakteri terhadap ekstrak aseton,

etanol, dan akuades dari batang pisang dengan konsentrasi 2 mg/ml terhadap bakteri

patogen seperti Aeromonas hydrophila, Bacillus licheniformis, B. mycoides, B. niacini,

7

B. subtilis, Escherichia coli, Geobacillus thermodenitrificans, Klebsiella pneumoniae,

Paenibacillus koreensis, P. larvae larvae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa,

P. flourescens, P. putida danStaphylocccus aureus. Hasilnya ekstrak aseton terlihat

memiliki aktifitas antibakteri terhadap semua bakteri kecuali Aeromonas hydrophila,

Bacillus niacini, dan Geobacillus thermodenitrificans dengan rerata diameter zona

hambat 9,67 ± 6,24 mm, ekstrak akuades terlihat memiliki aktifitas antibakteri terhadap

semua bakteri kecuali Aeromonas hydrophila, Bacillus mycoides, B. niacini, dan

Geobacillus thermodenitrificans dengan rerata diameter zona hambat 9 ± 5,29 mm, dan

ekstrak etanol terlihat memiliki aktifitas antibakteri terhadap semua bakteri kecuali

Aeromonas hydrophila dan Bacillus niacini dengan rerata diameter zona hambat 10,46

± 7,07 mm.Hasil ujiminimum inhibitory concentration (MIC) dari ekstrak etanol

batang pisang terhadap Aeromonas hydrophila, Bacillus licheniformis, B. mycoides, B.

niacini, B. subtilis, Escherichia coli, Geobacillus thermodenitrificans, Klebsiella

pneumoniae, Paenibacillus koreensis, P. larvae, Proteus vulgaris, Pseudomonas

aeruginosa, P. flourescens, P. putida, dan Staphylococcus aureus berkisar antara 10

mg/ml dan 30 mg/ml.

D. Kemampuan Antibakteri Daun Sembung

Sembung atau Blumea balsamifera berasal dari Nepal. Tumbuhan ini hidup di

tempat terbuka hingga agak terlindung di tepi sungai dan lahan pertanian. Sembung

dapat tumbuh di tanah berpasir atau tanah yang agak basah pada ketinggian hingga

2.200 m dpl. Sembung merupakan jenis perdu, tumbuh tegak, tinggi mencapai 4 m,

memiliki percabangan pada ujungnya, berambut halus, dan berbau kamfer jika bagian

tumbuhannya diremas. Sembung memiliki daun tunggal, di bagian bawah bertangkai,

bagian atas merupakan daun duduk, letak berseling, dan terdapat 2-3 daun tambahan

pada tangkai daunnya. Helaian daun sembung berbentuk bundar telur hingga lonjong,

pangkal dan ujung runcing, tepi bergerigi atau bergigi, permukaan atas berambut agak

kasar, permukaan bawah berambut rapat dan halus seperti beludru, pertulangan

menyirip, panjang 8-40 cm, dan lebar 2-20 cm. Perbungaan majemuk berbentuk malai,

keluar di ujung tangkai, dan berwarna kuning. Buah kotak berbentuk silindris, beriga

8-10, panjang 1 mm, dan berambut. Perbanyakan tumbuhan menggunakan biji atau

8

pemisahan tunas akar. Sembung bersifat pedas, sedikit pahit, hangat, dan baunya

seperti rempah (Dalimartha, 2008).

Daun sembung (Blumea balsamifera) digunakan dalam pengobatan tradisional

Thailand dan China untuk luka dan infeksi (Sakeeet al., 2011). Sembung berkhasiat

sebagai antibakteri, melancarkan peredaran darah, menghilangkan bekuan darah dan

pembengkakan, peluruh kentut, peluruh keringat, peluruh dahak, astrigen, tonikum,

serta obat batuk. Sembung mengandung minyak atsiri, getah, borneol, sineol, limone,

asam palmitin dan myristin, alkohol sesquiterpent, khlorasetofenon, tannin,

pirokatechin, dan glikosida (Dalimartha, 2008). Sembung juga mengandung flavonoid,

monoterpent, sesquiterpent, acetylenic thiophenes, tripernoid, xanthenes, diterpenes,

dan minyak esensial (Chen et al., 2009).

Uji aktivitas antibakteri daun sembung sudah dilakukan oleh Sakeeet al. (2011)

terhadap beberapa jenis bakteri. Hasilnya ekstrak heksan daun sembung mampu

menghambat Staphylococcus aureus dan Enterobacter cloacae, ekstrak

dichloromethane mampu menghambat S. aureus, ekstrak minyak esensial mampu

menghambat Bacillus cereus dan S. aureus dengan zona hambat terbesar 19 mm.

Minimum inhibitory concentration (MIC) dan Minimum bactericidal concentration

(MBC) terbaik dari daun sembung didapati pada ekstrak minyak esensial dengan

konsentrasi 0,15 mg/ml terhadap Bacillus cereus dan 1,2 mg/ml terhadap

Staphylococcus aureus.

E. Dosis Herbal yang Digunakan oleh Pembudidaya Ikan

Penggunaan daun ketapang dalam treatment tradisional penyakit ikan adalah

dengan cara daun ditebarkan ke dalam kolam. Dosis daun ketapang yang diberikan

adalah 36,7 g/m2dan diberikan setiap 2 bulan sekali. Dosis batang pisang dalam

treatment tradisional penyakit ikan adalah 71,4 g/m2 dan diberikan sebulan sekali.

Metode pemberiannya adalah batang pisang dipotong-potong kemudian direndam ke

dalam kolam. Daun sembung diberikan ke dalam kolam beserta batangnya. Dosis daun

sembung yang digunakan adalah 17,8 g/m2dan diberikan sebulan sekali (Sukijo,

komunikasi personal Oktober 2013).

9

III. METODE

A. Alat dan Bahan

A.1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung kaca, erlenmeyer

(Pyrex), blender (Phipips HR 2071), gelas ukur (Pyrex), botol falcon (BD), blender,

timbangan analitik (Denver AA200), timbangan digital (Shimadzu BX 320 D), pipet

ukur (Iwaki), cawan porselin, vacuum rotary evaporator(Heidolph Laborota 4000),

oven (Eyela WFO-601SD), desikator, vortex (Thermolyne Maxi Mix II37600),

autoklaf (Yxqgoi), yellow tip, blue tip, micropipet(Rainin), petridisc, tabung reaksi

(Iwaki),plat KLT (Merck), bunsen,paperdisc,microplate(Brandt), UVLamp 254 nm

(Merck), pendingin (LG), stir plate (Nuova), spektrofotometer (Apel AP-101),

inkubator (Memmeri), kuvet, masker, hand glove, alumunium foil (Total Wrap), plastik

wrap, kertas tisu, kertas label, dan ballpoint.

A.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun ketapang(Terminalia

catappa) berwarna hijau yang dipetik dari pohon ketapang di Jurusan Perikanan UGM,

batang pisang Ambon (Musa acuminata) dengangenotip AAA dari Pusat Plasma

Nutfah Pisang Giwangan, daun sembung(Blumea balsamifera) dipetik dari Merapi

FarmPakem, heksan, etil asetat, etanol 96% (Mediss), akuades, DMSO 99,5%

(Merck), reagen MTT, medium TSA (Oxoid CM0131), medium TSB (Pronadisa

Cat.1224.00), medium agar (Oxoid LP0011), antibiotikCiprofloxacin (Bernofarm),

spirtus, serta bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus sp. dan Vibrio sp. dari

Laboratorium Hama dan Penyakit Ikan Jurusan Perikanan UGM.

B. Rancangan Percobaan

Penelitian ini menggunakan rancangan eksplorasi dengan tiga bahan herbal

yang dieksplorasi kemampuan antibakterinya, yaitu daun ketapang (Terminalia

catappa), batang pisang (Musa acuminata), dan daun sembung (Blumea balsamifera).

Ketiga bahan tersebut diekstrak menggunakan tiga pelarut yaitu etil asetat, etanol dan

akuades secara berturut-turut. Hasil ekstrak ketiga bahan ini diuji aktivitas

antibakterinya menggunakan paperdisc di dalam petridisc terhadap Aeromonas

10

hydrophila, Streptococcus sp. dan Vibrio sp. dengan kontrol negatif yaitu paperdisc

yang ditetesi DMSO sebagai pelarut, serta kontrol positif yaitu paperdisc yang ditetesi

Ciprofloxacin. Bahan yang memiliki aktivitas antibakteri terbaik kemudian dilakukan

uji Minimum Inhibitory Concentration(MIC)danMinimum Bactericidal

Concentration(MBC) untuk mendapatkan ekstrak yang memiliki kemampuan

antibakteri terbaik. Ekstrak yang memiliki nilai MIC dan MBC terendah kemudian

diuji bioautografi untuk mengetahui spot senyawa yang aktif menghambat bakteri.Spot

senyawa yang aktif kemudian diidentifikasi golongan senyawanya menggunakan

reagen pendeteksi senyawa pada plat KLT (Kromatografi Lapis Tipis).

C. Tata Laksana

C.1. Pengumpulan Bahan

Daun ketapang (Terminalia catappa) berwarna hijau dipetik dari dari pohon

ketapang di Jurusan Perikanan UGM. Batang pisang Ambon (Musa acuminata) dengan

genotip AAA diambil dari Pusat Plasma Nutfah Pisang Giwangan. Pohon pisang

ditebang dan batangnya dicacah menjadi bagian yang kecil-kecil. Daun sembung

(Blumea balsamifera) dipetik dari Merapi Farm. Semua bahan dikumpulkan dan

disimpan dalam ruangan.

C.2. Persiapan Bahan

Pengeringan daun ketapang, batang pisang, dan daun sembung dilakukan di

dalam ruangan tanpa terkena sinar matahari langsung. Daun ketapang, batang pisang,

dan daun sembung yang telah kering dihaluskan dengan blender sampai halus merata.

C.3. Ekstraksi Bahan

Daun ketapang, batang pisang, dan daun sembung yang telah halus dan kering

sebanyak 50 g masing-masing dimasukkan ke dalam tabung kaca kemudian

ditambahkan pelarut etil asetat sebanyak 400 ml dan didiamkan selama 24 jam. Bahan

herbal dan pelarut kemudian digojog 30 kali atau hingga warna pelarut berubah

menjadi pekat, kemudian larutan etil asetat dikeluarkan, disaring menggunakan kertas

saring dan ditampung. Pelarut etil asetat baru sebanyak 400 ml dimasukkan lagi ke

dalam toples kaca lalu digojog 30 kali atau hingga warna pelarut berubah menjadi

pekat. Larutan etil asetat dikeluarkan dan ditampung. Langkah ekstraksi dengan etil

11

asetat diulangi kembali hingga 3 kali pemasukan, penggojogan, pengeluaran,

penyaringan dan penampungan pelarut etil asetat. Setelah tiga kali ekstraksi dengan

pelarut etil asetat, pelarut etanol 400 ml dimasukkan ke dalam tabung kaca dan

dilakukan ekstraksi etanol sebanyak tiga kali yang memiliki langkah serupa dengan

ekstraksi etil asetat. Setelah tiga kali ekstraksi dengan pelarut etanol selesai, kemudian

dimasukkan akuades sebanyak 400 ml dimasukkan ke dalam tabung kaca dan

dilakukan langkah ekstraksi akuades sebanyak tiga kali yang memiliki langkah serupa

dengan ekstraksi etil asetat dan etanol.Hasil ekstraksi berupa larutan ekstrak bahan

herbal ditampung dalam erlenmeyer dan disimpan dalam kulkas.

C.4. EvaporasiEkstrak dan Perhitungan Rendemen

Bagian water bathdari vacuum rotary evaporatordiisi dengan air. Air dan es

batu dimasukkan ke dalam bak air pendingin, kabel poweruntuk pompa air, pompa

vakum dan pemanas ditancapkan ke sumber listrik. Kondensor ditunggu hingga dingin

atau berembun. Flask sampel ditimbang untuk mengetahui berat kosongnya. Larutan

ekstrak dimasukkan ke dalam flask sampel. Flask sampel dipasang pada tempatnya

kemudian diturunkan hingga sebagian tenggelam di water bath. Receiving flask

dipasang. Saluran udara keluar kondensor ditutup rapat. Tombol power pemanas dan

rotationdisplay water bath ditekan. Suhu diatur ke angka maksimal 400C untuk larutan

ekstrak etil asetat dan etanol, dan diatur ke angka 600C untuk larutan ekstrak akuades.

Putaran flask diatur ke angka 40 rpm dengan memutar tombol rotation. Alat evaporasi

terus diawasi agar larutan ekstrak tidak meluap. Proses evaporasi ditunggu hingga

pelarut cair sudah tidak tampak lagi. Bila telah selesai, tombol power saluran udara

keluar kondensor dibuka, pompa vakum dimatikan, tombol pemanas dan suhu

dimatikan, pengatur suhu dan putaran diputar ke posisi nol, dan labu dinaikkan ke

posisi atas. Flask sampel dilepas, kabel power dicabut.

Flask yang berisi sampel ekstrak semi basah ditimbang beratnya.Selisih antara

berat flask berisi ekstrak semi basah dan berat flask kosong dicatat sebagai nilai berat

ekstrak semi basah yang didapatkan. Ekstrak semi basah kemudian diuji kadar airnya

untuk mengetahui berat kering ekstrak. Nilai rendemen didapat dari total berat ekstrak

kering yang didapatkan dibagi total berat bahan yang diekstrak dikali 100%.

12

C.5. Pengujian Kadar Air Ekstrak

Cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 1050C selama minimal 1

jam. Cawan diletakkan ke dalam desikator kurang lebih 15 menit kemudian ditimbang

menggunakan timbangan analitik. Sebanyak 10 miligram sampel dimasukkan ke dalam

cawan, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 600C selama 4 jam lalu suhu

1050C selama 20 jam. Setelah selesai pengeringan dengan oven kemudian cawan

dikeluarkan dan diletakkan pada desikator kurang lebih 15 menit lalu ditimbang

kembali beratnya menggunakan timbangan analitik.

Perhitungan kadar air :

Keterangan:

A = Berat cawan kosong (g)

B = Berat cawan yang diisi dengan sampel (g)

C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (g)

C.6. Pembuatan Sediaan Ekstrak dalam Pelarut DMSO

Dosis ekstrak yang digunakan untuk uji antibakteri adalah 20 mg berat kering

ekstrak dalam 1 ml pelarut DMSO. Nilai berat kering sampel yang sudah diketahui

melalui uji kadar air digunakan untuk mendapatkan berat setiap ekstrak semi basah

(hasil evaporasi) yang dibutuhkan dalam mencapai takaran dosis 20mg/ml berat kering.

Sampel ekstrak semi basah dimasukkan ke dalam botol Falcon sesuai hasil perhitungan

hingga setara dengan 20 mg berat kering ekstrak. Selanjutnya pelarut ditambahkan ke

dalam botol Falcon hingga mencapai 1 ml. Dosis ekstrak dapat dikonversikan ke

perbandingan yang lebih besar yaitu 40 mg dalam 2 ml DMSO untuk memperbanyak

jumlah sediaan ekstrak.

C.7. Uji Aktivitas Antibakteri

Medium TSA cair bersuhu ± 500

Cdituangkan secara aseptis ke petridisc

sebanyak 15-20 ml dan ditunggu hingga memadat. Medium soft agarcair bersuhu ± 400

C dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10-15 ml. Bakteri dalam kultur TSB

yang berumur 18-24 jam di-vortex hingga homogen lalu diambil menggunakan

13

mikropipet sebanyak 100µL kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi soft

agar. Medium soft agar dalam tabung reaksi kemudian di-vortexdan dituangkan ke

atas TSA padat di dalam petridisc. Medium soft agar ditunggu sampai memadat.

Paperdisc diletakkan ke atas medium soft agar yang sudah memadat secara

aseptis. Ekstrak bahan herbal dengan konsentrasi 20 mg/ml diteteskan ke atas

paperdisc dengan volume 50 µl. Kontrol negatif yaitu larutan DMSO sebanyak 50 µl

dan kontrol positif yaitu Ciprofloxacin dengan konsentrasi 2 mg/ml sebanyak 50

µlmasing-masing diteteskan ke atas paperdisc.Petridisc kemudian dibungkus dan

diinkubasi pada suhu 300

C. Zona hambat dari paperdisc diamati dan diukur

diameternya setelah inkubasi 18-24 jam.

C.8. Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dan Minimum Bactericidal

Concentration (MBC)

Sediaan ekstrak hasil evaporasi diambil setara 40 mg berat kering dan

dimasukkan ke dalam microtube. TSBdimasukkan ke microtube hingga mencapai

takaran 800 µldi dalam microtube. TSB dan ekstrak dihomogenkan menggunakan

vortex. Sediaan ekstrak yang sulit larut homogen dapat diberikan pelarut DMSO

sebanyak 100-200 µl terlebih dahulu sebelum dimasukkan TSB.

Ekstrak herbal yang sudah larut dengan TSB di dalam microtube diambil

sebanyak 80 µl untuk dimasukkan ke dalam sumuran pertama dan kedua pada

microplate. Pada sumuranurutanketiga hingga keenam dimasukkan TSB masing-

masing sebanyak 80 µl. Ekstrak pada sumurankedua dihomogenkan dengan pipetting

lalu diambil sebanyak 80 µl dan dipindahkan ke sumuranketiga. Pengenceran dengan

cara yang sama dilakukan pada sumuranberikutnya hingga masing-masing ekstrak

memiliki 6 tingkat konsentrasi ekstrak. Kemudian masing-masing wellplate diinokulasi

dengan 20 µl TSB berisi bakteri dengan konsentrasi 4-5 x 108cfu/ml sesuai standar 0,5

McFarland dan dihomogenkan dengan pipetting. Ulangan untuk masing-masing

ekstrak terhadap satu bakteri dilakukan sebanyak tiga kali. Konsentrasi akhir ekstrak

dalam 6 sumuran yang sejajar yaitu 40 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5

mg/ml, dan 1,25 mg/ml.Kontrol negatif yang digunakan adalah sumuranberisi 80 µl

14

TSB dan 20 µl bakteri tanpa ekstrak. Kontrol positif yang digunakan adalah 100 µl

TSB tanpa ekstrak dan tanpa bakteri.

Inkubasi microplate dilakukan pada suhu 300

C selama 24 jam. Pengamatan

MIC setelah inkubasi 24 jam dilakukan dengan melihat pertumbuhan bakteri pada

sumuran. Sumuran yang ditumbuhi bakteri akan berubah keruh atau terlihat adanya

endapan bakteri yang banyak. Reagen MTT 10-20 µl dapat diteteskan untuk

memastikan pertumbuhan bakteri. Sumuran yang ditumbuhi bakteri akan berwarna biru

dan yang tidak ditumbuhi bakteri tidak terjadi perubahan warna atau berwarna

kekuningan. Konsentrasi ekstrak minimum pada sumuranyang dapat menghambat

bakteri dicatat sebagai nilai MIC.

Setelah inkubasi selama 48 jam, ekstrak di dalam sumuran diinokulasi dengan

jarum ose pada medium TSA dalam petridisc. Medium TSA kemudian diinkubasikan

selama 24 jam lalu diamati pertumbuhan bakteri pada bekas inokulasi. Konsentrasi

ekstrak minimum yang tidak menghasilkan pertumbuhan bakteri pada bekas inokulasi

di TSA dicatat sebagai nilai MBC.

C.9. Uji Bioautografi

Plat KLT dipotong sesuai ukuran. Garis dasar (base line) dibuat di bagian

bawah, sekitar 1 cm dari ujung bawah plat dan garis akhir di bagian atas sekitar 0,5 cm

dari ujung atas plat. Sampel cairan yang telah disiapkan sejajar ditotolkan

menggunakan pipa kapiler, tepat di atas base line. Jika sampel padat, dilarutkan pada

pelarut tertentu terlebih dahulu. Totolan dikeringkan. Masing-masing eluen

dimasukkan ke dalam chamber dan dicampurkan. Plat ditempatkan pada chamber

berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh eluen. Chamber ditutup. Eluen

ditunggu hingga mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, pada tahap ini

pemisahan akan terlihat. Setelah mencapai garis akhir, plat diangkat dengan pinset,

dikeringkan, dan diukur jarak spot. Jika spot tidak kelihatan, plat diamati pada lampu

UV. Jika masih tak terlihat, plat disemprot dengan pewarna tertentu seperti kalium

kromat atau ninhidrin.

Bakteri dikultur dalam 10 medium TSB dalam tabung reaksi selama 24 jam.

Kemudian kepadatan bakteri dihitung menggunakan spektrofotometer. Pengenceran

15

dilakukan menggunakan medium TSB sehingga didapati kepadatan bakteri 107 cfu/ml

sesuai standar 0,5 McFarland. Kemudian bakteri TSB sebanyak 500 µl diinokulasikan

ke dalam tabung reaksi berisi 9,5 mlsoft agar cair dan dihomogenkan menggunakan

alat vortex.Soft agar berisi bakteri dituangkan ke dalam petridisc. Plat KLT yang sudah

memperlihatkan pemisahan golongan senyawa kemudian dicelupkan ke dalam soft

agar berisi bakteri. Plat KLT kemudian disimpan ke dalam petri disc dan

diinkubasikan selama 24 jam. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan plat KLT

disemprot menggunakan reagen MTT. Bagian plat KLT yang berwarna biru

merupakan zona tumbuh bakteri dan bagian plat KLT yang tetap bening merupakan

zona hambat bakteri. Spot pemisahan pada plat KLT yang menjadi zona hambat bakteri

ditandai, dihitung nilai Rf, dan didokumentasikan.

C.10. Identifikasi Golongan Senyawa yang Menghambat Bakteri

Identifikasi golongan senyawa yang menghambat bakteri dilakukan dengan

menggunakan plat KLT dan reagen pendeteksi golgongan senyawa.Ekstrak kental

diteteskan pada plat KLT kemudian dikembangkan dengan fase gerak heksan : etil

asetat 7:3. Setelah itu spot yang pada uji bioautografi sudah diketahui aktif

menghambat bakteri dilingkari dengan pensil.Plat KLT dicelupkanke dalam reagen

pendeteksi golongan senyawa dan kemudian dipanaskan pada hot plate sampai terjadi

perubahan warna. Reagen pendeteksi golongan senyawa yang digunakan antara lain

asam sulfat, anisaldehid-asam sulfat, vanilin-asam sulfat, ninhidrin, dan FeCl3.

Identifikasi golongan senyawa dengan reagen vanilin-asam sulfat berbeda dengan

reagen yang lain, penggunaan reagen ini tidak perlu pemanasan plat KLT padahot

plate. Reagen pendeteksi golongan senyawa dan kegunaannya disajikan pada tabel 3.1.

16

Tabel 3.1. Reagen pendeteksi golongan senyawa dan kegunaannya.

Reagen asam sulfat Reagen ini merupakan reagen umum. Perubahan warna

menjadi merah menunjukkan adanya kandungan terpenoid.

Reagen anisaldehid-

asam sulfat

Reagen yang sering digunakan untuk mendeteksi triterpen.

Warna merah hingga ungu menunjukkan adanya triterpen

(Oleszek et al., 2008).

Reagen vanillin-

asam sulfat

Reagen yang dapat digunakan untuk mendeteksi triterpen.

Triterpen akan berwarna biru, biru violet, dan kekuningan

(Waksmundzka-Hajnos, 2008)

Reagen ninhidrin Reagen ini khususnya digunakan pada asam amino dan

protein. Asam amino dan protein akan memunculkan warna

violet (Mamta dan Jyoti, 2012).

Reagen FeCl3 Reagen ini digunakan untuk mendeteksi adanya fenol.

Perubahanwarna menjadi hijau menunjukkanadanya

senyawa fenol (Mamta dan Jyoti, 2012).

C.11. Analisis Data

Data mengenaihasil uji aktivitas antibakteri dari daun ketapang, batang pisang,

dan daun sembung hingga uji MIC, MBC, bioautografi dan identifikasi golongan

senyawa dianalisis secara deskriptif untuk mendapatkan kesimpulan penelitian.

D. AlurPenelitian

Alur penelitian yang dilakukandisajikan pada Gambar 3.1.

17

Gambar 3.1. Alur penelitian yang dilakukan

Pengeringan sampel daun ketapang, daun sembung, dan batang pisang dalam ruangan

Ekstraksi dengan

Etil Asetat 3x Ekstraksi dengan

Akuades 3x

Aeromonas

hydrophila

Streptococcus sp.

Vibrio sp.

Uji MIC dan MBC dari

bahan yang aktivitas

antibakterinya tertinggi

Analisis hasil

Uji aktivitas antibakteri

Uji bioautografi dari

ekstrak yang memiliki

nilai MIC dan MBC

terendah

Ekstraksi dengan

Etanol 3x

Uji kadarair ekstrak daun

ketapang, daun sembung,

dan batang pisang

Pembuatan sediaan ekstrak

20mg/mL dalam DMSO

Penghalusan sampel dengan blender

Evaporasi larutan ekstrak

Identifikasi Golongan

Senyawayang

Menghambat Bakteri

Pengumpulan bahan herbal

18

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Rendemen Ekstraksi

Ekstraksi batang pisang, daun ketapang, dan daun sembung dilakukan dengan

menggunakan tiga pelarut secara berturut-turut, yaitu etil asetat, etanol, dan akuades.

Setelah evaporasi dilakukan uji kadar air untuk mengetahui berat ekstrak kering. Nilai

rendemen didapat dari berat ekstrak kering dibagi berat bahan herbal yang digunakan.

Adapun nilai rendemen yang didapat dari kesemua ekstrak dijelaskan dalam Tabel 4.1.

Tabel 4.1. Nilai Rendemen Ekstrak Bahan Herbal

No. Ekstrak Berat

Bahan (g)

Berat Ekstrak

Semi Basah (g)

Kadar

Air (%)

Berat Ekstrak

Kering (g)

Rendemen

(%)

1 DEA 50 1,272 22 0,992 2

2 DE 50 2,939 25 2,205 4

3 DA 50 7,488 27 5,466 11

4 KEA 50 18,936 6 17,800 36

5 KE 50 12,204 19 9,885 20

6 KA 50 15,804 16 13,275 27

7 SEA 25 3,251 38 2,016 8

8 SE 25 1,338 25 1,004 4

9 SA 25 1,883 11 1,676 7

Keterangan:

DEA : Ekstrak etil asetat batang

pisang

DE : Ekstrak etanol batang pisang

DA : Ekstrak akuades batang pisang

KEA : Ekstrak etil asetat daun

ketapang

KE : Ekstrak etanol daun ketapang

KA :Ekstrak akuades daun ketapang

SEA :Ekstrak etil asetat daun sembung

SE :Ekstrak etanol daun sembung

SA : Ekstrak akuades daun sembung

Nilai rendemen tertinggi didapat pada ekstrak etil asetat daun ketapang yaitu

36%, sedangkan nilai rendemen terendah didapati pada ekstrak etil asetat batang pisang

yaitu 2%. Adapun nilai rendemen ekstrak yang lain yaitu ekstrak etanol daun ketapang

adalah 20 %, ekstrak akuades daun ketapang 27%, ekstrak etanol batang pisang 4 %,

ekstrak akuades batang pisang 11 %, ekstrak etil asetat daun sembung 8%, ekstrak etanol

daun sembung 4 %, dan ekstrak akuades daun sembung 7 %.

Nilai rendemen tertinggi dari bahan batang pisang didapati pada ekstrak dengan

pelarut akuades. Hal ini menunjukkan bahwa pelarut akuades adalah pelarut yang lebih

efektif untuk mengekstrak batang pisang dibandingkan dengan pelarut etanol dan etil

19

asetat. Nilai rendemen tertinggi dari bahan daun ketapang didapati pada ekstrak dengan

pelarut etil asetat. Hal ini menunjukkan etil asetat adalah pelarut yang lebih efektif untuk

mengekstrak daun ketapang dibandingkan pelarut etanol dan akuades. Nilai rendemen

tertinggi dari bahan daun sembung didapati pada ekstrak dengan pelarut etil asetat. Hal

ini menunjukkan etil asetat adalah pelarut yang lebih efektif untuk mengekstrak daun

sembung dibandingkan pelarut etanol dan akuades. Kecocokan antara tingkat polaritas

pelarut dengan tingkat polaritas kandungan bahan herbal yang diekstrak diperkirakan

menjadi faktor utama yang menentukan efektivitas pelarut dalam mengekstrak bahan.

B. Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan disc diffusion method di atas medium

soft agar petri. Konsentrasi ekstrak yang diteteskan ke atas paperdisc adalah 20 mg/ml

atau 1 mg/paperdisc dan konsentrasi antibiotik Ciprofloxacin yang diteteskan adalah 2

mg/ml atau 0,1 mg/paperdisc. Hasil dari uji antibakteri ditampilkan dalam Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Diameter zona hambat ekstrak beberapa herbal terhadap beberapa bakteri

patogen ikan (mm).

Ekstrak Bakteri

Aeromonas hydrophila Streptococcus sp. Vibrio sp.

DEA 11,3 ± 0,6 8,7 ±7,5 -

DE - - -

DA - - -

KEA 19 ±1,7 19 ±2,6 19,7 ± 0,6

KE 19 ±1,0 19,3 ±0,6 20,7 ± 0,6

KA 16,7 ± 0,6 16,3 ±2,1 17,3 ± 0,6

SEA 13,7 ±3,1 14 ±1,7 -

SE 9,7 ±8,7 8,7 ± 7,6 -

SA - 3,7 ±6,4 -

DM - - -

AB 38 ±1,7 39,7 ± 1,5 12,3 ±2,1

Keterangan:

DEA : Ekstrak etil asetat batang pisang

DE : Ekstrak etanol batang pisang

DA : Ekstrak akuades batang pisang

KEA : Ekstrak etil asetat daun ketapang

KE : Ekstrak etanol daun ketapang

DM : Larutan DMSO (kontrol negatif)

- : Tidak tampak adanya zona

Hambat

KA : Ekstrak akuades daun

ketapang

SEA : Ekstrak etil asetat daun

sembung

SE : Ekstrak etanol daun sembung

SA : Ekstrak akuades daun sembung

AB : Antibiotik Ciprofloxacin

(kontrol positif)

20

Daun ketapang aktif menghambat ketiga bakteri pada ekstrak etil asetat, etanol,

dan akuades. Batang pisang aktif menghambat Aeromonas hydrophila dan

Streptococcus sp. pada ekstrak etil asetat. Daun sembung aktif menghambat

Aeromonas hydrophila dan Streptococcus sp. pada ekstrak etil asetat dan etanol.

Ekstrak yang tidak terlihat memiliki aktivitas antibakteri adalah ekstrak etanol dan

akuades batang pisang terhadapketiga bakteri yang diuji, ektrak etil asetat batang

pisang terhadap Vibrio sp., ekstrak akuades daun sembung pada bakteri A. hydrophila,

dan ketiga ekstrak daun sembung terhadap bakteri Vibrio sp. Ekstrak bahan herbal

yang memiliki rerata aktivitas antibakteri tertinggi adalah ekstrak dari daun ketapang

yaitu sebesar 18,6 ±1,5 mm, sedangkan ekstrak bahan herbal yang memiliki rerata

aktivitas antibakteri terendah adalah ekstrak dari batang pisang yaitu sebesar 3,6 ±4,2

mm. Bahan herbal yang memiliki rerata aktivitas antibakteri tertinggi yaitu daun

ketapang selanjutnya diuji MIC dan MBC.

Hasil uji antibakteri menunjukkan bakteri uji yang paling resisten terhadap

ekstrak batang pisang dan daun sembung adalah bakteri Vibrio sp., sedangkan bakteri

yang paling sensitif terhadap ekstrak batang pisang dan daun sembung adalah

Streptococcus sp. Ketiga bakteri terlihat lebih sensitif terhadap ekstrak daun ketapang.

Bakteri A. hydrophila dan Streptococcus sp. terlihat cukup sensitif terhadap antibiotik

Ciprofloxacin, sedangkan bakteri yang terlihat resisten terhadap antibiotik

Ciprofloxacin adalah Vibrio sp. Zona hambat yang terlihat jernih pada uji ini

menunjukkan kemampuan bactericidal bahan sedangkan zona hambat yang terlihat

tipis namun tidak jernih memperlihatkan kemampuan bacteriostatic dari ekstrak.

Diameter zona hambat dari uji aktivitas antibakteri ekstrak batang pisang

memiliki nilai yang berbeda dari penelitian yang dilakukan oleh Babu et al.(2013).

Penelitian itu menggunakan ekstrak metanol batang pisangdengan konsentrasi 1

mg/paperdisc terhadap beberapa bakteri dengan agar well diffusion method. Hasilnya

ekstrak metanol batang pisang mampu menghambat bakteri Bacillus subtilis dan

Escherichia coli dengan diameter zona hambat >10 mm, namun tidak terlihat zona

hambat yang berarti pada bakteri Mycobacterium smegmatis dan Staphylococcus

aureus.

21

Diameter zona hambat dari uji aktivitas antibakteri ekstrak daun ketapang

menunjukkan nilaiyang berbeda dibandingkan penelitian yang dilakukan Neelavathi

(2012). Penelitian itu menguji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun ketapang

terhadap beberapa bakteri dengan metode disc diffusion method. Diameter zona hambat

yang dihasilkan ektrak akuades daun ketapang dengan konsentrasi 300 µg/ml terhadap

bakteri E.coli adalah 13 mm, B.subtilis adalah 14 mm, S. aureus adalah 17 mm, dan E.

aerogenes adalah 10 mm.

Diameter zona hambat dari uji aktivitas antibakteri ekstrak daun sembung

berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Sakeeet al. (2011) terhadap beberapa

jenis bakteri. Penelitian tersebut mendapati hasil ekstrak heksan daun sembung dengan

konsentrasi 384 µg/paperdisc mampu menghambat Staphylococcus aureus dengan

rerata diameter 7,25 mmdan Enterobacter cloacae dengan diameter zona hambat 6,75

mm, namun tidak aktif menghambat bakteri B. cereus, E. coli, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica. Ekstrak dichloromethane daun

sembung dengan konsentrasi 384 µg/paperdisc mampu menghambat Staphylococcus

aureus dengan rerata zona hambat 7,5 mm, namun tidak aktif menghambat B. cereus,

S. aureus, E.coli, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, dan S. enterica. Ekstrak

minyak esensial daun sembung dengan konsentrasi 384 µg/paperdisc mampu

menghambat B. cereus dengan zona hambat 12 mm dan S. aureus dengan zona hambat

terbesar 19 mm, namun tidak aktif menghambat Enterobacter cloacae, E. coli,K.

pneumoniae, P. aeruginosa, dan Salmonella enterica.

Hal-hal seperti perbedaan pelarut dalam ekstraksi, perbedaan proses ekstraksi,

perbedaan konsentrasi ekstrak,perbedaan bakteri, dan resistensi bakteri diduga menjadi

faktor yang membedakan antara hasil uji aktivitas antibakteri ini dengan hasil

penelitian lainnya. Hasil uji antibakteri ini mengkonfirmasi bahwa daun ketapang

memiliki kemampuan antibakteri terhadap A. hydrophila, Streptococcus sp., dan Vibrio

sp., sedangkan daun sembung dan batang pisang memiliki kemampuan antibakteri

terhadap A. hydrophila dan Streptococcus sp.

Senyawa dari daun sembung yang diduga aktif sebagai antibakteri adalah

flavonoid dan sesquiterpent (Sakeeet al., 2012). Kandungan dari pisang yang

22

diperkirakan memiliki kemampuan antibakteri adalah alkaloid, tannin, flavonoid,

saponin, dan steroid (Zafar, 2011). Kemampuan antibakteri ekstrak daun ketapang

dapat disebabkan oleh senyawa fenol, triterpenoid, dan tanin yang berdasarkan analisis

fitokimia terbukti terkandung dalam daun ketapang (Sumetriani, 2010).

C. Uji MIC dan MBC

Uji MIC (Minimum Inhibtory Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal

Concentration) dilakukan terhadap ekstrak bahan yang memiliki aktivitas antibakteri

tinggi yaitu daun ketapang. Uji MIC menggunakan metode agar well diffusion method

dalam mikroplate dengan tiga ulangan. Konsentrasi bakteri yang digunakan adalah 4-5

x 108

cfu/mlsesuai standar 0,5 McFarland. Konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam

uji ini adalah 40 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, dan 1,25 mg/ml,

sedangkan konsentrasi antibiotik Ciprofloxacin yang digunakan adalah 2 mg/ml, 1

mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, dan 0,0625 mg/ml. Kontrol positif yang

digunakan adalah TSB tanpa bakteri dan tanpa ekstrak yang memiliki hasil bening

tidak ditumbuhi bakteri, sedangkan kontrol negatifnya adalah TSB dengan bakteri

tanpa ekstrak dengan hasil keruh ditumbuhi bakteri. Hasil uji MIC dijelaskan dalam

Tabel 4.3.

Tabel 4.3. Hasil uji MIC (Minimum Inhibtory Concentration) beberapa ekstrak daun

ketapang terhadap beberapa bakteri patogen ikan (mg/ml).

Ekstrak Bakteri

A. hydrophila Streptococcus sp. Vibrio sp.

KEA 5 2,5 ≤1,25

KE 10 10 5

KA 10 10 5

Ciprofloxacin ≤0,0625 ≤0,0625 ≤0,0625

Keterangan:

KEA: Ekstrak etil asetat daun ketapang

KE: Ekstrak etanol daun ketapang

KA: Ekstrak akuades daun ketapang

Nilai MIC terendah didapati ekstrak etil asetat daun ketapang terhadap bakteri

Vibrio sp., sedangkan nilai MIC tertinggi terdapat pada ekstrak etanol dan akuades daun

ketapang terhadap bakteri Aeromonas hydrophila dan Streptococcus sp. Bakteri yang

23

paling resisten terhadap ekstrak daun ketapang adalah bakteri A. hydrophila, sedangkan

bakteri yang paling sensitif terhadap ekstrak daun ketapang adalah bakteri Vibrio sp.

Bahan pembanding yaitu antibiotik Ciprofloxacin memiliki nilai MIC yang rendah

terhadap ketiga bakteri yaitu sebesar ≤0,0625 mg/ml. Semakin rendah nilai MIC suatu

bahan berarti semakin kecil konsentrasi yang dibutuhkan ekstrak untuk menghambat

bakteri yang artinya semakin baik kemampuan bahan tersebut dalam menghambat

pertumbuhan bakteri.

Nilai MIC berdasarkan standar Coyle (2005)yang termasuk susceptible atau

sensitif adalah ≤2 µg/ml, intermediate adalah 4 µg/ml, dan resisten adalah ≥ 8 µg/ml.

Berdasarkan standar tersebut maka bakteri A. hydrophila termasuk resisten terhadap

ketiga ekstrak daun ketapang, bakteri Streptococcus sp. termasuk resisten terhadap

ketiga ekstrak daun ketapang, dan bakteri Vibrio sp. termasuk resisten terhadap ekstrak

etanol dan akuades daun ketapang. Nilai MIC ekstrak daun ketapang yang tergolong

resisten tersebut menunjukkan bahwa ekstrak daun ketapang belum cukup efektif dan

kuat dalam menghambat bakteri uji. Nilai MIC ekstak etil asetat daun ketapang yang

belum diketahui pasti konsentrasinya yaitu ≤1,25 mg/ml belum dapat diinterpretasikan

secara kualitatif.

Uji MIC terhadap A. hydrophilamenggunakan madu dan ekstrak tumbuhan obat

seperti Carissa edulis, Erythrina lysistemon, Momordica balsamina, Psidium guajava

and Ficus syscomorusdilakukan oleh Ramalivhanaet al. (2014) memiliki rerata hasil

1,25 ± 0,513 mg/ml.Nilai MIC tersebut lebih rendah dibandingkan nilai MIC ketiga

ekstrak daun ketapang pada penelitian ini. Uji MIC terhadap bakteri Streptococcus iniae

dilakukan oleh Tukmechi et al. (2010) menggunakan ekstrak etanol propolis memiliki

hasil 0,193 mg/ml. Nilai MIC tersebut lebih rendah dibandingkan nilai MIC ketiga

ekstrak daun ketapang pada penelitian ini. Uji MIC terhadap bakteri Vibrio alginolyticus

dilakukan oleh Marzouk et al. (2011) menggunakan ekstrak akuades biji dan buah

Citrullus colocynthis memiliki rerata hasil 0,367 ± 0,289 mg/ml. Nilai MIC tersebut

lebih rendah dibandingkan nilai MIC ekstrak etanol dan akuades daun ketapang pada

penelitian ini.

24

Uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration) dilakukan dengan

menginokulasikan sampel dari dalam sumuran ke medium TSA petri setelah 48 jam

inkubasi dengan dua ulangan. Kontrol positif yang digunakan adalah TSB tanpa bakteri

dan tanpa ekstrak yang memiliki hasil bening tidak ditumbuhi bakteri pada bekas

inokulasi jarum ose di medium TSA petri, sedangkan kontrol negatifnya adalah TSB

dengan bakteri tanpa ekstrak dengan hasil koloni bakteri tumbuh tebal pada bekas

inokulasi jarum ose di medium TSA petri. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam

inkubasi. Hasil Uji MBC dipaparkan dalam Tabel 4.4.

Tabel 4.4. Hasil uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration)beberapa ekstrak

daun ketapang terhadap beberapa bakteri patogen ikan(mg/ml).

Bahan Bakteri

A. hydrophila Streptococcus sp. Vibrio sp.

KEA 40 40 ≤1,25

KE >40 10 10

KA >40 >40 20

Ciprofloxacin 0,25 2 0,25

Keterangan:

KEA : Ekstrak etil asetat daun ketapang

KE : Ekstrak etanol daun ketapang

KA : Ekstrak akuades daun ketapang

Nilai MBC yang terendah didapati pada ekstrak etil asetat daun ketapang

terhadap Vibrio sp. yaitu ≤1,25 ± mg/ml. Nilai MBC tertinggi yaitu sebesar >40 mg/ml

didapati pada ekstrak akuades daun ketapang terhadap bakteri A. hydrophiladan

Streptococcus sp, serta ekstrak etanol daun ketapang terhadap A. hydrophila. Bakteri

yang terlihat sensitif terhadap ekstrak daun ketapang adalah bakteri Vibrio sp.,

sedangkan bakteri yang terlihat resisten terhadap ekstrak daun ketapang adalah bakteri

A. hydrophila.

Penelitian yang dilakukan oleh Akharaiyiet al. (2011) mengungkapkan bahwa

ekstrak akuades daun ketapang muda memiliki nilai MBC 100 mg/ml terhadap Bacillus

cereus, 115 mg/ml terhadap Staphylococcus aureus, 145 mg/ml terhadap Pseudomonas

aeruginosa, 100 mg/ml terhadap Salmonella typhi, 145 mg/ml terhadap Proteus

mirabilis, 100 mg/ml terhadap Shigella dysenteriae, dan100 mg/ml terhadap Escherichia

coli. Rerata nilai MBC yang didapat dari penelitian tersebut adalah 115 mg/ml. Hasil uji

25

MBC ekstrak daun ketapang pada penelitian ini yang memiliki nilai lebih rendah

daripada rerata nilai MBC penelitian Akharaiyi et al. (2011) adalah etil asetat ekstrak

daun ketapang pada bakteri A. hydrophila, Streptococcus sp. dan Vibrio sp., ekstrak

etanol daun ketapang pada bakteri Streptococcus sp. dan Vibrio sp., dan ekstrak akuades

daun ketapang pada bakteri Vibrio sp.

Hasil uji MIC dan MBC ini menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun

ketapang memiliki kemampuan bacteriostatic dan baktericidal terhadap ketiga bakteri

uji, ekstrak etanol daun ketapang memiliki kemampuan bacteriostatic terhadap ketiga

bakteri uji dan baktericidal terhadap bakteri Streptococcus sp. dan Vibrio sp., dan

ekstrak akuades daun ketapang memiliki kemampuan bacteriostatic terhadap ketiga

bakteri uji dan baktericidal terhadap bakteri Vibrio sp.

Semakin rendah nilai MBC suatu bahan berarti semakin kecil konsentrasi yang

dibutuhkan ekstrak untuk membunuh bakteri yang artinya semakin baik kemampuan

bahan tersebut dalam membunuh pertumbuhan bakteri. Ekstrak etil asetat daun ketapang

terhadap bakteri Vibrio sp. merupakan hasil terbaik pada uji MIC dan MBC ini. Hasil

terbaik pada uji MIC dan MBC kemudian diuji bioautografi dan diidentifikasigolongan

senyawa yang menghambat bakteri.

D. Uji Bioautografi

Uji bioautografi dilakukan terhadap hasil terbaik dari uji MIC dan MBC yaitu

ekstrak etil asetat daun ketapang terhadap bakteri Vibrio sp. Uji bioautografi

menggunakan plat KLT yang dicelupkan dengan bakteri Vibrio sp. dalam medium soft

agar. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam untuk mengetahui spot ekstrak yang aktif

menghambat bakteri Vibrio sp. Bakteri Vibrio sp. yang digunakan dalam uji bioautografi

adalah bakteri Vibrio sp. dengan kepadatan 1,1 x 108

cfu/ml dan 5 x 106cfu/ml sesuai

standar 0,5 McFarland. Hasil pengamatan uji bioautografi disajikan pada Gambar 4.1.

26

1 2 3

Gambar 4.1. Hasil uji bioautografi. 1. Pemisahan ekstrak etil asetat pada plat KLT

dalam sinar UV 254. 2. Ekstrak etil asetat daun ketapang dengan bakteri Vibrio sp.

1,1 x 108

cfu/ml. 3. Ekstrak etil asetat daun ketapang dengan bakteri Vibrio sp. 5 x

106cfu/ml.

Pemisahan senyawa ekstrak etil asetat daun ketapang pada plat KLT yang

disinari sinar UV 254 menunjukkan 8spot senyawa yang berbeda berdasarkan warna

yang terlihat. Spot senyawa pertama dari pengembangan terjauh berwarna kuning, kedua

berwarna ungu, ketiga berwarna coklat kehitaman, keempat berwarna abu-abu, kelima

berwarna hijau, keenam berwarna hijau gelap, ketujuh berwarna hijau keunguan, dan

senyawa kedepalan berwarna hijau. Hasil uji bioautografi menunjukkan bahwa spot

senyawa ekstrak etil asetatdaun ketapang yang aktif menghambat bakteri Vibrio sp.

adalah spot senyawa urutan ketiga dari pengembangan terjauh yang berwarna coklat

kehitaman dan memiliki nilai rerata Rf 0,515. Rerata diameter zona hambat dari spot

yang aktif menghambat bakteri tersebut adalah 0,65 cm.

E. IdentifikasiGolongan Senyawa yang Menghambat Bakteri

Identifikasi golongan senyawa dilakukan terhadap spot senyawa yang diketahui

aktif menghambat bakteri Vibrio sp. pada uji bioautografi. Identifikasi ini menggunakan

lima reagen berbeda, yaitu reagen asam sulfat, reagen anisaldehid-asam sulfat, reagen

vanilin-asam sulfat, reagen ninhidrin, dan reagen FeCl3. Hasil identifikasi golongan

senyawa disajikan pada Gambar 4.2.

27

1 2 3 4 5

Gambar 4.2. Hasil identifikasi golongan senyawa yang menghambat Bakteri. 1.

Reagen asam sulfat. 2. Reagen anisaldehid-asam sulfat. 3. Reagen vanilin-asam

sulfat. 4. Reagen ninhidrin. 5. Reagen FeCl3.

Spot yang dilingkari pada gambar plat KLT merupakan spot aktifmenghambat

bakteri Vibrio sp.pada uji bioautografi. Identifikasi dengan reagen asam sulfat

menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan spot di dalam lingkaran tidak berubah

merah yang berarti spot tersebut bukan merupakan senyawa terpenoid. Identifikasi

dengan reagen anisaldehid-asam sulfat menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan

spot di dalam lingkaran tidak berubah menjadi merah hingga ungu yang berarti spot

tersebut bukan merupakan senyawatriterpen. Identifikasi dengan reagen vanilin-asam

sulfat menunjukkan hasil yang negatif dengan ditandai spot di dalam lingkaran tidak

berubah menjadi biru, biru violet, atau kekuningan yang berarti spot tersebut bukan

merupakan golongan senyawa triterpen. Identifikasi dengan reagen ninhidrin

menunjukkan hasil yang negatif yang ditandai dengan spot di dalam lingkaran tidak

berubah menjadi violet yang berarti spot tersebut bukan merupakan golongan asam

amino dan protein. Identifikasi dengan reagen FeCl3menunjukkan hasil positif yang

ditandai dengan spot di dalam lingkaran berubah menjadi kehijauan yang berarti spot

aktif penghambat bakteri Vibrio sp. dalam lingkaran tersebut termasuk golongan

senyawa fenol. Hasil yang serupa juga diungkapkan oleh penelitian Ramdhani (2008)

yang menunjukkan bahwa golongan senyawa yang bertanggung jawab dalam aktivitas

antibakteri terhadap Staphylococcus aerus pada ekstrak ketapang metanol adalah

golongan senyawa fenol.

Golongan senyawa fenol merupakan salah satu metabolit sekunder tumbuhan.

28

Metabolit sekunder tumbuhan diklasifikasikan menjadi tiga golongan utama, yaitu

golongan senyawa terpen, fenol, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Metabolit

sekunder tumbuhan adalah senyawa kimia yang diproduksi tumbuhan yang tidak

memiliki fungsi pertumbuhan, fotosintesis, reproduksi dan fungsi primer lainnya.

Banyak metabolit sekunder yang memiliki efek negatif dan menjadi racun bagi

herbivora dan mikrobia sebagai mekanisme pertahanan diri dari tumbuhan. Senyawa

yang termasuk golongan fenol adalah asam fenolik, coumarins, lignans, flavonoid,

tannin, dan lignin(Schultz, 2014).

Fenol atau benzenol adalah senyawa yang mempunyai gugus hidroksil yang

terikat langsung dengan cincin benzena atau benzenoid. Struktur fenol yang paling

sederhana adalah C6H5OH. Adanya grup –OH membuat fenol mampu berikatan dengan

hidrogen. Fenol memiliki tingkat keasaman yang lebih tinggi dibanding alkohol dan

lebih rendah dibanding asam karboksil. Fenol merupakan senyawa polar yang

polaritasnya di bawah alkohol. Berat molekul fenol adalah 94 g/mol, titik didih 1320

C,

dan tingkat kelarutannya di air pada suhu 250 C adalah 0,05 g/100 ml (Carey, 2000).

Golongan senyawa fenol dari metabolit sekunder tumbuhan yang dikenal

memiliki kemampuan antibakteri diantaranya adalah flavonoid, tannin, asam fenolat,

dan lignan. Flavonoid adalahgolongan senyawa fenol yang mempunyai struktur dasar

flavan nucleus yang terdiri dari 15 atom karbon yang tersusun dalam tiga cincin (C6-C3-

C6) yang disebut sebagai cincin A, B, dan C (Pietta, 2000). Flavonoid secara luas

terdapat di berbagai jenis tumbuhan. Flavonoid ditemukan di buah, sayur, kacang, biji,

batang, bunga, dan daun.Ekstrak dan preparat fitokimia dari berbagai spesies tumbuhan

yang kaya kandungan flavonoid dilaporkan memiliki kemampuan antibakteri. Riset yang

lebih jauh mengindentifikasi berbagai jenis flavonoid seperti apigenin, galangin,

quercetin, isoflavon, flavanon, dan chalcones memiliki aktivitas antibakteri. Mekanisme

antibakteri dari berbagai macam flavonoid di antaranya adalah dengan menghambat

sintesis asam nukleat pada sintesis DNA dan RNA bakteri, menghambat fungsi

membran sitoplasma seperti mengurangi kecairan (fluidity) membran sel, merusak

membran sel bakteri, serta menghambat motilitas bakteri, dan menghambat metabolisme

energi bakteri seperti menghambat konsumsi oksigen, menghambat NADH-cytochrome

29

c reductase,serta menghambat sintesis makromolekul bakteri (Cushnie, 2005).

Tannin menurut Hagerman (2002) adalah golongan senyawa fenol yang mampu

mempresipitasi protein. Berdasarkan struktur tannin, Khanbabaee dan Ree (2001)

mendefinisikan tannin adalah metabolit sekunder tumbuhan tingkat tinggi dari golongan

polifenol yang merupakan ester dari galloyl dan derivatif galloyl, yang galloyl atau

derivatif galloyl-nya tersambung ke berbagai polyol-, catechin-, dan inti triterpenoid

(gallotannins, ellagitannins, dan complex tannins), atau merupakan oligomer dan

polimer proanthocyanidins yang dapat menunjukkan pemasangan interflavanyl dan

bentuk subtitusi yang berbeda (condensed tannins). Berbagai uji biologi terhadap tannin

sudah dilakukan secara luas dan menunjukkan bahwa tannin memilikikemampuan

antibakteri. Penelitian yang dilakukan oleh Funatogawa et al. (2003) mengungkapkan

salah satu mekanisme antibakteri yang dimiliki tannin adalah dengan merusak membran

sel bakteri. ekanisme antimikrobia yang dimiliki tannin

diperkirakan berhubungan dengan kemampuan tannin dalam menonaktifkan adhesin

mikrobia, enzim, dan protein transport, karena properti tannin yang dikenal sebagai

astringency.

Lignan merupakan grup dimeric phenylpropanoid yang memiliki dua C6-C3 yang

berikatan dengan karbon tengah (C8). Lignan sudah diuji memiliki kemampuan

antibakteri terhadap Mycobacteria dan patogen pada mulut manusia (Cunha, 2012).

Asam fenolat dari tumbuhan diketahui memiliki kemampuan antibakteri. Merkl et al

(2010) sudah menguji antibakteri asam fenolatterhadap Bacillus cereus, Listeria

monocytogenes dengan hasil yang menyatakan bahwa asam fenolat memiliki

kemampuan antibakteri. Beberapa derivatif asam fenolat yang berhasil diisolasi dalam

penelitian itu adalah protocatechuic acid, gentisic acid, vanilic acid, ferulic acid, dan

caffeic acid.

Penelitian lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui lebih spesifiksenyawa

golongan fenol pada ekstrak etil asetat daun ketapang yang aktif menghambat bakteri

Vibrio sp. Flavonoid dapat dideteksi dengan penambahan serbuk magnesium 0,1 mg, 0,4

ml amil alkohol, dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Reaksi positif

ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil

30

alcohol (Putranti, 2013).Keberadaan tannin dapat diketahui dengan terbentuknya

endapan setelah penambahan garam gelatin dalam ekstrak etanol bahan uji. Pereaksi lain

yang sering digunakan untuk identifikasi tannin adalah FeCl3, garam fast blue, dan

prusian blue. Tannin dengan pereaksi FeCl3 akan membentuk kompleks yang berwarna

biru sampai hitam, tannin dengan garam fast blue akan berwarna merah karena

terbentuknya senyawa diazo, dan tannin akan berwarna biru dengan prusian blue karena

terjadi oksidasi dengan adanya garam feri (Mulyani dan Laksana, 2011).

Lignan kasar (crude lignan)dapat diisolasi dengan mengekstrak sampel

menggunakan larutan diaxam:etil alkohol dengan rasio 1:8 selama 24 jam. Selanjutnya

suspensi disaring dan ekstrak dievaporasi dengan suhu 400

C dalam tekanan rendah (Al-

Jumaily et al., 2012). Asam fenolat dapat diisolasi dengan melarutkan ekstrak pekat

dalam air panas dan disaring lalufraksi air diambil dan diasamkan dengan asam sulfat

10% sampai pH 3. Larutan asam diekstrak dengan eter, lalu fraksi eter dicuci dengan air

suling dan diekstraksi dengan natrium karbonat 20%. Fraksi basa diambil dan diasamkan

dengan asam sulfat 10% sampai pH 3 dan diekstraksi dengan eter. Fraksi eter diambil

lalu ditambahkan natrium sulfat anhidrat dan disaring. Fraksi eter diambil dan diuapkan

hingga kering (Wijono, 2004).