BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangTeknik kultur jaringan sebenarnya sangat sederhana, yaitu

suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan dipelihara dalam medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan cara demikian sebaian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan kedlam medium diferensiasi yang cocok, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi planlet dlama jumlah yang besar.

Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada prinsipnya semua jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya.

1.2 Tujuana. Untuk mengetahui definisi isolasi eksplan.b. Untuk mengetahui definisi inkubasi eksplan.c. Untuk mengetahui tahapan kultur jaringan.d. Untuk faktor penentu keberhasilan kultur jaringan.e. Untuk mengetahui macam-macam kultur organ.

1

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Isolasi Eksplana. Isolasi Eksplan adalah Pemisahan atau pengucilan sel yang

akan dieksplan terhadap bahan yang akan ditanam pada media kultur.

b. Isolasi Eksplan adalah Perlindungan atau penyekatan yang dilakukan pada bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan tanam pada sebuah media tanam (plantlet).

(Zulkifli, 2003)

2.2 Definisi Inkubasi Eksplana. Inkubasi Eksplan adalah masa atau tenggang waktu antara

masuknya kontaminan terhadap bahan tanam (Media tanam) yang akan di tanam.

b. Inkubasi Ekpslan adalah waktu yang digunakan atau yang diperlukan oleh penyebab penyakit atau kontaminan untuk masuk ke eksplan tanaman.

(Hanifah, 2007)

2.3 Tahap Kultur JaringanTahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:1) Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan

Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang pertama harus dilakukan adalah memilih bahan induk yang akan diperbanyak. Untuk tanaman yang akan di kultur jaringkan. Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukkan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca (greenhouse) agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas

2

dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro.

(Yusnita, 2005)2) Pembuatan Media

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenis maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

3) InisiasiTujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru. Inisiasi adalah pengambilan

eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. (Wetherell,1975)

4) Sterilisasi Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur

jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi kultur jaringan juga harus steril.

3

5) Multiplikasi Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Ini dilakukan untuk menghindari adanya kontaminasi yang

menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

(Williams, 2003)6) Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar

Tujuan dari tahap ini adalah untuk membentuk akar dan pucuk tanaman yang cukup kuat untuk dapat bertahan hidup sampai saat dipindahkan dari lingkungan in-vitro ke

lingkungan luar. Dalam tahap ini, kultur tanaman akan memperoleh ketahanannya terhadap pengaruh lingkungan, sehingga siap untuk diaklimatisasikan (Williams, 1975). Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).Dalam Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar. Ada beberapa hal perlakuan yang bisa dilakukan sebagai berikut :

4

1. Mengondisikan kultur di tempat yang pencahaannya berintensitas lebih tinggi (contohnya 10000 lux) dan suhunya lebih tinggi.

2. Pemanjangan dan pemanjangan tnas mikro dilakukan dalam media kultur dengan hara mineral dan sukrosa lebih rendah dan konsentrasi agar-agar lebih tinggi.

(Lilik Setyorini, 2006)7) Aklimatisasi

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan

sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

(Yusnita, 2005)

2.4 Faktor Penentu Keberhasilan Kultur Jaringana. Genotipe Tanaman

Salah satu faktor yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis eksplan dalam kultur in-vitro adalah genotip tanaman asal eksplan diisolasi. Hasil-hasil penelitian menunjukkan bahwa respon masing-masing eksplan tanaman sangat bervariasi tergantung dari spesies, bahkan varietas, atau tanaman asal eksplan tersebut. Pengaruh genotip ini umumnya berhubungan erat dengan faktor-faktor lain yang mempengaruhi pertumbuhan eksplan, seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur. Oleh karena itu, komposisi media, zat

5

pengatur tumbuh dan lingkungan pertumbuhan yang dibutuhkan oleh masing-masing varietas tanaman bervariasi meskipun teknik kultur jaringan yang di gunakan sama. Perbedaan respon genotip tanaman tersebut dapat diamati pada perbedaan eksplan masing-masing varietas untuk tumbuh dan beregenerasi. Masing-masing varietas tanaman berbeda kemampuannya dalam merangsang pertumbuhan tunas aksilar, baik jumlah tunas maupun kecepatan pertumbuhan tunas aksilarnya. Hal serupa juga terjadi pada pembentukan kalus, laju pertumbuhan kalus serta regenerasi kalus menjadi tanaman lengkap baik melalui pembentukan organ-organ adventif maupun embrio somatik. Regenerasi dan perkembangan organ adventif dan embrio somatik juga sangat ditentukan oleh varietas tanaman induk. Perbedaan pengaruh genetik ini disebabkan karena perbedaan kontrol genetik dari masing-masing varietas serta jenis kelamin tanaman induk yang dijadikan media tanam untuk kultur organ tersebut.

b. Media KulturBeberapa jenis formulasi media bahkan digunakan

secara umum untuk berbagai jenis eksplan dan varietas tanaman, seperti media MS. Namun ada juga beberapa jenis media yang diformulasikan untuk tanaman-tanaman tertentu misalnya WPM,VW dll. Media-media tersebut dapat digunakan untuk berbagai tujuan seperti perkecambahan biji, kultur pucuk, kultur kalus, regenerasi kalus melalui organogenesis dan embriogenesis. Media yang dibutuhkan untuk perkecambahan biji, perangsangan tunas-tunas aksilar umumnya lebih sederhana dibandingkan dengan media untuk regenerasi kalus baik melalui organogenesis maupun embryogenesis.

Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya.

6

Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut.Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui percobaan-percobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan untuk mengetahui komposisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan.

c. Lingkungan tumbuh Suhu

Umumnya temperatur yang digunakan dalam kultur in vitro lebih tinggi dari kondisi suhu invivo. Tujuannya adalah untuk mempercepat pertumbuhan dan morfogenesis eksplan.Pada sebagian besar laboratorium, suhu yang digunakan adalah konstan, yaitu 25°C (kisaran suhu 17-32°C).Tanaman tropis umumnya dikulturkan pada suhu yang sedikit lebih tinggi dari tanaman empat musim, yaitu 27°C (kisaran suhu 24-32°C). Bila suhu siang dan malam diatur berbeda, maka perbedaan umumnya adalah 4-8°C, variasi yang biasa dilakukan adalah 25°C siang dan 20°C malam, atau 28°C siang dan 24°C malam.

Kelembaban RelatifKelembaban relatif dalam botol kultur dengan mulut

botol yang ditutup umumnya cukup tinggi, yaitu berkisar antara 80-99%. Jika mulut botol ditutup agak longgar maka kelembaban relatif dalam botol kultur dapat lebih rendah dari 80%. Sedangkan kelembaban relatif di ruang kultur umumnya adalah sekitar 70%. Jika kelembaban relatif ruang kultur berada dibawah 70% maka akan mengakibatkan media dalam botol kultur (yang tidak tertutup rapat) akan cepat menguap dan kering sehingga eksplan dan plantlet yang dikulturkan akan cepat kehabisan media. Namun kelembaban udara dalam botol kultur yang terlalu tinggi menyebabkan tanaman tumbuh abnormal yaitu daun lemah, mudah patah, tanaman kecil-

7

kecil namun terlampau sukulen. Kondisi tanaman demikian disebut vitrifikasi atau hiperhidrocity. Sub-kultur ke media lain atau menempatkan planlet kecil ini dalam botol dengan tutup yang agak longgar, tutup dengan filter, atau menempatkan silica gel dalam botol kultur dapat membantu mengatasi masalah ini.

CahayaSeperti halnya pertumbuhan tanaman dalam kondisi

in vitro, kuantitas dan kualitas cahaya, yaitu intensitas, lama penyinaran dan panjang gelombang cahaya mempengaruhi pertumbuhan eksplan dalam kultur invitro. Pertumbuhan organ atau jaringan tanaman dalam kultur invitro umumnya tidak dihambat oleh cahaya, namun pertumbuhan kalus umumnya dihambat oleh cahaya.

Pada perbanyakan tanaman secara invitro, kultur umumnya diinkubasikan pada ruang penyimpanan dengan penyinaran.Tunas-tunas umumnya dirangsang pertumbuhannya dengan penyinaran, kecuali pada teknik perbanyakan yang diawali dengan pertumbuhan kalus. Sumber cahaya pada ruang kultur ini umumnya adalah lampu flourescent (TL). Hal ini disebabkan karena lampu TL menghasilkan cahaya warna putih, selain itu sinar lampu TL tidak meningkatkan suhu ruang kultur secara drastis (hanya meningkat sedikit). Intensitas cahaya yang digunakan pada ruang kultur umumnya jauh lebih rendah (1/10) dari intensitas cahaya yang dibutuhkan tanaman dalam keadaan normal. Intensitas cahaya dalam ruang kultur untuk pertumbuhan tunas umumnya berkisar antara 600-1000 lux. Perkecambahan dan inisiasi akar umumnya dilakukan pada intensitas cahaya lebih rendah.

Kondisi EksplanUmur eksplan sangat berpengaruh terhadap

kemampuan eksplan tersebut untuk tumbuh dan beregenerasi.Umumnya eksplan yang berasal dari jaringan tanaman yang masih muda (juvenil) lebih mudah tumbuh dan beregenerasi dibandingkan dengan jaringan

8

yang telah terdiferensiasi lanjut. Jaringan muda umumnya memiliki sel-sel yang aktif membelah dengan dinding sel yang belum kompleks sehingga lebih mudah dimodifikasi dalam kultur dibandingkan jaringan tua. Oleh karena itu, inisiasi kultur biasanya dilakukan dengan menggunakan pucuk-pucuk muda, kuncup-kuncup muda, hipokotil, inflorescence yang belum dewasa, dll. Jika eksplan diambil dari tanaman dewasa, rejuvenilisasi tanaman induk melalui pemangkasan atau pemupukan dapat membantu untuk memperoleh eksplan muda agar kultur lebih berhasil.

(Yusnita, 2005)

2.5 Macam-Macam Kultur Organa. Kultur Biji (Seed Culture), kultur yang bahan tanamnya

menggunakan biji atau seedling.Tujuan Kultur Biji: Mempercepat waktu kecambah. Mengatasi masalah tanaman langka. Mempelajari kecepatan pertumbuhan. Mendapatkan biji steril untuk mengatasi kontaminasi

pada eksplan yang dibudidayakan.b. Kultur Organ (Organ Culture), merupakan budidaya yang

bahan tanamnya menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dan lain-lain.

c. Kultur Kalus (Callus Culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya.

d. Kultur Suspensi Sel (Suspension Culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.

e. Kultur Protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar

9

membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).Tujuan Kultur Protoplas: Mempelajari komponen penyusun sel (organela). Untuk dapat melakukan fusi protoplas. Mendapatkan tanaman hibrid dan cybrid somatic. Digunakan dalam trasplantasi dan transformasi genetic.

f. Kultur Haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen (kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.

g. Kultur EmbrioMemisahkan embrio yang belum dewasa dan

menumbuhkan secara in-vitro. Tujuan Kultur Embrio: Memperpendek waktu berkecambah, menguji kecepatan viabilitas biji, memperbanyak tanaman langka seperti Kelapa kopyor (mempunyai embrio yang lunak). Memperoleh hibrid yang langka seperti embrio pada keadaan normal sering mati pada awal tingkat perkembangannya.

(Yusnita, 2005)

10

BAB III

METODOLOGI

3.1Alat, Bahan dan Fungsi Alat:

a. Gelas Ukur 100 ml (3 buah) : sebagai wadah larutan fungisida, detergen dan desinfektan

b. Neraca Digital : untuk menimbang berat fungisida dan detergen

c. Gelas Ukur : untuk mengukur volume baycleand. Botol Kultur : sebagai tempat media kultur organe. Pisau : untuk memotong jaringan tanamanf. Penyaring : untuk wadah organ ketika dibilas dengan air

mengalirg. Cawan Petri : untuk alas pemotongan organ tanaman ketika

di dalam LAFh. Spatula : untuk mengaduk larutani. Bunsen : untuk memanaskan alat yang akan dipakaij. LAFC : sebagai tempat steril penanaman organ kedalam

botol kulturk. Kamera : untuk dokumentasil. Stopwatch : untuk mengukur ketepatan waktu perlakuan

Bahan:a. Tunas Krisan : sebagai bahan kultur organb. Aquades : untuk membersihkan alat sebelum dipakai dan

membilas jaringan tanamanc. Banlate 3% : sebagai fungisidad. Detergen 5% : sebagai pembersih kotoran pada organe. Bayclean/Chorox : sebagai desinfektanf. Kertas Whatman : untuk menyerap air pada tunasg. Plastik Wrap dan Alumunium Foil : untuk menutup botol

kulturh. Karet : untuk mengikat plastik wrap dan alumunium foili. Kertas Label : untuk memberi tanda botol kultur

11

3.2Cara Kerja Pembuatan Media Kultura. Sterilisasi Awal

Ambil eksplan dari tanaman hidup

Gojok eksplan dengan deterjen 10% (10 g/100 %) selama 5 menit

Bilas dengan air yang biasanya mengalir

Rendam dalam larutan fungisida 5 % (5 g/100 %) selama 5 menit

Bilas dengan air yang mengalir

Cuci dengan Clorox (Bayclean) 10 %

Aduk dengan spatula

Rendam dengan aquades steril

b. Penanaman EksplanPotong bagian bagian eksplan

Tanam semua bagian tadi kealam MS (tidak menancap hanya menempel)

12

Tutup botol kultur dengan plastic atau alumunium foil

Ikat dengan karet (nb: mulut tutup botol dipanaskan terlebih dahulu)

Lakukan pengamatan 3 hari sekali selama 2 minggu

Dokumentasi

3.3AnalisaPerlakuanLangkah pertama adalah menyiapkan alat dan bahan,

kemudian sterilisasi alat dan ambil bahan eksplan yang berasal dari tunas tanaman bunga krisan. Selanjutnya kocok tunas tersebut dengan larutan detergen selama 5 menit, setelah itu bilas dengan air mengalir. Rendam potongan tunas tadi dengan Banlate 3% yang berfungsi sbg fungisida selama 5 menit dan setelah itu baru bilas kembali dengan air mengalir. Cuci dengan chlorox 2% yang gunanya sebagai desinfektan dan aduk dengan menggunakan spatula. Dan yang terakhir adalah rendam pada aquades selama 5 menit.

Langkah selanjutnya untuk penanaman tunas adalah siapkan alat dan bahan. Kemudian sterilisasi alat yg ada pada lingkungan LAFC. Potong eksplan menjadi 3 bagian, tanam pada media MS, tutup botol dan ikat dengan karet. Lakukan pengamatan selama 2 minggu masing-masing 3 hari sekali dan juga dokumentasi.

13

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.2 Pembahasan

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

14

DAFTAR PUSTAKA

Setyorini, Lilik.2006. Tunas Kultur Jaringan/Kultur Organ Mikroorganisme/Biologi/Bioteknologi. Balai Pustaka Ilmiah : Jakarta.

Suryowinoto, M. 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Kanisius. Yogyakarta.

Syarifah Iis Aisyah, Surjono H. Sutjahjo, Rustikawati dan Catur Herison . 2009. Induksi Kalus Embriogenik pada Kultur In Vitro Jagung (Zea mays) dalam Rangka Peningkatan Keragaman Genetik Melalui Variasi Somaklonal. ISSN 1411 – 0067 Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian Indonesia. Edisi Khusus, No. 3 2007, Hlm. 344 - 350 344.

Wetherel.1975. Tissue Culture for Eksplaned To Plants. University of Chicago : USA.

Williams.2003. Teknik Multiplikasi Pada Kultur Organ. Bioteknologi Modern. Biologi : Tissue Culture of Multiplication For organisms. New York : USA.

Wulandari S., Wan Syafii dan Yossilia, 2004. Respon Eksplan Daun Tanaman Jeruk Manis (Citrus sinensis L.) Secara In Vitro Akibat Pemberian NAA Dan BA, Jurnal Biogenesis.

Yusnita.2005.Kultur Organ Tanaman Eksplan. Balai Pengakajian Ilmiah. Universitas Sudirman : Yogyakarta.

Zulkifli.2008.http://9fly.wordpress.com/2008/12/22/kultur-jaringan-tumbuhan/. Diakses tanggal 10 November 2012.

15