Rekayasa Tanaman

Genetika Molekuler

1

Yang akan dipelajariStruktur DNA, replikasi DNA dan struktur gen, Proses ekspresi gen (transkripsi dan translasi), Teknik DNA rekombinan dan tool-nya (enzim, vektor, sel inang, dsb) Teknik umum genetika molekuler (elektrophoresis, PCR, Southern blot dll).

2

Pendahuluan Genetika molekuler (GM) adalah kajian ilmu yang mempelajari struktur dan fungsi materi genetik (DNA, gen, pewarisan, variasi dll) pada level molekuler. Bidang ini mempelajari struktur DNA, struktur gen; bagaimana gen mengkodekan suatu produk (polipeptida/protein); dan teknik DNA rekombinan. Manfaat GM: untuk memuliakan tanaman dengan teknik molekuler: misalnya dg teknik kloning dan transfer gen. Animasi 1: Genes Animasi 2: Fenotipe

30,000 RNA

Central Dogma of Molecular Genetics The path of genetic information is often called the central dogmaReverse transcriptase

DNA

RNA

Protein

The Structure of DNA Chemically, DNA is made up of nucleotides Each nucleotide has a deoxyribose sugar, a phosphate group and an nitrogenous base The bases are of two main types: PurinesLarge bases: Adenine (A) Guanine (G)

PyrimidinesSmall bases: Thymine (T) Cytosine (C)

The DNA Double Helix- spiral staircase The two DNA strands are held together by weak hydrogen bonds between complementary base pairs A and T C and G

If the sequence on one strand is

Dimensions suggested by X-ray diffraction

ATACGCAT TATGCGTA

The others sequence must bePolyndromeThe two possible base pairs

Each chain is a complementary mirror image of the other So either can be used as templateto reconstruct the other

DNA structure

Hydrogen bonds

Phosphodiester bonds Antiparallel strands

How DNA Copies Itself (replication) The enzyme helicase first unwinds the double helix The enzyme primase puts down a short piece of RNA termed the primer DNA polymerase reads along each naked single strand adding the complementary nucleotide

DNA polymerase can only build a strand of DNA in one direction (5 to 3)leading strand is made continuously from one primer lagging strand is assembled in segments created from many primers

-

Each nucleotide strand serves as a template for building a new complementary strand

Replikasi DNA : tahapannyaa. Membukanya double-helix DNA oleh e. helicase, b. E. Primase menyediakan RNA primer

c. Sintesis DNA oleh e. polimerase, yangmemasangkan basa-basa nitogen, d. Replikasi berjalan dari ujung 5 ke 3.

e. Satu rantai dibentuk secara kontinyu(leading stand), rantai lainnya dibentuk secara diskontinue (lagging strand), dan dikenal sebagai fragment Okazaki. f. Selanjutnya kedua fragmen digabungkan oleh enzim ligase. Animasi 3. DNA replication

Struktur Gen DNA pada organisme tingkat tinggi, diklasifikasikan sebagai exons, pseudogenes dan non-coding DNA (introns, repetitive DNA dan transposon). Di dalam DNA terdapat gen yang tersusun secara linier di dalam kromosom. Gen-gen inilah yang mengendalikan karakter suatu organisme:

- karaktter morfologi, fisiologi (pertumbuhan & perkembangan), personality,kepekaan/ketahanan thd penyakit (Hama), dll.

Gb. Struktur Gen

Bagian-bagian gen

-

Enhancer ? Silencer? Promoter ? Exon (expressed sequence) ? Intron (intervening sequence) ? Terminator ? 5 UTR (untranslated region) ? 3 UTR ?

Gene expression Gene expression is the use of information in DNA to direct the production of proteins/polypeptide (proses pembentukan produk dari gen yang dapat berupa RNA atau polipeptida/protein, meliputi proses transkripsi dan translasi). Terdiri dari 2 step: Transkripsi adalah proses sintesis mRNA dimana DNA sebagai template yang dilakukan oleh RNA polimerase. Translasi adalah proses sintesis polipeptida/protein yang dilakukan oleh ribosom.

DNA sequence: other strand: mRNA: polypeptide:

5 ATGCCGTAT 3 3 TACGGCATA 5 5 AUGCCGUAU 3 Met Pro Tyr

Ekspresi Gen Gen mengkodekan polipeptida/protein, diantaranya: protein struktural, protein untuk sintesis DNA, replikasi dan pembelahan sel (DNA polymerase); protein untuk sintesis RNA (RNA polymerase); protein yang melakukan semua fungsi dasar metabolisme seluler; protein yang berperan dalam sistem kekebalan ataupun protein yang terlibat dalam respon/adaptasi organisme terhadap faktor lingkungan serta yang lainnya. Protein-protein tersebut sebagai hasil/produk dari proses ekspresi gen. Animasi 4a. Transcription, Animasi 4b. Translation

Jalur distribusi protein (Protein Targeting) pada lysosomes, the plasma membrane, or secretion

16

Transcription The transcriber is RNA polymerase It binds to one DNA strand at a site called the promoter It then moves along the DNA pairing complementary nucleotides

It disengages at a stop signal

The result is a complementary strand of mRNA (Messenger RNA)

Processing eukaryotic mRNA

Protect from degradation and facilitate translation

Different combinations of exons can generate different polypeptides via alternative splicing

Translation

Translation converts the order of the nucleotides of a gene into the order of amino acids in a protein The rules that govern translation are called the genetic code mRNAs are the blueprint copies of nuclear genes

mRNAs are read by a ribosome in three-nucleotide units, termed codons Each three-nucleotide sequence codes for an amino acid or stop signal

Overview of gene expression

The Genetic Code

The genetic code is (almost) universal

Regulasi ekspresi gen Regulasi gen diperlukan karena organisme multiseluler (eukaryot) memiliki ratusan jenis sel yang terspesialisasi fungsinya. house-keeping genes.? luxury genes..? Dengan adanya regulasi dalam ekspresi gennya, memungkinkan bagi sel untuk menghasilkan beragam tipe sel, sementara memiliki rangkaian genom yang sama.

DNA Rekombinan merupakan molekul DNA yang sudah dimanipulasi secara in vitro, terdiri dari 2 atau lebih DNA yang berasal dari sumber yang berbeda. Teknologi DNA rekombinan: - teknik isolasi (genomik or cDNA library), - manipulasi, - cloning (memperbanyak sekuens target) - transfer/ekspresi gen ke organisme target (transgenik). Animasi 5. DNA recombinan

Overview of DNA recombinant

An overview of how bacterial plasmids are used to clone genes

Tool dalam DNA Rekombinan: 1. enzim, terdiri dari : restriksi endonuklease: enzim yang memotong double stranded (ds) DNA pada sekuens yang spesifik (4-8 bp).

Enzim lainnya DNA ligase: enzim yang menggabungkan dua fragmen dsDNA, merangkaikan ikatan fosfodiester kedua ujung DNA.

polimerase: enzim yang mensintesis rangkaian polinukleotida baru komplemen dari template DNA atau RNA yang disintesis.

DNA Rekombinan2. Vektor adalah wahana yang digunakan untuk meng-klon segmen DNA (cloning vehicle). Umumnya sebuah vektor memiliki karakteristik/kemampuan: Autonomously replicating...? Memiliki Selectable marker gene...? Memiliki Multiple Cloning site? Bila untuk pengujian ekspresi, maka diperlukan regulatory element seperti promoter dan terminator.

Kecil dan mudah untuk dimanipulasi dan diisolasi.

Plasmid map (salah satu contoh vector)

DNA Rekombinan Vektor-vektor tersebut antara lain : plasmid ..? Bacteriophage ..? cosmid : hybrid antara plasmid dan phage yang dapat membawa DNA insert sebesar 45 kb. BAC (Bacterial Artificial Chromosome) : vektor yang dapat membawa DNA insert sebesar 300 kb. YAC (Yeast Artificial Chromosome): ragi yang sudah direkayasa memiliki: centromere, telomere, ori dan selectable marker.

DNA Rekombinan3. Sel inang (host cell) adalah organisme yang digunakan untuk memperbanyak (sampai jutaan copy) gen atau sekuens DNA yang dikehendaki. Bakteri Escherichia coli umumnya digunakan untuk keperluan ini, seperti strain E. coli DH5 alpha. Animasi 5. DNA rekombinan Animasi 6. Plasmid cloning

Gel Electrophoresis1. A method of separating mixtures of large molecules (such as DNA fragments or proteins) on the basis of molecular size and charge. 2. How its done

An electric current is passed through a gel containing the mixture Molecules travel through the medium at a different rates according to size and electrical charge: Agarose and polyacrylamide gels are the media commonly used for electrophoresis of proteins and nucleic acids.

Animasi 7. Agarose Gel

Figure 20.8 Gel electrophoresis of macromolecules

Figure 20.9 Using restriction fragment patterns to distinguish DNA from different alleles

Polymerase Chain Reaction (PCR) used to amplify/copy DNA The production/amplification of target DNA fragment exponentially - 2n 230 - 268,435,456 dsDNA molecule

These steps were repeated for 25-30 times: -Denaturation, 94o C -Annealing 45-72o C -Elongation/synthesis 72o CAnimasi 8. PCR

PCR Components needed for PCR Template DNA (small quantity) Primers (of known sequences) Themostable polymerase enzyme (mis.Taq) dNTP (addition of nucleotides) Mg++ (salt) Thermocycler (an equipment that changes temperature instantly)

PCR-Thermocycler

Umumnya PCR digunakan untuk: meng-klon gen yang dilakukan di luar organisme, yang kemudian diekspresikan ke vector, memperbanyak DNA dari sample yang sangat sedikit untuk analisis lebih lanjut, mendeteksi adanya agen infeksi yang sangat rendah konsentrasinya, mendeteksi DNA fosil hewan/tumbuhan yang sudah ribuan tahun punah, deteksi pre-natal diagnosis (ada tidaknya kelainan/genetic disorder).

Southern blotting

Application rDNA : Golden rice contrasted with ordinary rice

DNA Rekombinan3. Southern blot adalah teknik yang memungkinkan untuk mendeteksi gen/fragmen DNA yang kita teliti dengan DNA probe (pelacak, sekuens DNA yang komplemen dengan DNA target) yang memungkinkan untuk terjadinya hibridisasi: DNA-DNA. Dengan prinsip yang sama dengan Southern blot, telah dikembangkan pula teknik deteksi RNA, namanya northern blot (hibridisasi antara RNA dengan DNA probe), dan western blot (hibridisasi antara protein dengan antibody). Transgenic Rice Genetically modify plants to produce beta-carotene Beta Carotene is converted to vitamin A in humans Vitamin A deficiency leads to poor vision and high susceptibility to disease~70% of children