PowerPoint Presentation

Kloning dan karakterisasi gen baru cry8Ab1 dari Bacillus thuringiensis strain B-JJX dengan toksisitas khusus untuk larva scarabaeid (Coleoptera: Scarabaeidae)DI SUSUN OLEH :WAHID SULAIMAN (S901408003)GENETIKA MOLEKULER

Kloning dan karakterisasi gen baru cry8Ab1 dari Bacillus thuringiensis strain B-JJX dengan toksisitas khusus untuk larva scarabaeid (Coleoptera: Scarabaeidae)

PENDAHULUANUret ( eng : Grub ), larva kumbang scarabaeid (Coleoptera: Scarabaeidae), hama umum yang dapat menyebabkan kerusakan yang luas untuk tanaman dan tanaman termasuk biji-bijian, kapas, tanaman minyak, sayuran, tembakau, rumput dan tanaman lainnya.Peringkat pertama di semua jenis hama tanah di China.Karena uret hidup di lingkungan bawah tanah dan sampai batas tertentu dapat menghindari efek bahan kimia, pengendalian uret dengan bahan kimia biasanya tidak seefisien seperti yang diharapkan.

Di sisi lain, pengendalian hama kimia dapat menimbulkan risiko melalui residu kimia terhadap lingkungan dan kesehatan manusia dan hewan.Oleh karena itu, menemukan pendekatan preventif yang aman dan efektif untuk mengendalikan ulat merupakan suatu prioritas.Bacillus thuringiensis (Bt), adalah spesies Bacillus termasuk dalam banyak subspesies, dapat menghasilkan kristal yang memiliki toksisitas yang tinggi untuk berbagai serangga (Sanahuja et al. 2011). Karena fitur Bt tersebut, seperti aktivitas tinggi insektisida, spesifisitas relatif, dan aman bagi manusia dan hewan, telah diterapkan secara luas untuk kontrol hama pertanian, hama hutan, gudang dan hama sanitasi (Schnepf et al. 1998).

GenBentuk KristalBobot Protein (kDa)Insekta yang dipengaruhicry1 [several subgrup:A(a), A(b), A(c), B, C, D, E, F, G]bipiramida130-138larva lepidopteracry1 [subgrup A, B, C]kuboid69-71lepidoptera and dipteracry3 [subgrup A, B, C]Datar/tidak teratur73-74koleopteracry4 [subgrup A, B, C, D]bipiramida73-134dipteraCry5 - Cry9berbagai macam35-129berbagai macamB. thuringiensisdapat memproduksi dua jenis toksin, yaitu toksin kristal (Crystal, Cry) dan toksin sitolitik (cytolytic, Cyt). Toksin Cyt dapat memperkuat toksin Cry sehingga banyak digunakan untuk meningkatkan efektivitas dalam mengontrol insekta. Lebih dari 50 gen penyandi toksin Cry telah disekuens dan digunakan sebagai dasar untuk pengelompokkan gen berdasarkan kesamaan sekuens penyusunnya. Tabel di bawah ini merupakan klasifikasi toksin Bt pada tahun 1995Kloning dan karakterisasi gen cry dengan toksitas spesifik untuk uret menjadi penting dalam bidang pengendalian hama.Ekspresi gen cry8Ab1 di HD-73- dan aktifitas insektisida yang di lakukan dalam penelitian ini akan menjadi pioner untuk mengendalikan uret melalui gen cry baru untuk pembangunan rekayasa genetika mikroba atau tanaman transgenik tahan uret.

Metode dan Bahan Strain, plasmid, serangga dan media kulturBt strain B-JJX diisolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan dekat Yantai, Provinsi Shandong, China Timur, pada tahun 2006 menggunakan perlakuan thermal shock (Zhang et al. 2000). Strain disimpankan di China Center for Type Culture Collection (CCTCC), Wuhan, Cina (nomor koleksi : CCTCC AB 2.013.034). Bt acrystalliferous mutan strain HD-73-, Escherichia coli SSC110 dan ekspresi Bt vektor pSXY422b disediakan oleh Dr. Fu-ping Song, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences. E. coli DH5 dan vektor pBluescript SK (+) yang disimpan di laboratorium ini. Bt dan E. coli dikultur dalam medium LB pada 28 C dan 37 C.Dua spesies scarabaeid Asia, Holotrichia oblita dan Holotrichia parallela di kumpulkan dari lapangan di Chengyang District, Qingdao, Cina. kumbang dewasa diberi makan dengan daun willow dan disimpan di dalam ruangan 25 C sampai mereka meletakkan telur. Larva berkembang diberi makan dengan kentang selama 3 hari untuk bioassay. Satu spesies coleopteran, T. molitor, dan tiga spesies lepidopteran, Helicoverpa armigera, Spodoptera exigua, Mythimna separata diinkubasi pada 26 C, 85% RH dan penyinaran dari 16: 8 (L: D).

Holotrichia oblitaHolotrichia parallela Analisis PCR-RFLP dari B. thuringiensis strainPlasmid DNA diekstraksi dari 66 B. thuringiensis strain yand di isolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan di berbagai wilayah Provinsi Shandong, Cina, digunakan sebagai template untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifikasi. metode ekstraksi Bt DNA plasmid diikuti protokol dijelaskan oleh Shu et al. (2009). Identifikasi gen baru cry8 dilakukan dengan menggunakan metode PCR-RFLP yang di sempurnakan oleh Yu et al. (2006).Untuk amplifikasi gen cry8 dari Bt strain B-JJX, sebuah sepasang primer spesifik, primer forward JJX5 (5 - CGGGATCCGATGAGTCCAAATAAT-3) Dan JJX3 primer reverse JJX5 (5 -GCGTCGACTTACTCTACGTC-3) (ditandai dengan garis bawah menunjukkan Situs pemotongan BamHI atau SalI), yang dirancang dengan software Primer Premier 5.0 berdasarkan urutan cry8 gen baru dikutip dalam GenBank. PCR sebagai berikut: 94 C selama 5 menit dan 30 siklus denaturasi pada 94 C untuk 1 menit, anil di 54 C selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 C selama 4 menit diikuti dengan ekstensi akhir 10-menit pada 72 C. Perkiraan Produk PCR 3,5 kb panjang, dikonfirmasi oleh sequencing, diligasi dengan pBluescript SK (+) untuk membuat rekombinan pBlue-cry8. Plasmid rekombinan pBlue-cry8 diekstraksi dan analisis oleh pencernaan dengan BamHI dan SalI setelah di amflifikasi dalam E. coli DH5.Metode untuk ekstraksi E. coli plasmid, DNA. digesti, ligasi, dan transformasi diikuti protokol dari Sambrook et al. (1989). Sekuensing DNA dilakukan oleh United Gene Company (Shanghai, Cina). Urutan asam amino dari protein Cry8-jenis dan Cry1Aa protein yang didownload dari GenBank dan diedit menggunakan Bioedit software. Kemudian dibuat dendrogram menggunakan software MEGA5.Kloning dan karakterisasi gen cry8Ab1ORF dari cry8Ab1 gen dibuat dari pBlue-cry8 dipotong dengan BamHI dan SalI dimasukkan ke dalam vektor ekspresi pSXY422b untuk membangun rekombinan vektor ekspresi pSXYcry8. Kemudian pSXY-cry8 di rubah menjadi E. coli SCS110 untuk di methylasi, dan kemudian di elektroporasi ke Bt kristal mutan HD- 73- mengikuti metode Lereclus et al. (1989).ORF dari cry8Ab1 gen dibuat dari pBlue-cry8 dipotong dengan BamHI dan SalI dimasukkan ke dalam vektor ekspresi pSXY422b untuk membangun rekombinan vektor ekspresi pSXYcry8. Kemudian pSXY-cry8 di rubah menjadi E. coli SCS110 untuk di methylasi, dan kemudian di elektroporasi ke Bt kristal mutan HD- 73- mengikuti metode Lereclus et al. (1989).Sebuah klon positif, HD73-cry8Ab1, diidentifikasi dengan PCR dan kemudian di culturkan di LB agar plate yang berisi 25 g / mL eritromisin pada 28 C sampai spora dibentuk dan dirilis. Sel-sel, spora dan kristal parasporal dikumpulkan dan siap untuk di observasi mengunakan scanning electron mikroskopis dan analisis SDS-PAGE.Ekspresi gen cry8Ab1 di B. Thuringiensis acrystalliferous strain mutan. Bt strain HD-73-, HD73-cry8Ab1 dan Bt B-JJX dikultur dalam medium LB sampai spora dan kristal parasporal di lepaskan. Sel, spora dan kristal parasporal disusun oleh sentrifugasi 10.000 r / min selama 10 menit. Konsentrasi protein dalam sampel dianalisis menggunakan metode Bradford (Bradford 1976). Insektisida yang aktivitas Bt strain B-JJX, HD73-cry8Ab1, HD-73- terhadap H. oblita dan H. parallela dilakukan sesuai dengan metode Yu et al. (2006).Toksisitas insektisida Bt strain B-JJX, HD73- cry8Ab1, HD-73- terhadap H. armigera, S. exigua, M. separata, T. molitor dilakukan menurut metode Xue et al. (2005). Setiap bioassay diulang setidaknya tiga kali. Data bioassay yang dianalisis dengan menggunakan sistem pengolahan data DPS (Tang dan Zhang 2012).Bioassay aktivitas insektisida dari gen cry8Ab1HASILSkrining B. thuringiensis strain mengandung cry8-jenis gen menggunakan PCR-RFLPEnam puluh enam B. thuringiensis strain diisolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan dari Provinsi Shandong Cina disaring oleh PCR Metode dengan primer universal S5un8 / S3un8 yang diterapkan untuk identifikasi cry8-jenis gen. Sebuah fragmen sepanjang 1,2 kb diamplifikasi menggunakan cetakan DNA diisolasi dari Bt strain B-JJX (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa Bt strain B-JJX terkandung gen cry8-jenis yang dapat mengkodekan protein Cry8 berpotensi dengan aktivitas insektisida terhadap larva scarabaeid. 1,2 kb Produk PCR tidak dapat di digesti oleh DraI dan EcoO109I (data tidak ditunjukkan) dan pola PCR-RFLP ini berbeda dari cry8 dikenal gen, menunjukkan bahwa B-JJX mungkin berisi gen baru cry8-jenis. Pengamatan morfologi Bt strain B-JJX menunjukkan sel-sel adalah batang tunggal atau membentuk rantai. Setelah dikulturkan di piring LB di 28 C selama 3 hari, menghasilkan spora oval panjang dan bulat atau kristal parasporal cuboidal dalam berbagai ukuran.Kloning dan karakterisasi gen cry8Ab1Sebuah produk PCR 3,5 kb panjang sesuai dengan open reading frame dari gen cry8 diamplifikasi menggunakan sepasang primer spesifik, JJX5 dan JJX3, dirancang sesuai dengan cry8-gene type. Fragmen ini dimasukkan ke dalam vektor kloning pBluescript SK (+) yang menghasilkan generasi plasmid rekombinan pBlue-cry8 (Gbr. 1A). Selanjutnya, pBlue-cry8 diidentifikasi dengan PCR dan pemotongan restriksi ganda dengan BamHI dan SalI (Gambar. 1B), yang membuktikan bahwa target gen cry8 berhasil dimasukkan ke pBluescript SK (+). Gen cry8 terdiri dari 3543 bps dengan kandungan G + C dari 37.99% dan dikodekan protein dari 1180 asam amino. menyimpulkan molekul Berat (MW) dari Cry8 adalah 133,3 kDa dengan titik isoelektrik pH 4,68 menunjukkan protein asam yang lemah. Urutan asam amino gen cry8 tertinggi homologi (75%) dengan yang Cry8Aa1 dan