BAB IPENDAHULUAN

1.1. PendahuluanPenelitian yang dilakukan oleh manusia hampir semuanya menggunakan bantuan mikroorganisme, khususnya bakteri. Penemuan biogas menjadi salah satu contoh bukti kegunaan bakteri sebagai alternatif sumber bahan bakar. Produk-produk yang beredar pada pasar sebagai hasil dari bioteknologi juga sebagian besar memanfaatkan bakteri dalam prosesnya. Fakta ini menunjukkan bahwa manusia bergantung pada bakteri dalam beberapa hal seperti produksi wine, yoghurt, dan beberapa hasil olahan makanan lainnya. Bermula dari hasil bioteknologi tradisional, sebagian dari peneliti mulai meneliti dan mengembangkan bakteri yang bersangkutan untuk dimanfaatkan pada bidang lainnya. Kenyataannya, hampir semua bakteri berukuran sangat kecil dan transparan sehingga tidak dapat dilihat dengan kasat mata. Berdasarkan hal tersebut, para peneliti membuat beberapa teknik pewarnaan bakteri untuk dapat mengamati morfologi, anatomi, fisiologi ataupun sifat-sifat tertentu yang dimiliki oleh bakteri yang bersangkutan. Kegiatan kali ini, penulis menggunakan teknik pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram untuk mengamati bentuk, susunan, warna, dan jenis Gram dari bakteri yang merupakan lanjutan dari percobaan sebelumnya yaitu pemurnian bakteri dari sampel selada busuk.

1.2. Rumusan Masalah1.2.1. Bagaimanakah prosedur kerja pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram?1.2.2. Bagaimanakah bentuk dan susunan sel bakteri secara umum?1.2.3. Bagaimanakah cara membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif?

1.3. Tujuan1.3.1. Mahasiswa dapat mengetahui prosedur kerja pewarnaan sederhanan dan pewarnaan gram.1.3.2. Mahasiswa dapat mengamati bentuk dan susunan sel bakteri secara umum.1.3.3. Mahasiswa dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

1.4. ManfaatManfaat dari praktikum pewarnaan bakteri (pewarnaan sederhana maupun diferensial) adalah agar praktikan dapat mengamati dan membedakan secara tepat bentuk morfologi, susunan, dan jenis Gram bakteri.BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Bakteri mempunyai morfologi, struktur, dan sifat-sifat yang khas. Bakteri yang hidup hampir semuanya tidak berwarna dan sel-sel bakteri yang disuspensikan kontras dengan air yang digunakan. Cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit sehingga untuk identifikasi agar lebih terlihat jelas dan mudah diamati diperlukan suatu metode yaitu dengan metode pewarnaan sel bakteri. Teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. (Rahman, 2010)Pewarnaan mungkin merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri karena pewarnaan mudah dilakukan. Pewarnaan terbagi atas beberapa macam namun bahasan ini lebih tertuju pada pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana adalah pemberian warna pada bakteri atau jasad renik lain yang telah difiksasi dengan menggunakan larutan tunggal (misalnya methylene blue). Pewarnaan sederhana memungkinkan untuk dapat melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dalam morfologi yang sama (Volk, 1992).Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Olesan bakteri yang sudah terfiksasi pada gelas objek dikenai larutan-larutan seperti zat pewarna crystal violet, larutan Iodine Mordant, larutan Ethyl Alcohol 95% (bahan pemucat), dan zat pewarna penutup berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode pewarnaan gram ini akan membagi jenis bakteri menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna crystal violet, karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop sedangkan bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna penutup yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah (Rahman, 2010).Bakteri gram positif adalah organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer crystal violet, Iodine Mordant, Ethyl Alcohol 95%, dan zat warna safranin sampai pada akhir prosedur (sel-sel akan tampak biru gelap atau ungu) sedangkan bakteri gram negatif adalah organisme yang kehilangan kompleks warna ungu crystal violet pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna penutup yaitu safranin (sel-sel akan tampak merah muda) (Hadieotomo,1988).

BAB IIIMETODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat PraktikumKegiatan praktikum pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram dilaksakan pada tanggal 9 Oktober 2012 pukul 8.40-11.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi Gedung C9 FMIPAUNESA.

3.2. Alat dan BahanAlat dan bahan yang digunakan oleh penulis pada praktikum pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram diantaranya:a. Alat1. Jarum inokulasi/Ose2. Pembakar spirtus 3. Sprayer/wadah alkohol 4. Tisu5. Korek api6. Staining tray (nampan untuk pewarnaan)7. Mikroskop8. Kaca benda9. Pipet tetesb. Bahan1. Akuades steril2. Bakteri dalam media agar miring3. Methylene blue4. Larutan crystal violet5. Grams-Iodine Mordant6. Ethyl Alcohol 95%7. Warna penutup safranin

3.3. MetodeKegiatan pewarnaan sederhana dilakukan dengan terlebih dahulu membersihkan kaca benda menggunakan alkohol sampai bersih dan tidak ada lemak yang melekat. Kaca benda yang telah bersih tersebut kemudian ditetesi dengan setetes akuades steril. Bakteri hasil peremajaan diambil sebanyak satu ose dengan menggunakan teknik aseptis (bekerja di dekat api) dan selanjutnya disuspensikan ke dalam akuades steril pada kaca benda. Sediaan mikroskopik ini dikering anginkan dengan melakukan fiksasi atau melewatkan bagian bawah kaca benda di atas api. Langkah-langkah ini biasa disebut dengan pembuatan sediaan mikroskopik. Sediaan mikroskopik yang telah dingin (preparat) ditetesi dengan Methylene blue sebanyak 1 atau 2 tetes dan ditunggu selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir dalam posisi preparat yang agak dimiringkan agar tidak mengenai bakteri dan selanjutnya dikering anginkan. Preparat yang telah kering diamati menggunakan mikroskop dan kemudian ditulis hasilnya.Kegiatan berikutnya adalah pewarnaan gram yang dilakukan dengan menggunakan langkah yang sama pada pembuatan sediaan mikroskopik untuk pewarnaan sederhana. Kaca benda dibersihkan menggunakan alkohol sampai bersih dan tidak ada lemak yang melekat. Kaca benda yang telah bersih tersebut kemudian ditetesi dengan setetes akuades steril. Bakteri hasil peremajaan diambil sebanyak satu ose dengan menggunakan teknik aseptis (bekerja di dekat api) dan selanjutnya disuspensikan ke dalam akuades steril pada kaca benda dengan gerakan memutar menggunakan ose. Sediaan mikroskopik ini dikering anginkan dengan melakukan fiksasi atau melewatkan bagian bawah kaca benda di atas api. Sediaan mikroskopik yang telah dingin (preparat) ditetesi dengan larutan crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes dan ditunggu selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir dalam posisi preparat yang agak dimiringkan agar tidak mengenai bakteri dan selanjutnya dikering anginkan. Preparat selanjutnya ditetesi dengan Grams-Iodine Mordant sebanyak 1 atau 2 tetes dan ditunggu selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir dalam posisi preparat yang agak dimiringkan agar tidak mengenai bakteri dan selanjutnya dikering anginkan. Ethyl Alcohol 95% digunakan untuk mendekolorisasi preparat dengan ketentuan penambahan reagen ini dilakukan secara bertahap yakni setetes demi setetes sampai crystal violet tercuci dari preparat. Preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir dalam posisi preparat yang agak dimiringkan agar tidak mengenai bakteri dan selanjutnya dikering anginkan. Safranin diteteskan pada preparat sebanyak 1 atau 2 tetes dan ditunggu selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir dalam posisi preparat yang agak dimiringkan agar tidak mengenai bakteri dan selanjutnya dikering anginkan. Preparat yang telah kering diamati menggunakan mikroskop dan kemudian ditulis hasilnya.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HasilTabel 4.1.1. Hasil pengamatan bakteri pada pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram secara mikroskopik Nur Fitriyah Ningsih (113244003)

IdentifikasiPewarnaan SederhanaPewarnaan Gram

Gambar

Perbesaran 40x10

Perbesaran 40x10

MikroorganismeBakteriBakteri

Bentuk selCoccus (Bulat)Coccus (Bulat)

Susunan selMonococcusMonococcus

Warna selBiruMerah

Gram positif (+) atau negatif (-)Negatif (-)

Tabel 4.1.1. Hasil pengamatan bakteri pada pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram secara mikroskopik Seyla Budi Agustin (113244018)

IndikatorPewarnaan SederhanaPewarnaan Gram

Gambar mikroorganisme

(dokumentasi pribadi, 2012)

(dokumentasi pribadi, 2012)

MikroorganismeBakteri (sampel selada busuk)Bakteri (sampel selada busuk)

Bentuk selCoccusCoccus

Susunan selMonococcusMonococcus

Warna selBiruMerah

Gram positif (+) atau egative (-)Negatif

Keterangan : M = 40 x 10

Tabel 4.1.1. Hasil pengamatan bakteri pada pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram secara mikroskopik Akhmad Syauqi (113244019)

IndikatorPewarnaan sederhanaPewarnaan gram

MikroorganismeBakteri (sampel selada busuk)Bakteri (sampel selada busuk)

Bentuk selCoccusCoccus

Susunan selMonococcusMonococcus

Warna selBiruMerah

Gambar mikroorganisme(dokumentasi pribadi, 2012)(dokumentasi pribadi, 2012)

Gram positif (+) atau negatif (-)Negatif

Keterangan : M = 40 x 10

Tabel 4.1.1. Hasil pengamatan bakteri pada pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram secara mikroskopik Arina Mana Sikana (113244022)

IndikatorPewarnaan SederhanaPewarnaan Gram

Gambar mikroorganisme

(dokumentasi pribadi, 2012)

(dokumentasi pribadi, 2012)

MikroorganismeBakteri (sampel selada busuk)Bakteri (sampel selada busuk)

Bentuk selCoccusCoccus

Susunan selMonococcusMonococcus

Warna selBiruMerah

Gram positif (+) atau egative (-)Negatif

Keterangan : M = 40 x 10

Tabel 4.1.1. Hasil pengamatan bakteri pada pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram secara mikroskopik Ratih Iga Lestari (113244210)IndikatorPewarnaan SederhanaPewarnaan Gram

Gambar mikroorganisme

(dokumentasi pribadi, 2012)

(dokumentasi pribadi, 2012)

MikroorganismeBakteri (sampel selada busuk)Bakteri (sampel selada busuk)

Bentuk selCoccusCoccus

Susunan selMonococcusMonococcus

Warna selBiruMerah

Gram positif (+) atau negatif (-)Negatif

Keterangan : M = 40 x 10

4.2. PembahasanHasil pengamatan pewarnaan sederhana pada mikroorganisme bakteri dengan menggunakan pewarna tunggal methylen blue pada masing-masing praktikan dalam satu kelompok menunjukkan variasi yang kurang mencolok, umumnya morfologi bentuk bakteri yang didapat tiap praktikan adalah sama yaitu coccus. Hal ini disebabkan medium induk yang dibiakkan berasal dari sumber yang sama yaitu medium agar hasil pengenceran dalam cawan petri. Perbedaan hasil hanya terletak pada bentuk dan susunan sel bakteri.Hasil pengamatan pewarnaan diferensial pada mikroorganisme bakteri dengan menggunakan empat reagen kimia (secara urut: crystal violet, Grams Iodine, Ethyl Alcohol 95%, dan safranin) untuk menentukan jenis Gram bakteri (bakteri jenis Gram positif berwarna biru sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah) pada masing-masing praktikan dalam satu kelompok menunjukkan variasi hasil yang kurang mencolok. Hal ini kemungkinan besar disebabkan: 1) Terlalu lama proses pengeringan setelah pemberian zat warna/reagen (seharusnya ditunggu selama 1 sampai 2 menit). 2) Kesalahan pada tahap dekolorisasi dengan alkohol, lunturnya pewarna primer akibat dekolorisasi yang berlebihan menyebabkan bakteri Gram positif nampak seperti Gram negatif sebaliknya sisa pewarna primer akibat dekolorisasi yang tidak sempurna menyebabkan bakteri Gram negatif nampak seperti Gram positif. 3) Kurang sempurnanya tahap pencucian preparat (yang telah diwarnai) menggunakan air mengalir pada tiap tahap yang mengakibatkan reagen/pewarna yang berlebihan tidak dapat hilang sempurna dan berpengaruh pada tahap pewarnaan berikutnya.

BAB VPENUTUP

5.1. Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan dapat disimpulkan bahwa prosedur kerja pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram adalah sebagai berikut:a. Kaca benda diambil dan dibersihkan dengan alkohol sampai bersih.b. Kaca benda ditetesi dengan akuades sterill.c. Satu ose bakteri umur 24 jam diambil dan disespensikan dalam akuades steril pada kaca benda. Kegiatan ini dilakukan dengan teknik aseptis.d. Dilakukan fiksasi.e. Preparat ditetesi dengan methylene blue (untuk pewarnaan sederhana) sedangkan crystal violet (untuk pewarnaan gram) 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1-2 menit.f. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Khusus pewarnaan gram selanjutnya preparat ditetesi dengan Grams-Iodine Mordant dan dibiarkan 1-2 menit kemudian dicuci dengan air mengalir serta dikeringanginkan. Preparat didekolorisasi dengan Ethyl Alcohol 95% lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Preparat ditetesi pewarna penutup atau safranin dan dibiarkan 1-2 menit lalu dicuci dengan air mengalir serta keringaginkan. g. Amati preparat di bawah mikroskop perbesaran kuat. Gambar dan tuliskan hasil pengamatan.Hasil pengamatan dengan mikroskop pada pewarnaan sederhana dapat diketahui bentuk morfologi bakteri (bacilus/batang, coccus/bulat, spirilium/seperti pegas) dan susunannya (mono-/satu, diplo-/dua, strepto-/seperti rantai, stafilo-/seperti buah anggur) dengan warna semua bakteri sama yaitu biru sedangkan pada pewarnaan gram warna bakteri ada dua yaitu warna biru dan warna merah. Hal ini disebabkan oleh tebal tipisnya dinding sel bakteri, apabila dinding sel bakteri tebal maka warnanya biru (gram positif) sedangkan untuk bakteri yang berwarna merah (gram negatif) memiliki dinding sel yang tipis.

5.2. Saran Praktikan harus menguasai prosedur pewarnaan dengan benar baik pewarnaan sederhana maupun pewarnaan gram, cekatan, teliti dan selalu menerapkan teknik aseptis pada alat, bahan, tempat praktikum maupun diri praktikan baik sebelum, selama atau sesudah kegiatan praktikum untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

DAFTAR PUSTAKA

Fatma Abdur Rahman,2010.Pewarnaan Gram. http://fatma.student.umm.ac.id/download-as-pdf/umm_blog_article_100.pdf. Diunduh tanggal 13 Oktober 2012.Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia:Jakarta.Volk, Wheter. 1992. Mikrobiologi Dasar. University Of Southern Maine.