Teknik Penentuan Ketersediaan Hayati Folat

8/11/2019 Teknik Penentuan Ketersediaan Hayati Folat

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Food Ch emistry

31 (1989) 149-158

A T e c h n i q u e f o r A s s e s s i n g t h e B i o l o g i c a l A v a i l a b i l i t y o f

F o l a t e i n F o o d s

J . M . G ee , A. Bh abuta I . T. Johnson

Institute of Food Research, Norwich Laboratory, Colney Lane,

Norwich, Norfolk, NR4 7UA, UK

(Received 27 January 1988; revised version receivedand accepted

4 March 1988)

A B S T R A C T

A m etho d i s descr ibed . fo r t he asses smen t o f f o la t e ava i l ab il it y f ro m human

foo ds us ing t he t he f o la t e -de p l e t ed ra t . An ima l s were ma in ta ined on a

sem i syn the t i c d i e t f o r per iods o f 4 weeks o r more . A t t he end o f t h is per iod

t is sue f o la t e l eve l s were me asured us ing a rad io immunoassay . Fo la t e i n takes

were as ses sed by m on i tor in g foo d i n take on a da i ly bas is . T he f o la t e con t en t o f

t he d ie t was de t erm ined by m icrob io log ica l a s say . T he an ima l s c on t inued t o

grow a nd ma in ta in hea l th t h roughou t t he dep l e t ion per iod bu t leve ls o f o la t e

in l iver serum and in tes t inal mu eosa were s igni f icant ly reduced in comparison

to ra ts f e d a f o la t e supp l emen ted d ie t. Re e ed in g dep l e t ed ra t s w i th crys ta ll ine

fo l i c acid or w i th f r eeze -d r i ed eabbage i ncorpora ted i n to t he s em i - syn the t i c

d ie t l ed to a measurab le increase in t i ssue o la te s tores wi th in 24 h . The serum -

fo la t e l eve l appeared t o be t he mo s t co ns i s ten t and conven i en t ly measurab l e

index o f o la t e s t a tus . T he me thod prov ides a re la t ive l y inexpens i ve and rap id

m etho d o f measur ing t he phys io log i ca l r esponse t o t he mos t impor tan t

sources o f f o la t e in t he human d i et .

INTRODUCTION

The nutritional value of vitamins in foods depends both upon

t h e t o t l

concentration of biologically active forms present, and upon their

availability for absorption and utilisation by normal metabolic pathways. In

the case of folates the multiplicity of naturally occurring substituted and

conjugated forms leads to uncertainties in both areas, and there is l i t t l e

conclusive information on the bioavailability of folates from the major

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Food Chemistry

0308-8146/89/ 03.50 1989 Elsevier Science Publishers Ltd, England.

Printed in Great Britain


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J . M . Gee A . Bhabuta L T . Johnson

s o u r c e s i n t h e h u m a n d i e t . A f e w i n d i r e c t s t u d i e s h a v e b e e n u n d e r t a k e n i n

m a n ( T a m u r a & S t o k s t a d , 1 9 7 3 ), b u t t h e r e is a n e e d t o d e v e l o p a p r a c t i c a l

a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e u s i n g e x p e r i m e n t a l a n i m a l s . S e v e r a l g r o u p s h a v e

d e s c r i b e d m e t h o d s w h i c h u t il is e t h e g r o w t h a n d f o l a t e s t a tu s o f t h e c h i c k , o r

t h e l iv e r f o l a t e s to r e s o f t h e r a t a s e x p e r i m e n t a l i n d i c e s ( G r a h a m

e t a l .

1980;

K e a g y & O a c e , 1 9 82 ). H o w e v e r , b o t h m e t h o d s r e q u i r e l a rg e n u m b e r s o f

e x p e r i m e n t a l a n i m a l s , a n d u t i l i s e t i m e - c o n s u m i n g m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y

t e c h n i q u e s t o m e a s u r e c h a n g e s i n t i s s u e f o l a t e l e v e l s . I n t h i s r e p o r t w e

d e s c r i b e a s i m p l e m e t h o d f o r a s s e ss i n g f o l a te a v a i l a b i l it y t o r a t s, i n w h i c h t h e

r i s e i n s e r u m f o l a t e o f p r e v i o u s l y d e p l e t e d a n i m a l s i s m e a s u r e d b y

r a d i o i m m u n o a s s a y . T h e a p p l i c a t io n o f th e t e c h n i q u e is i ll u s tr a te d b y a

c o m p a r i s o n o f th e s e r u m f o la t e r e s p o n s e to r a w c a b b a g e a n d p t e r o y l-

g l u t a m i c a c i d i n c o r p o r a t e d i n t o s e m i - s y n t h e t i c f e e d s .

M E T H O D S

Preparation of diets

T h e c o m p o s i t i o n o f t h e f o l a t e - f r e e s e m i - s y n t h e t i c d i e t ( F F S ) f e d t o a l l

a n i m a l s d u r i n g t h e f o l a t e d e p l e t i o n p e r i o d i s s h o w n i n T a b l e 1. E x p e r i m e n t a l

d i e t s c o n t a i n i n g s y n t h e t i c f o li c a c i d w e r e id e n t i ca l , e x c e p t f o r t h e a d d i t i o n o f

c r y s t a ll i n e p t e r o y l g l u t a m i c a c i d ( P G A ) ( S ig m a C h e m i c a l C o ., P o o l e , D o r s e t )

a t t h e a p p r o p r i a t e l ev e l. F o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l d ie t s

c o n t a i n i n g a n a t u r a l s o u r c e o f f o o d f o l a t e , g r e e n c a b b a g e w a s p u r c h a s e d

l o c a l l y . T h e c h o p p e d r a w c a b b a g e w a s f r e e z e - d r i e d i n b u l k , f i n e l y g r o u n d

a n d i n c o r p o r a t e d i n t o s e m i - s y n t h e ti c d i e t s a t l e v el s o f 1 25 a n d 2 5 0 g / k g . T h e

o t h e r c o n s t i tu e n t s w e r e a d j u s t e d t o m a i n t a i n t o ta l e n e r g y v a l u es t o w i th i n

5 o f t h e c o n t r o l d ie t. T h e f o l a te c o n t e n t s o f t h e d i et s w e r e d e t e r m i n e d b y

m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y . A l l d i e t s w e r e s t o r e d i n b l a c k p o l y t h e n e b a g s a t

- 4 0 C p r i o r t o u s e .

A l t h o u g h s t a b le a t - 4 0 C , t h e f o la t e c o n t e n t o f e x p e r i m e n t a l d ie ts

d e c li n e s u n d e r a n i m a l h o u s e c o n d i ti o n s . I n o r d e r t o e s t i m a t e a n d a l lo w f o r

th is , t h e P G A - s u p p l e m e n t e d d i et s w e r e a n a ly s e d a t t h e b e g i n n i n g a n d e n d o f

t h e 7 d a y f e e d i n g p e r i o d ( T a b l e 2 ), a n d t h e f o l a t e in t a k e o f t h e a n i m a l s ( T a b l e

5) w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e a v e r a g e o f th e s e v a lu e s .

icrobiological assa y of folate

T h e p r o c e d u r e w a s e s s e n t i a ll y t h a t o f P h i ll ip s & W r i g h t ( 19 83 ), w i t h m i n o r

m o d i f i c a ti o n s . S a m p l e s o f d ie t (1 g ) w e r e h o m o g e n i s e d i n 2 5 m l o f a s c o r b i c


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Assessing the biological availability o f fol at e

T A B L E I

C o m p o s i t i o n o f t h e F o l a te - D e f i c i e n t S e m i -

S y n t h e t i c

D i e t

Constituent g/k g diet

Sucrose a 655

Case in b 200

M aize -o i l c 80

M i n e r a l- M i x a 4 0

Vi t am in-M ix ( in s t a r ch) e 20

DL -M ethionine -r 5

a B D H C h e m i c a l s , D a g e n h a m , E s se x.

h E d i b le c a s e in ; G l a x o F a r l e y F o o d s , P l y m o u t h .

c M a z o l a c o r n - o il .

d M inera l -mix prov ided (pe r k i l ogram of d i et) :

C a H P O 4 , 1 3 g ; N a 2 H P O 4 , 7 . 4g ; C a C O 3 , 8 -2 g ;

K C I , 7 ' 0 3 g ; M g S O 4 , 4 - 0 g ; Z n C O 3 , 0 l g ;

F e S O 4 . 7 H 2 0 , 0 . 1 4 4 g ; C u S O 4 . 5 H 2 0 , 0 ' 0 2 3 g ;

K I O 3 , 0 '0 01 g ; M n S O 4 . H 2 0 , 0 1 8 g .

e Vi t am in-mix prov ided (pe r k i l og ram o f d ie t) :

N i c o t i n i c a c i d , 6 0 m g ; c y a n o c o b a l a m i n ( B 1 2 ) i n

m a n n i t o l , 5 0 m g ; C a l c i u m D - P a n t o t h e n a t e , 4 0 m g ;

T h i a m i n e H C I ( B I ) , 1 0 m g ; R i b o f l a v i n ( B 2 ) ,

10m g; Pyr idoxine , 10m g; D-Bio tin, 1 mg ; Men -

a d i o n e ( K ), 1 m g ; R o v i m i x E -5 0 , 1 5 0 m g ; R o v i m i x

A - 5 0 0 , 2 5 m g ; R o v i m i x A - 5 0 0 / D 3 , 1 5 m g ;

C ho l ine bi tar t ra te , 0-9 g.

I S ig m a C h e m i c a l C o , P o o l e , D o r s e t .

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T A B L E

F o l a te C o n t e n t o f P G A S u p p l e m e n t e d D i et s

Diet

Folate content mg/kg diett

Initial Final

Fo late deficient 0 28 (0 '7) N D

PG A -su pp lem en ted 10-6 (0.6) 6 .0 (0 .8)

PG A -sup plem ented 23 '1 (5 3 ) 12 .2 (3 9 )

R e s u lt s a r e m e a n a n d r a n g e o f m i c r o b i o l o g i c a l a ss a y s p e r f o r -

med in tr ipl icate ( ini t ial values) or duplicate (f inal values) at the

b e g i n n i n g a n d e n d o f 7 d a y f e e d in g p e r i o d .

N D : N o n e d e te c te d .


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52 J . M . Gee A . Bhabuta L T . Johnson

ac id bu f f e r (57 mM, pH 6 ), bo i l ed fo r 5 m in , coo le d a nd cen t r i fuge d (40 000 g )

f o r 30 m i n a t 5C . S u p e r n a t a n t s w e r e s t o re d a t - 2 0 C p r i o r to a s sa y . T o

c l e a v e t h e f o l a t e p o l y g l u t a m a t e s , t h e e x t r a c t s w e r e t r e a t e d w i t h h o g k i d n e y

d e c o n j u g a s e e n z y m e , p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f G r e g o r y

et al.

(1 98 4). T h e t o t a l f o l a t e c o n t e n t o f t h e d i e t e x t r a c t s w a s a s s a y e d b y m e a s u r i n g

t h e g r o w t h r e s p o n s e o f L . c a se i ( A T C C , 7 4 6 9 ) , u s i n g t h e a s e p t i c a d d i t i o n

m e t h o d o f H e r b e r t ( 1 9 6 6 ) .

T h e f o li c a c i d ca s e in m e d i u m ( D i fc o L a b o r a t o r ie s , W e s t M o l e se y , U K )

w a s p r e p a r e d a t s in g l e s t r e n g t h w i t h a d d e d a s c o r b i c a c i d (5 .7 m M ) . T h e p H

w a s a d j u s t e d t o 6 . 2 b e f o r e d i s p e n s i n g i n t o a s s a y t u b e s ( 1 0 m l ) w h i c h w e r e

i n c u b a t e d f o r 22 h a t 3 7 C. A c a l i b r a t i o n c u r v e w a s p r e p a r e d s i m u l t a n e o u s l y

u s in g t u be s c o n t a in i n g P G A . G r o w t h o f L .

case i

w a s m e a s u r e d u s in g a n E E L

N e p h e l o m e t e r .

eeding trials

M a l e W i s t a r r a t s ( 5 0 - 8 0 g ) w e r e p u r c h a s e d f r o m a c o m m e r c i a l s u p p l i e r

a n d h o u s e d i n p a i r s i n w i r e - b o t t o m e d c a g e s t o p r e v e n t c o p r o p h a g y . A

d e p l e t io n o f fo l a te s t o re s w a s t h e n i n d u c e d b y m a i n t a i n i n g t h e a n i m a l s o n

t h e F F S d i e t, f e d a d l i b i t u m , f o r a p e r i o d o f 6 - 7 w e e k s : w a t e r w a s a v a i l a b l e a d

l ib i tum. T h e f o l a t e d e p l e t e d a n i m a l s w e r e t h e n r a n d o m l y d i v i d e d a m o n g

t h r e e e x p e r i m e n t a l g r o u p s , w e i g h e d , h o u s e d s in g l y a n d g i v e n e i t h e r a f o la t e -

s u p p l e m e n t e d o r f o l a t e - d e fi c i e n t d i e t f o r a f u r t h e r p e r i o d o f 1, 5 o r 7 d a y s a d

l ib i tum. F o o d i n t ak e s a n d b o d y w e i g h t s w e r e r e c o r d e d d a il y.

A t t h e e n d o f th e r e f e e d i n g p e r i o d , th e r a t s w e r e w e i g h e d , a n a e s t h e t i s e d b y

i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n ( l m l / k g b o d y w e i g h t ) o f s o d i u m b a r b i t u r a t e

( S a g a t a l ; M a y a n d B a k e r , D a g e n h a m , E s s e x ) a n d k i l l e d b y c e r v i c a l

d i s l o c a t i o n . T h e a b d o m e n w a s o p e n e d b y a m i d - v e n t r a l i n c i s i o n , a n d a

b l o o d s a m p l e

ca

2 5 m l ) t a k e n f r o m t h e v e n a c a v a b y s y r i n ge . T h e l iv e r w a s

f lu shed in s i tu w i th i ce -co ld phys io log ica l s a li ne (20 ml ), exc ised and cu t i n to

sma l l p ieces . Th e sm a l l i n t e s t ine w as r em ov ed , f lu shed w i th s a li ne , s li t op en

a n d t h e m u c o s a s c r a p e d f r o m t h e j e j u n a l p o r t io n ( 1 0 - 5 0 % o f t h e le n g th )

u s i n g m i c r o s c o p e s l i d e s . S a m p l e s o f l i v e r a n d i n t e s t i n a l m u c o s a w e r e

i m m e d i a t e l y s t o r e d u n d e r l i q u i d n i t r o g e n . A f t e r s t o r a g e f o r 1 h a t 4 C ,

s a m p l e s o f s e r u m w e r e o b t a i n e d b y c e n t ri f u g a t i o n a n d s t o r e d u n d e r l i q u id

n i t r o g e n p r i o r t o a n a l y si s . T h e a v a i l a b i li ty o f f o l a t e f r o m f o o d s o u r c e s w a s

a s s e s s e d b y c a l c u l a t i n g t h e i n t a k e o f f o l a t e b y e a c h g r o u p o f r a t s a n d

c o m p a r i n g t h e r i s e i n s e r u m f o l a t e s i n r e s p o n s e t o t h e f o o d s a n d t o

c r y s t a l l i n e P G A .


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ssessing the biological availabili ty o f ola te 153

x t r a c t i o n o f t i ss u e s a m p l e

P o r t i o n s (5 g f re s h w e i g h t) o f l iv e r o r j e j u n a l m u c o s a w e r e h o m o g e n i s e d i n a n

e q u a l v o l u m e o f a s c o r b ic ac i d s o l u t io n ( 2 w / w , p H 6), e x t r a c te d b y p la c i n g

t h e h o m o g e n a t e i n a b o i l i n g w a t e r b a t h f o r 1 0 m i n t h e n c o o l e d a n d

c e n t r i f u g e d ( 1 5 0 0 g , 3 0 m i n , 4 C ). T h e s u p e r n a t a n t w a s r e m o v e d a n d t h e

p e ll et r e -e x t ra c t ed . C o m b i n e d s u p e r n a t a n t s w e r e d i lu t e d a s n e c e s s a r y p r io r

t o r a d i o i m m u n o a s s a y .

R a d i o i m m u n o a s s a y o f s e r u m a n d t is su e f o la t e

F o l a t e l e v e l s i n r a t s e r u m a n d t i s s u e e x t r a c t s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a

c o m m e r c i a l r a d i o i m m u n o a s s a y k i t b a s e d o n t h e p r in c i p le o f c o m p e t i ti v e

p r o t e i n b i n d i n g ( B e c k t o n - D i c k i n s o n I m m u n o d i a g n o s t i c s , C o w l e y , O x f o r d ) .

S e r u m s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h 1 a s c o r b i c a c i d s o l u t i o n p r i o r t o a s s a y ,

a n d h e a t e d a t 1 00 C f o r 1 5 m i n i n t h e d a r k t o d e s t r o y e n d o g e n o u s f o la t e-

b i n d i n g p r o t e i n . A f t e r c o o l in g , k n o w n q u a n t i ti e s o f [ ~ 2 5 I] -l a b e ll e d f o l a te -

b i n d i n g p r o t e i n w e r e a d d e d t o b o t h s e r u m s a m p l e s a n d f ol ic a c i d s t an d a r d s ,

a n d t h e s o l u t i o n s i n c u b a t e d i n b u ff e r ( p H 9 .3 ) i n t h e d a r k f o r 3 0 m i n a t r o o m

t e m p e r a t u r e . F r e e a n d b o u n d f o la t e w e r e s e p a r a t e d b y t r e a t m e n t w i t h

d e x t r a n - c o a t e d c h a r c o a l , f o l lo w e d b y c e n tr i fu g a t i o n . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e

d e c a n t e d a n d c o u n t e d i n a P h i l i p s P W 4 7 5 0 g a m m a s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r

(Ph i l i p s , Cambr idge ) .

S t a t i s t i c a l a n a l y s i s

T h e s i g n i fi c a n ce o f d i ff e re n c e s b e t w e e n m e a n s w a s e s t i m a t e d u s i n g a o n e -

w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e , f o l l o w e d b y c a l c u l a t i o n o f t h e l e a s t s i g n i f i c a n t

d i f fe rence (17 < 0 .05) in cases w he re the F- tes t in d ic a te d s ign i f icant ineq ua l i ty

o f m e a n s ( C o c h r a n & C o x , 1 96 4).

R E S U L T S

F o l a t e l e v e ls i n t is s u e s o f d e p l e t e d r a t s

R a t s f e d t h e F F S - d i e t f o r u p t o 7 w e e k s c o n t i n u e d t o g a i n w e i g h t a n d s h o w e d

n o o v e r t s ig n s o f i ll - h ea l th , i n c o m p a r i s o n t o a n i m a l s m a i n t a i n e d

t h r o u g h o u t t h e f ee d i n g p e r i o d o n a d i e t c o n t a i n i n g 5 m g / k g a d d e d P G A .

L e v e l s o f f o l a t e in t h e s e r u m , li v e r a n d s m a l l i n te s t in a l m u c o s a o f a n i m a l s f e d

f o l a t e - d e p l e t e d a n d c o n t r o l d i e t s f o r 3 8 - 4 2 d a y s a r e g i v e n in T a b l e 3 .


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154 J . M . Gee , A . Bhabu ta , L T . Johnson

T A B L E

S e r um , L i v e r a n d S m a l l I n t es t in a l F o l a t e C o n t e n t o f R a t s F e d F o l a t e F r e e o r F o l a t e

S u p p l e m e n t e d S e m i S y n t h e t i c D i e t s

D i e t S e r u m f o l a t e M u c o s a l f o l a t e L i v e r f o l a t e

(l lg/m l) ( gig) ( l~g/g)

Su pp le m en ted 41-4 _+ l '6a 1 56 _+ 0.17a 4-75 _+ 0 '4 5,

F o la te de fic ien t 14.6 _+ 4 Ib 0.67 _+ 0 12b 3.26 _+ 0'21b

R e s u l t s a re m e a n s w i t h s t a n d a r d e r r o r s f o r s ix a n i m a l s . R e s u l t s n o t s h a r i n g t h e s a m e s u b s c r i p t

d i f fe red s ig n if ica n t ly (p < 0 05).

F i n a l L i v e r M u c o s a a n d S e r u m

T A B L E 4

F o l a t e L e v e ls o f F o l a t e - D e p l e t e d a n d R e - f e d P G A

S u p p l e m e n t e d R a t s

D i e t L i ve r M u c o s a S e r u m

(Izg/g) ( fr . wt .) ( l tg/g) ( fr . wt .) (n g/m l)

D ep let ed = 0d 4.33 (2 .24) 0 .32 (0 '06) 40 (23)

5d 2.69 (0.53) 0-19 (0-10) 15 (13)

P G A - s u p p l e m e n t e d

(1 0m g/ kg ) ld 7 .36 (2 .45) 1 .49 (0 54) 152 (128)

5d 16.93 (6.3) 3'46 (1.15) 328 (272)

P G A - s u p p l e m e n t e d

(5 0m g/ kg ) ld 11.20 (2 .55) 3 .93 (1 93) 360 (240)

5d 11.41 (0-9) 1.66 (0 20) 305 (70)

R e s u l ts a r e m e a n s a n d r a n g e o f t w o a n i m a l s .

T A B L E 5

F o o d I n t a k e, F o l a t e I n t a k e a n d F i n a l S e r u m F o i a t e L e v el s o f F o l a t e - D e p l e t e d R a t s R e - f e d

P G A - S u p p l e m e n t e d D i e t s

D i e t F o o d i n t a k e W t . g a i n P G A i n t a k e S e r u m j o l a t e

(g/day) (g /7 day) ( ltg /7 day) ( i tg /m l)

F o l a t e d e f i ci e n t 1 9.1 + 0 . 5 , 1 2 . 5 +

1 5 a


7/10

Assessing the biological availability o f fola te

155

Response to re feeding with PGA or cabbage supplements

T w e l v e f o l a te - d e p l e t e d r a ts w e r e d iv i d e d i n t o t h r e e g r o u p s o f f o u r r at s, a n d

g i v en d ie t s d e f ic i en t i n o r s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 o r 5 0 m g / k g P G A f o r 1 o r

5 d a y s , w i t h e a c h t r e a t m e n t i n d u p l ic a t e . T h e f in a l se r u m , l iv e r a n d m u c o s a l

f o l a t e le v e ls a r e g i v e n i n T a b l e 4 . T h e i n c r e a s e s i n t is s u e f o l a t e c o n c e n t r a t i o n

r e fl e ct e d t h e a m o u n t o f f o l at e in t h e d i e t, a n d s h o w e d t h a t i n c re a s es o c c u r i n

a ll t h e m e a s u r e d f o l a t e p o o l s w i t h i n 2 4 h o f b e i n g t r a n s f e r r e d f r o m a d e f ic i e n t

diet .

I n a m o r e r i g o r o u s e x p e r i m e n t 3 0 r a t s w e r e f e d t h e F F S - d i e t f o r a

d e p l e t i o n p e r i o d o f 9 w e e k s . T w o g r o u p s o f 1 0 r a ts w e r e t h e n g i v e n d i e ts

s u p p l e m e n t e d w i th 10 o r 2 0 m g / k g P G A , f o r a f u r th e r p e r io d o f 7 d a y s ,

w h i l s t t h e r e m a i n i n g 10 r a ts c o n t i n u e d t o r e c e iv e F F S . T h e f o l a te c o n t e n t s o f

t h e s e d i e t s a r e g i v e n i n T a b l e 2 . T h e m e a n i n t a k e s o f f e e d a n d f o l i c a c i d

d u r i n g t h i s p e r i o d , t o g e t h e r w i t h t h e f i n a l s e r u m f o l a t e l e v e l o f b o t h t h e

f o l a t e - s u p p l e m e n t e d a n d f o l a te - d e p l e te d g r o u p s , a r e s h o w n i n T a b l e 5. T h e

s i g n if i c an t i n c r e a s e s i n s e r u m f o l a t e r e f le c t e d t h e h i g h e r P G A c o n c e n t r a t i o n s

i n si m i l a r a m o u n t s o f d i e t c o n s u m e d .

I n a f u r t h e r e x p e r i m e n t , fo l a t e - d e p l e t e d r a ts w e r e r e - fe d w i t h c a b b a g e a t

l ev e ls o f 12 5 a n d 2 5 0 g / k g . T h e l o w e r le v el o f c a b b a g e s u p p l e m e n t a t i o n

1 .8 m g f o l a t e / k g d i et ) w a s w e l l a c c e p t e d b y t h e a n i m a l s a n d t h e r e w a s n o

a d v e r s e e ff ec t u p o n f o o d i n t a k e o r w e i g h t g ai n . A t t h e h i g h e r l ev e l o f c a b b a g e

c o n t e n t 3 . 3 m g f o l a t e / k g d ie t) t h e r a ts s h o w e d s o m e a v e r s io n t o t h e

e x p e r i m e n t a l d ie t. T a b l e 6 s h o w s t h e m e a n f e ed a n d f o la t e in t a k e o f t h e t h r e e

g r o u p s , t o g e t h e r w i th t h e ir a v e r a g e w e i g h t g a in d u r i n g t h e 7 d a y f e e d in g

p e r io d . B o t h t h e c a b b a g e - s u p p l e m e n t e d g r o u p s a t t a in e d s e r u m f o la t e l ev e ls

w h i c h w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h e f o l a t e - d e p l e t e d c o n t r o l s , t h e

i n c r e a s e b e i n g a p p r o x i m a t e l y p r o p o r t i o n a l t o t h e e s t i m a t e d f o l a t e i n t a k e .

T A B L E 6

F o o d I n t ak e , F o l a t e I n t a k e a n d F i n a l S e r u m F o l a t e L e v el s o f F o l a t e - D e p l e t e d R a t s R e - fe d

C a b b a g e - S u p p l e m e n t e d D i e t s

Diet Food intake W t. gain Folate intake Serum folate

g/day) g/7 day ) l~g/7 day ) l~g/ml)

F ol a t e de f ic ien t 19 .2 + 0 '5 , 13-8 + 1 .5a < 8a 8 6 + 1 1 a

C a b b a g e - s u p p l e m e n t e d

(12 5 g/ kg ) 19.8 + 1-5, 16.0 __+4 0a 249 + 20 b 21.9 + 3 .0 b

C a b b a g e - s u p p l e m e n t e d *

(25 0 g/k g) 15-3 + l '4 a 7'3 + 5 5a 347 ___ 36c 34 0 _ 2 0c

R e s u l t s ar e m e a n s w i t h s t a n d a r d e r r o r s f o r f iv e a n i m a l s o r t h r e e a n i m a l s w h e r e in d i c a t e d b y

a s t e r is k . R e s u l t s n o t s h a r i n g t h e s a m e s u b s c r i p t d i f f e re d s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 ' 5) .


8/10

156 J. M. Gee A. Bhabuta L T . Johnson

D I S C U S S I O N

T h e i d e a l a p p r o a c h t o t h e i n v e s t ig a t io n o f fo l at e a v ai la b i l it y f r o m h u m a n

f o o d s w o u l d i n v o l v e d i r e c t m e a s u r e m e n t s i n m a n . S e v e r a l s t u d i e s w i t h

h u m a n su b j ec ts h a v e b e e n c a r r ie d o u t ( T a m u r a S t o k s t a d , 1973; B a b u

S r i k a n t i a , 19 76 ), b u t t h e y a r e e x p e n s i v e a n d s u b j e c t to b o t h t e c h n i c a l a n d

e t h ic a l d if fic u lt ie s w h i c h m a k e t h e m u n s u i t a b l e f o r r o u t i n e w o r k . G r a h a m e t

a l .

( 1 9 8 0 ) , a n d o t h e r g r o u p s h a v e u s e d t h e c h i c k b i o a s s a y t o a s s e s s f o l a t e

a v a il ab i l it y, b u t a m a m m a l i a n s y s t e m is m o r e a p p r o p r i a t e f o r th e s t u d y o f

h u m a n f o o d s . F o l a t e d e f i c ie n c y is d i f fi c u lt t o a c h i e v e i n t h e r a t, m a i n l y

b e c a u s e o f c o p r o p h a g y , b u t t h e p r e s e n t s t u d y d e m o n s t r a t e s t h a t w i t h th e u s e

o f s i n g le w i r e - b o t t o m e d c a g e s i t is p o s s i b le t o a c h i e v e a s i g n if ic a n t r e d u c t i o n

i n t i s s u e f o l a t e s t o r e s w i t h o u t r e c o u r s e t o t a i l c u p s o r a n t i b i o t i c s . T h e

r e s p o n s e o f s u c h s t o r e s t o r e - f e e d i n g w i t h d e f in e d q u a n t i t i e s o f f o la t e t h e n

p r o v i d e s a m e a n s o f a s s e ss in g u p t a k e a n d u t i li s a t io n o f t h e v i t a m i n b y t h e

ra t .

I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t io n , r e s t ri c t io n o f f o l a te i n t a k e f o r p e r i o d s i n

e x c es s o f o n e m o n t h l e d to a r e d u c t i o n i n f o la t e s t o re s i n s e r u m , li ve r a n d

s m a ll i n te s t i n a l m u c o s a . H o w e v e r , a s in t h e r e c e n t s t u d y o f A b a d G r e g o r y

(1 987 ), t h e b r o a d e s t r e s p o n s e r a n g e w a s o b t a i n e d w i t h s e r u m f o la t e, w h i c h

a ls o h a s t h e a d d e d a d v a n t a g e o f b e in g e a si ly m e a s u r a b l e u s in g t h e r a d i o -

i m m u n o l o g i c a l t e c h n iq u e . T h e a s sa y o f s ol id t is s ue s b y t h is m e t h o d p r o v e d

m o r e c o m p l e x a n d p r o n e t o i n ac c u r a c y , a n d t h ei r su r g ic a l re m o v a l w a s t im e -

c o n s u m i n g . M o r e o v e r , b o t h t h e l i v e r a n d g u t m u c o s a m a y b e h e a v i l y

c o n t a m i n a t e d w i t h b l o o d , a n d t h is m a y c o n t r i b u t e t o t h e l a ck o f c o n s i st e n c y

o f t h e h e p a t ic f o la te r e s p o n s e t o d i e ta r y i n t a k e n o t e d b y A b a d G r e g o r y

(1 98 7). O n e o f t h e m a j o r d i f fi c u lt ie s e n c o u n t e r e d i n v i t a m i n b i o - a v a i l a b i l i t y

a s sa y s is t h e p r o b l e m o f i n c o r p o r a t i n g h u m a n f o o d s i n t o a n i m a l d i et s a t

le ve ls w h i c h a r e b o t h p a l at a b le , a n d h i g h e n o u g h t o p r o v o k e a m e a s u r a b l e

p h y s i o lo g i c a l r e s po n s e . T h e u s e o f fr e ez e -d r ie d c a b b a g e a s a c o m p o n e n t o f

a n o t h e r w i s e s e m i - s y n t h e t i c d i e t a p p e a r s t o h a v e o v e r c o m e t h is p r o b l e m ,

a n d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n s e r u m f o l a t e l e v e l w a s a c h i e v e d , e v e n a t a

r e l a ti v e l y l o w l e ve l o f i n c o r p o r a t i o n w h i c h d i d n o t l e a d t o a f a ll i n f o o d

c o n s u m p t i o n .

I n s p it e o f t h e a d v a n t a g e s o f t h e r a d i o - i m m u n o l o g i c a l p r o c e d u r e f o r t h e

m e a s u r e m e n t o f f o l at e in b l o o d a n d o t h e r t is s ue s , i t d o e s n o t a p p e a r t o b e a

r e li a b le m e a n s o f m e a s u r i n g f o l a t e in a v a r i e t y o f c o m p l e x f o o d s .

M i c r o b i o l o g i c a l a s sa y w i th

L . c a s e i

w a s u s e d i n th e p r e s e n t s tu d y , a l t h o u g h it

is p o s s i b le t h a t a l t e r n a t iv e m e t h o d s o f f o o d a n a l y s i s m a y e m e r g e in t h e n e a r

f u t u r e . G r e g o r y e t a l . ( 19 82 ) h a v e d e s c r i b e d t h e u s e o f h i g h p e r f o r m a n c e

l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y f o r t h i s p u r p o s e a n d h a v e s u g g e s t e d t h a t

m i c r o b i o l o g i c a l a s sa y m a y u n d e r e s t i m a t e t h e f o la t e c o n t e n t o f c a b b a g e


9/10

Assessing the biological availability o f fo lat e 157

b e c a u s e o f t h e p r e s e n c e o f h y p o t h e t i c a l g r o w t h i n h i b it o rs . H o w e v e r , i n a

s u b s e q u e n t r e p o r t f r o m t h i s g r o u p , s i g n i f i c a n t v a r i a t i o n s i n t h e r e s u l t s

o b t a i n e d b y t h e t w o m e t h o d s w e r e o b s e r v e d , a n d t h e

L . c a s e i

m e t h o d

i n d i c a t e d a h i g h e r l ev e l o f t o t a l f o l a te i n a s a m p l e o f c a b b a g e t h a n t h a t

d e t e r m i n e d b y H P L C ( G r e g o r y

e t a l .

1 9 8 4) . T h e c a s e f o r t h e p r e s e n c e o f

m i c r o b i o l o g i c a l g r o w t h i n h i b i to r s i n c a b b a g e t h e r e f o r e r e m a i n s u n p r o v e n ,

a n d i t is n o t y e t c e r t a i n t h a t H P L C p r o v i d e s a r e l ia b l e m e t h o d f o r a ll f o o d s .

F o l a t e s i n c a b b a g e a r e p r e s e n t a s p o l y g l u t a m a t e s w h i c h m u s t b e

h y d r o l y s e d p r i o r t o a b s o r p t i o n . I n t h e r a t t h i s is a c c o m p l i s h e d b y a s p e c if ic

P G A h y d r o l a s e ( E l se n h a n s e t a l . 1 9 8 4 ) w h i c h a p p e a r s t o b e l o c a t e d i n t h e

c y t o p l a s m o f t h e m u c o s a l c ells , w h e r e a s i n m a n a n d t h e p i g th e e n z y m e is

l o c a l i s e d i n t h e b r u s h b o r d e r ( W a n g

e t a l .

1 9 8 5 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l

s ign i f i cance o f t h i s d i f f e rence is unc l ea r , bu t c l ea r ly it is a po in t t o be b o rn e i n

m i n d w h e n i n t e r p r e t in g t h e r e s u lt s o f a b s o r p t i o n s tu d i es in t h e ra t. T a m u r a

& S t o k s t a d (1 97 3) r e p o r t e d t h a t t h e a v a i la b i l it y to h u m a n s u b j e c ts o f f o l a t e

f r o m b o t h r a w a n d c o o k e d ca b b a g e w a s o n l y 4 7 , a l th o u g h t h e r a n g e o f

r e s u l ts f o r r a w c a b b a g e w a s 0 - 1 2 7 . A b a d & G r e g o r y (1 98 7), u s i n g a r a t

b i o a ss a y , r e p o r t e d a h i g h e r v a l u e o f 6 8 . T h e p r e l i m i n a r y re s u lt s o b t a i n e d

h e r e d o n o t e n a b l e u s t o c a l c u l a t e a p r e c i s e v a l u e f o r t h e a v a i l a b i l i t y o f

c a b b a g e f o la t e , b u t i t w a s e v i d e n t l y w e l l u t il is e d a n d i ts u p t a k e a n d

i n c o r p o r a t i o n a p p e a r e d t o b e o f t h e sa m e o r d e r a s t h a t o f P G A .

W e c o n c l u d e t h a t t h e u se o f a r a d i o - i m m u n o a s s a y t o m e a s u r e t h e s er u m

f o l a t e r e s p o n s e o f th e d e p l e t e d r a t t o d i e t a r y f o l a te p r o v i d e s a r e l a ti v e ly

r a p i d a n d i n e x p e n s i v e m e a n s o f i n v e s t i g a t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f f o l a t e s i n

h u m a n f o o d s . T h e s e n s it iv i ty o f t h e t e c h n i q u e is s u c h th a t i t s h o u l d p r o v e

a p p l i c a b l e t o f o o d s s u c h a s p o t a t o e s a n d c e r e a l p r o d u c t s w h i c h , t h o u g h

r e l a t i v e l y l o w i n f o l a t e c o n t e n t , a r e c o n s u m e d i n s u c h q u a n t i t i e s a s t o

p r o v i d e a l a rg e p r o p o r t i o n o f t h e f ol a te s in th e a v e r a g e U n i t e d K i n g d o m

diet .

A C K N O W L E D G E M E N T

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e M i n i s tr y o f A g r i c u lt u r e , F i s he r ie s a n d

F o o d .

R E F E R E N C E S

A bad, A . R. & G rego ry, J. F. (1987). D eterm inatio n of folate bioavailabili ty with a

rat bioassay. J. N ut r . 117, 866-73.

Babu, S. & Srik an tia, S. G. (1976). Availability of folates from som e foods. A m . J .

C l i n . N u t r .

29, 376-9.


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Teknik Penentuan Ketersediaan Hayati Folat

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