ALAT BAHAN DAN CARA KERJA
1. Pewarnaan Spora
a. Pewarnaan Klein
Alat : objek glass, ose, spritus, mikroskop, pinset
Bahan :
o Bahan cat 1 : Carbol fuchsine, peluntur : H2So4 1%
o Bahan cat 2 : Air methylen biru, air
Cara Kerja :
1. Suspensi bakteri dibuat terlebih dahulu dengan cara
Ambil 1 cc air garam physiologis (pZ), kemudian larutkan
kultur bakteri yang akan diperiksa.
Suspensi bakteri diambil sebanyak 1 cc dan dicampur
dengan 1 cc bahan cat carbol fuschine, kemudian
dipanaskan selama 6 menit.
2. Dibuat preparat pada objek glass, keringkan lalu difiksasi
diatas nyala api.
3. Lunturkan dengan H2SO4 1% selama 3 detik
4. Cuci dengan air
5. Cat dengan Methylen Blue selama 4 menit
6. Cuci dengan air lalu keringkan, spora akan tercat warna merah
dan vegetatif terlihat biru.
b. Pewarnaan Schaeffer Fulton
Bahan : Cairan atau padatan (koloni)
Alat : Os, obyek glass, deg glass, lampu siritus, mikroskop
Bahan cat 1 : malachile green 5%
Bahan Cat 2 : Safranin 0,5%, air
Cara kerja :
1. Preparat dicat dengan Malachite Green 5 % dan dipanasi
selama 30-60 detik, dibiarkan selama 5 menit
2. Cuci dengan air
3. Preparat dicat dengan Safranin 0,5% selama 30 detik
4. Cuci dengan air lalu keringkan, spora akan teercat warna hijau
dan vegetatif berwarna merah.
2. Pewarnaan Becker & Kranz
a. Bahan : Bahan diambil langsung dari material alba, atau plak gigi.
b. Cara Kerja :
1. Bahan yang diambil digoreskan di atas gelas obyek,
tuangkan diatasnya bahan fiksaksi dari Ruge-Ross
.
2. Sediaan dicuci denganair, kemudian dituangi tannine beite
selama 1 menit sambil dipanasi, lalu dicuci kembali dengan
air. Pemanasan dimaksudkan untuk memudahkan
spirochaeta menyarap bahan cat.
3. Cat dengan Carbol Gentian Violet selam 2 menit, panasi
sampai menguap 1 kali. Cuci dengan air dna keringkan,
Spirochaeta akan tercat ungu tua.
4. Terlihat :
Bentuk batang langsing runcing berwarna ungu
Bentuk batang tebal panjang berwarna ungu
3. Pewarnaan Neisser
a. Bahan :
1. Neisser A : Methylen Biru 1 gram, alkohol 96% 20 cc,
akuades 1000 cc, acid acetic glacial 50 cc.
2. Neisser B : Kristal violet 1 gram, alkohol 96% 10 cc,
akuades 300 cc.
3. Neisser C : Chrysoidine 1 gram dilarutkan dalam air panas
sebanyak 300 cc lalu difilter.
b. Cara Kerja :
1. Campurkan dalam gelas ukur, 2 bagian Neisser A dan 1
bagian Neisser B.
2. Gelas obyek yang telah diulas dengan kultur dicat dengan
campuran dari Neisser A dengan memakai kertas filter.
3. Cat dibuang, cat kembali dengan Neisser C selama
menit, kemudian keringkan dengan memakai kertas filter
4. Pewarnaan Tahan Asam/ Ziehl Neelsen
a. Bahan :
1. Bahan waran 1 : Carbol fuschine
2. Peluntur : HCL 3% dalam alkohol
3. Bahan warna 2 : Air methylen biru (counter stain) atau
Brilliant green
4. Air
b. Cara kerja :
1. Sebagai bahan diambil dari sputum pagi atau sputum yang
dikumpulkan
2. Sputum diletakkan dalam cawan hitam untuk dilihat warna
serta susunannya, cari bagain-bagian yang kuning
kehijauan dan keras untuk dibuat sediaan.
3. Ambil 2 gelas obyek yang sudah steril, ambil sputum dan
letakkan di atas gelas obyek, lalu tipiskan dnegan gelas
obyek yang kedua serta tekan kira-kira 5 mneit diatas api.
4. Sediaan dikeringkan dan difiksadi selama 3x1 detik,
keringkan lagi selanjutnya siap dilakukan pewarnaan.
5. Tuangi larutan carbol fuchsine selama 5 menit dengan
pemanasan sedikit hingga menguap namun tidak mendidih
selama 2-3 menit,maksud dari pemanasn supaya dapat
mewarnai dengan kuat.
6. Pewarna dibuang dan disiram dengan air.
7. Lunturkan dalam botol bermulut besar yang berisi HCL 3%
dalam alkohol selama 1-2 detik
8. Siram dengan air, selanjutnya cat dengan air methlyen biru
selama 1 mneit, siram dengan air kembali kemudian
keringkan.
TINJAUAN PUSTAKA
1. Pewarnaan Klein
Pewarnaan klein menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air
fukhsin) tujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan ini untuk
mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri
bakteri. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan klein
khususnya spora, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu
macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (sukaakan basa) sedangkan zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan ini umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari
satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. (Pelezar, chan. 2008)
Pewarnaan Schaeffer Fulton
Pewarnaan Schaeffer Fulton adalah jenis pewarnaan yang banyak digunakan
untuk pewarnaan endospora. Bila pewarnaan spora bakteri ini berhasil
dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan berwarna merah. Jika sel
membentuk spora, maka spora hasil pewarnaan akan berwarna hijau.
(Soemarno. 2010).
Pewarnaan Becker & Kranz
Pewarnaan ini ditujukan untuk mengecat spirochaeta. Dengan
pengecatan sederhana maupun gram spirochaeta tidak terlihat jelas.
Spirochaeta merupakan golongan bakteri berbentuk spiral yang bersifat
lentur pada saat bergerak, tubuhnya dapat memenjang dan mengerut.
(Drs.Koes Irianto, 2006).
2. Pewarnaan Neisser
Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula
metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk
semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan
lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang
spesifik (Pelezar,2008).
Prinsip pengecatan dengan Neisser A & B menyebabkan granula
Babes Ernst (poolkarrel) berwarna violet hitam, cat tadi oleh granula bakteri
dipegang kuat terhadap air. Sehingga dengan cat Neisser C tidak berubah
(luntur), badan bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada Neisser
C sehingga mengambil warna kuning atau coklat dari Neisser C. (Soemarno,
2010)
Pada prosedur Neisser yang tidak spesifik, methylene blue, crystal
violet dan chrysoidine digunakan untuk mendeteksi granula metachromatic,
atau yang disebut Babes-Ernst polar bodies, khususnya pada diphtheria
bacteria. Dengan nilai pH yang telah ditentukan, methylen blue dan crystal
violet akan diikat pada polar bodies atau struktur (Volutin bodies), tetapi
tidak terikat pada sel bakteri lainnya. Polar bodies akan terlihat sebagai titik
gelap. Pada prosedur counter stain, badan bakteri diwarnai dengan
chrysoidine tetapi ini hanya sebagian terserap oleh polar bodies. Bakteri
golongan Diphterie, poolkarrelnya ungu kehitaman dengan badan bakteri
berwarna coklat atau kekuningan biasanya ditemukan dengan berbagai
susunan yang menyerupai huruf V, L atau Y. Hasil pengecatan Neisser
hanya bersifat diagnosa sementara, untuk kepastian diagnosa dilakukan
kultur dan tes virulensi baik secara invivo maupun invitro. Kultur
Corynebacterium diphteriae. Spesimen ditanam pada media Loffler Serum,
inkubasi 37°C selama 24 jam. (Kusnaidi,2003)
5. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak
dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika
bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbol-fukhsin melalui proses
pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa
mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol.
Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan
ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab
tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . (Dwidjoseputro, D. 2005)
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau
berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora,
non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali
mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak
dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut
sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang
juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus,
Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. (Thomas
Dormandy, 1999)
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat
warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%.
Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang
dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah
pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu
pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.
Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol
fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu
asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri
kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan
menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan
bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat
sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua
yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay,
1994).
Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode
Ziehl-Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut
bakteri tahan asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut
bakteri tidak tahan asam (non acid fast).
PEMBAHASAN
Pewarnaan Spora
1. Pewarnaan Klein
Pewarnaan Klein adalah pewarnaan khusus yang digunakan untuk mewarnai spora
(endospora). Pada pewarnaan klein ini bahan yang digunakan berasal dari kultur
murni dan bahan cat yang digunakan adalah carbol fuschine dan methylen blue.
Pada pewarnaan endospora perlu dilakukan proses pemanasan. Hal ini bertujuan
supaya cat dapat terserap kedalam spora. Setelah dilakukan pengamatan dengan
menggunakan mikroskop, maka akan terlihat bentuk batang berwarna biru, bentuk
oval berwarna merah, dan bentuk batang berwarna biru dengan rongga
didalamnya berwarna merah. Bentukan yang berwarna biru tersebut adalah bentuk
vegetatif, sedangkan yang berwarna merah adalah spora, dan bentuk batang
berwarna biru dengan rongga didalamnya berwarna merah merupakan dalam
pembentukan spora.
Gambar 2. Hasil pewarnaan Klein
2. Pewarnaan Schaeffer Fulton
Pewarnaan Schaeffer Fulton adalah jenis pewarnaan yang banyak
digunakan untuk pewarnaan endospora. Pada pewarnaan Schaeffer Fulton,
bahan yang digunakan berasal dari kultur murni dan bahan cat yang digunakan
adalah malachiet green dan safranin. Dari hasil pengamatan mikroskop dengan
pewarnaan Schaeffer Fulton akan terlihat bentuk batang berwarna merah,
bentuk oval berwarna hijau, bentuk batang berwarna merah dengan rongga
didalamnya berwarna hijau. Bentukan yang berwarna merah tersebut adalah
dalam bentuk vegetatif, sedangkan yang berwarna hijau adalah spora, dan
bentuk batang berwarna merah dengan rongga didalamnya berwarna hijau
adalah dalam pembentukan spora.
Gambar 3. Hasil pewarnaan Schaeffer Fulton
Pewarnaan Becker and Kranz
Pewarnaan Becker and Kranz adalah salah satu jenis pewarnaan yang
biasanya digunakan untuk mengetahui bagian atau struktur dari suatu bakteri yang
susah dilihat jika menggunakan pewarnaan biasa. Pada praktikum kali ini
pewarnaan Becker and Kranz digunakan untuk mengamati spirochaeta yang
diambil dari plak gigi. Plak gigi digoreskan diatas gelas obyek, kemudian bahan
fiksasi ruge-ross dituangkan ± 2x ½ menit. Setelah itu sediaan dicuci dengan air,
kemudian dituangi tannine beite selama 1 menit sambil dipanasi. Tujuan dari
pemanasan ini adalah supaya cat dapat terserap oleh spirochaeta. Kemudian
sediaan dicuci dengan air lagi dan diberi cat Carbol Gentian Violet selama 2
menit, lalu sediaan dipanasi sampai menguap, lalu dicuci dengan air dan
dikeringkan. Dengan pewarnaan Becker & Kranz ini spirochaeta akan tercat ungu
tua dan terdapat beberapa bentukan yaitu, bentuk batang langsing runcing
berwarna ungu, bentuk batang tebal panjang berwarna ungu, bentuk batang
berlenggok (spiral) berwarna ungu, dan bentuk batang koma berwarna ungu.
Gambar 1. Hasil pewarnaan Becker and Kranz
Pewarnaan Neisser
Bahan : Kultur murni
Terlihat : bentuk batang warna kuning dengan ujung bulat (pool korel)
warna cokelat
Diagnose sementara : Corynebacterium diphteriae
Prinsip pengecatan dengan Neisser A dan B menyebabkan granula Babes
Ernst (polo karel) berwarna violet hitam, cat tadi oleh granula bakteri dipegang
kuat terhadap air. Sehingga dengan cat Neisser C tidak berubah (luntur), badan
bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada Neisser C sehingga
mengambil warna kuning atau cokelat dari Neisser C.
Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen
tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Di dalam sitoplasma dapat
ditemukan granula metakhromatik pada sediaan mikroskopik. Misalnya bakteri
diphteriae mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam
sediaan, granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan.
Misalnya bila diwanai sediaan bakti diphteriae dengan zat warna methylen blue,
granula Babes Ernst akan berwana cokelat tua. Pada spesies bakti tertentu, granula
metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel bakteri.
Disamping material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung
inklusif sel kepingan-kepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh
struktur sel. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan
energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila
diwarnai dengan biru metilen. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin.
Bakteri golongan diphteriae, pool korelnya berwarna cokelat dengan badan
bakteri berwarna kuning biasanya ditemukan dengan berbagai susunan yang
menyerupai huruf V, L, atau Y.
Hasil pengecatan Neisser hanya bersifat diagnosa sementara, untuk
kepastian diagnosa dilakukan kultur dan tes virulensi baik secara in vivo maupun
in vitro.
Pembuatan dan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)
Pada praktikum kali ini dilakukan pengecatan Bakteri Tahan Asam (BTA)
yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl-Neelsen (ZN) yaitu carbol fuchsin, HCl
3% dalam alkohol dan methylene blue 3 %. Dalam pengecatan ini digunakan
sample sputum.
Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak
yang menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain
yang ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar
bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri
menjadi lebih mudah, tetapi juga tidak terlalu tipis.
Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl
Neelsen yang menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :
1. Pewarnaan dengan Carbol Fuchsin
Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus dinding dari bakteri tahan asam,
sehingga dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel bakteri tersebut
sehingga warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun
perlu diperhatikan, pemanasan dilakukan tidak sampai mendidih cukup
sampai menguap agar sel-sel bakteri tersebut tidak rusak.
2. Penambahan HCl 3% dalam alkohol
Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna
(decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah
mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan
kembali tertutup dalam pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan
penambahan asam alkohol ditunggu sampai 5 menit. Saat penambahan asam
alkohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan dilunturkan kembali warna
carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya
bakteri BTA.
3. Pemberian zat warna Methylene Blue
Terakhir dilakukan penambahan Methylene blue. Methylene Blue
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untu
k mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah
perlakuan dengan asam alkohol.
Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang
permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non
BTA terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non
BTA tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori-pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak
dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah.
Waktu yang diperlukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda.
Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat
pembacaan preparat pada mikroskop.
1. Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin
dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat
sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula
setelah dilakukan pemanasan.
2. Warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa.
3. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene blue
bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BT
A sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.
Setelah pewarnaan dan menunggu selama waktu diatas, dilakukan
pembilasan dengan aquadest yang bertujuan untuk membilas zat warna yang
berlebih sebelum dilanjutkan dengan pewarnaan berikutnya.
Hal yang perlu diperhatikan
Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna
yang tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol tidak
sampai berlebih karena akan menyebabkan over decolorization sehingga sel
BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit
membedakannya, tetapi juga tidak terlalu sedikit dalam memberikan alkohol
(under decolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna
sehingga sel Non BTA bisa saja berwarna ungu mendekati warna sel BTA.
Selain itu kaca obyek selalu dicuci dengan aquades diantara
penambahan pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan
mempersiapkan pewarna berikutnya.
Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA
Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada
komponen + dinding selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin
(lapisan lemak) yang sangat banyak sehingga dalam proses penyerapan warna
perlu dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel tersebut sehingga
warna dapat diserap. Namun dalam dinding sel bakteri non BTA lapisan
lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakukan penyerapan warna tidak
perlu dilakukan pemanasan dan pelunturan warna pun sangat mudah dilakukan
saat penambahan asam alkohol.
Pengamatan preparat pewarnaan BTA
Bahan : sputum / dahak
Terlihat :
1. BTA (Bakteri Tahan Asam)
bentuk batang terputus-putus warna merah
2. Leukosit
bentuk oval, lebih besar dari coccus, berwarna biru
3. Epithel
bentuk oval, lebih besar dari leukosit, memiliki inti sel, berwarna biru
Diagnose sementara : Mycobacterium sp.
Kesimpulan
Pewarnaan BTA dilakukan dengan menggunakan tiga jenis zat pewarna
Ziehl Neelsen, yaitu Carbol fuchsin untuk mewarnai sel bakteri, Asam Alkohol
untuk meluruhkan warna Carbol Fuchsin, dan Methylene Blue untuk memberi
warna background. Hasil praktikum menunjukkan sampel positif teridentifikasi
2
1
3
mengandung bakteri Mycobacterium sp (penyakit TB) dengan bentuk basil
berwarna merah. Sifat bakteri ini tidak tahan panas, tetapi dapat bertahan lama
dalam udara bebas. Dalam pewarnaan bahan asam bakteri tahan asam berwarna
merah dan bakteri tidak tahan asam berwarna biru.
DAFTAR PUSTAKA
1. Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan
dan Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat. Bandung: Citra Aditya Bakti.
2. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja
Grafindo Persada.
3. of Tuberculosis. ISBN 0-8147-1927-9 HB - ISBN 1-85285-332-8 PB.
Thomas Dormandy. 1999. The White Death: A History
4. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
5. Kusnadi; Peristiwati; Syulasmi, Ammi; Purwianingsih, Widi;
Rochintaniawati, Diana. 2003. Common Textbook Mikrobiologi Jica.
Bandung : Universitas Pendidikan Indonesia FMIPA Jurusan Pendidikan
Biologi
6. Soemarno. 2010. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Klinik. Yogyakarta:
Akademi Analis Kesehatan Yogjakarta Departemen Kesehatan Republik
Indonesia.
7. Pelezar, chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
8. Irianto koes, D. 2006. Mikrobilogi Menguak dunia Mikroornisme. Bandung :
Yrama Widya.