1. Alat dan Bahan Tabung reaksi steril Pipet volume 1 ml steril Cawan petri steril Spidol Lampu Bunsen BHIB media Ose Sampel

Gambar 1.1 Alat dan bahan untuk menanam bakteri

2. Cara Kerja

1) Melakukan penanaman kultur dari hasil isolasi mikroba rongga mulut dengan metode Cawan Tuang dan Goresan Kuadran2) Melakukan perhitungan jumlah mikroba dengan metode Penipisan Seri dengan cara:a. Ambil 12 tabung reaksi sterilb. Isi masing-masing tabung dengan media BHIB sterilc. Pada tabung no. 1 beri 0,1 mL mikroba dari hasil isolasi d. Ambil 5 ml dari tabung 1 dengan menggunakan ose yang sebelumnya dipanaskan sampai memijar, masukkan ke tabung 2. Selanjutnya ambil 5 ml dari tabung 2 lalu masukkan ke tabung 3. Dilakukan penipisan ini hingga tabung ke 10.

Gambar 2.1. Memanaskan ose agar steril

e. Setelah itu diambil 0,1ml dari setiap tabung lalu digoreskan pada media BHIB steril dengan metode gores atau zigzag. Sebelumnya cawan petri dibagi-bagi dibaliknya menggunakan spidol (sesuai tabung penipisan).

Gambar 2.2. Menggoreskan media BHIB steril dengan metode zigzag

f. Lalu langkah selanjutnya memasukan cawan petri ke dalam incubator dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24 jam.

3. Hasil PraktikumPada praktikum ini, sebelum dilakukan penanaman mikroba dengan metode cawan gores (goresan T), mikroba hasil isolasi diencerkan terlebih dahulu agar koloni yang dibentuk oleh sampel bakteri berada pada jumlah yang dapat dihitung. Setelah diinkubasi, koloni bakteri pada cawan terlihat sebagai berikut:

Gambar 3.1. Hasil PraktikumMelalui hasil yang terlihat, dapat diketahui bahwa koloni yang terbentuk lebih dari 300 CFU/vol (colony forming unit). Padahal, jumlah koloni yang ideal setelah dilakukan pengenceran agar dapat dihitung adalah 30-300 CFU/vol.

4. PembahasanMikroba merupakan organisme yang sangat kecil. Untuk mengetahui banyaknya mikroba misalnya bakteri pada suatu sample sangat tidak mungkin bila kita tidak menggunakan metode penghitungan. Dalam dunia mikrobiologi, mikroba seperti bakteri dapat diperkirakan jumlahnya dengan suatu metode penghitungan. Terdapat dua metode penghitungan bakteri yaitu metode hitungan mikroskopis langsung (direct microscopis count) dan metode hitungan tak langsung (indirect count) dengan hitungan cawan, baik dengan metode penyebaran maupun metode penuangan. Penanaman mikroba atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan mikroba dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman mikroba (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi. (Harmita DR, Maksum R, 2006)Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainyang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies. Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikrobayaitu antara lain :1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi1. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut1. Medium pertumbuhan yang sesuai1. Cara menginokulasi mikroba;e) cara menginkubasi mikroba1. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dansesuai dengan yang dimaksud1. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kulturmurni.Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu sampeltertentu. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian sedangkan sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya, dengan anggapan bahwa koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah diinkubasi berasal dari satu sel tunggal. Dan metode lain yang digunakan yaitu cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta mikromanipulator (the micromanipulator method). Adapun tujuan dilakukannya praktikum isolasi bakteri ini, untuk mempelajari cara mengisolasi bakteri dengan metode cawan gores, serta mengitung jumlah koloni hasil isolasi bakteri. (Dwidjoseputro. 1964)

4.1 Metode cawan gores (streak plate)Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan. Ada beberapa teknik dalam metode goresan, antara lain: (Meryandini, A et al, 2009)

4.1.1 Goresan sinambung 0. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar. 0. Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800,gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.

4.1.2 Goresan TUntuk membuat biakan murni dengan teknik goresan T, ada beberapa langkah yang diikuti, yaitu:1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada baguan luar dasar cawan petri1. Inokulasi daerah 1 sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.1. Panaskan ose dan biarakan dingin kembali1. Gores ulang daeah 1 sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah 21. Oijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali1. Selanjutnya untuk daerah yang ke 3 ulangi cara diatas

4.1.3 Gores KuadranTeknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4 bagian seperti pada gambar

4.1.4 Gores Kuadran1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan1. Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali1. Putar lempengan agar 900dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan1. Putar lempengan agar 900dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya1. Pijarkan ose

4.2 Metode Cawan Tuang (Pour Plate)Teknik pour plate adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakana pada uji TPC (Total Plate Count). Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi/. Biakan campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal. Biakan murni yang dihasilkan, jika disimpan dalam jangka waktu yang lama akan mudah sekali mengalami mutasi. Ini berarti, biakan murni yang disimpan terlalu lama bukan lagi biakan murni yang semula. Oleh karena itu, ada beberapa hal yang harus dilakukan Utuk mencegah atau setidaknya mengurangi kemungkinan terjadinya mutasi yaitu: (Suriawiria U, 2005)4.2.1 Secara periodik, biakan harus dipindahkan ke medium baru, sebaiknya pemindahan dilakukan pada fase log4.2.2 Biakan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi

4.3 Metode Cawan Sebar (spread plate)Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar. (Lim D, 2000)4.4 Perhitungan MikrobaPenentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Penentuan jumlah mikroba dapat ditentukan dengan perhitungan bakteri.Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua cara penghitungan bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung (Harmita 2006).Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sedrhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan secara tidak langsung hanya mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count).Perhitungan langsung (direct count) untuk jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dan sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct measurement) untuk biomassa mikroorganisme, massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel, dan biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan pada kurva standar. Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel, mikroorganisme dalam sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, pertumbuhan mikroorganisme contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa mikroorganisme diperkirakan dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relative konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan dengan kurva standar (Harmita 2006).Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya, adalah waktunya yang digunakan singkat, penghitungannya lebih mudah, tidak membutuhkan bahan yang banyak. Sedangkan kekurangannya adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan sel yang berukuran kecil sulit dilihat dengan mikroskop.Perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung dilakukan dengan metode plate count, yakni hanya sel yang hidup yang dihitung dalam metode ini. Prinsipnya yaitu pengenceran dalam tiap konsentrasi diinokulasikan dalam medium agar dipetri dengan cara spread. Beberapa syarat perhitungan dengan menggunakan metode ini adalah :1.Tidak ada spreader.2.Jumlah koloni mulai dari 30-300.Perbandingan jumlah bakteri antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran yang lebih kecil:a.Jika 2, hasil perhitungan dirata-rata.b. Jika 2, dipakai hasil pengenceran yang sebelumnya.Metode hitungan cawan dilakukan dengan mengencerkan sampel suspensi bakteri ke dalam nutrisi kaldu agar. Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml, per gram atau per cm permukaan. Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, semakin sedikit jumlah mikroba, dimana suatu saat didapat hanya satu mikroba pada satu tabung.Larutan yang digunakan untuk pengenceran harus memiliki sifat osmotik yang sama dengan keadaan lingkungan asal mikroba untuk menghindari rusaknya sel, selain itu juga dijaga agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pengenceran. Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran decimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5dan 10-6. Dan yang diplating dan diamati adalah pengenceran 10-5dan10-6. Hal ini karena diperkirakan koloni yang dibentuk oleh sampel bakteri berada pada jumlah yang dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, untuk perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara desimal. Selanjutnya dari tabung ke lima dan ke enam dituang ke dalam cawan petri (penanaman atau plating) secara aseptik. Plating atau penanaman bakteri adalah proses pemindahan bakteri dari medium lama ke medium baru. Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptik atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan.Selanjutnya cawan petri diinkubasikan selama 2 x 24 jam pada suhu 37 C. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung langsung oleh mata.

5. KesimpulanMikroba merupakan organisme yang sangat kecil. Untuk mengetahui banyaknya mikroba misalnya bakteri pada suatu sample sangat tidak mungkin bila kita tidak menggunakan metode penghitungan. Dalam dunia mikrobiologi, mikroba seperti bakteri dapat diperkirakan jumlahnya dengan suatu metode penghitungan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua cara penghitungan bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung.

6. Daftar PustakaDwidjoseputro. 1964.Dasar dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Hal 67-68Harmita DR, Maksum R. 2006. Buku Ajrar Analisis Hayati. Ed 3. Jakarta: BukuHarmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi Ketiga. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC (halaman : 125)Kedokteran EGC. Hal 125-131Lim,D. 2000. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book, New york. pp 101-103Meryandini, A; W. Widosari, B; Maranatha; et al. 2009. Isolasi Bakteri Selulolitik dan Karakterisasi Enzimnya. Makara. Sains. Vol. 13. No. 1. hal: 33-43Rachie,2008. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba. http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang-mempengaruhi-pertumbuhan-mikroba/. Diakses pada tanggal 17 November 2014.Suriawiria, U. 2005.Mikrobiologi dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta. Hal 98-100