LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

STERILISASI ALAT DAN BAHAN

PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

Nada Rinjani (10060309116)

Tristhy Novilia A (10060309117)

Indah Abdilah (10060309118)

Yuny Hafitry (10060309119)

Tanggal Praktikum : 12 Oktober 2010

Tanggal Laporan : 26 Oktober 2010

Asisten : Reza Abdul Kodir., S.Si

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG

2010

I. TUJUAN PRAKTIKUM

Memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan

bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi serta mampu menyiapakan dan membuat

media steril untuk pengujian mikrobiologi.

II. TEORI DASAR

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga

jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang

biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora

bakteri(Fardiaz, 1992).

Sterilisasai adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi. Ada

5 metode umum sterilisasi yaitu :

•Sterilisasi uap (panas lembap)

•Sterilisasi panas kering

•Sterilisasi dengan penyaringan

•Sterilisasi gas

•Sterilisasi dengan radiasi

Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara sterilisasi

yang umum digunakan secara rutin di laboratorium mikrobiologi ialah dengan sterilisasi uap

(panas lembap) dan sterilisasi panas kering.

A. Sterilisasi Uap (Panas Lembap)

Sterilisasi uap menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Ini merupakan

metode sterilisasi yang biasa digunakan dalam industri farmasi, karena dapat diprediksi dan

menghasilkan efek dekstruksi bakteri, dan parameter-parameter sterilisasi seperti waktu dan

suhu dapat dengan mudah dikontrol dan monitoring dilakukan sekali dalam satu siklus yang

divalidasi. Metode ini sangat efektif untuk sterilisasi karena menyediakan suhu jauh di atas

titik didih, proses cepat, daya tembus kuat dan kelembaban sangat tinggi sehingga

mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba yang menyebabkan sel hancur. Suhu

efektifnya adalah 121oC pada tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit. Alat yang

digunakan : pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort.

Sterilisasi panas lembab sangat efektif digunakan meskipun pada suhu yang tidak

begitu tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan

dilepaskan panas sebesar 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas ini

mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan dengan

demikian mematikannya (Amir, 2009).

Prinsip Kerja Autoklaf

Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat & bahan yang

menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121°C. Suhu dan tekanan tinggi yang

diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar

untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media

digunakan suhu 121°C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan

digunakan suhu 121°C atau 249,8°F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika

digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level)

air mendidih pada suhu 100°C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian

sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 121°C.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih

dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara

dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam

autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi

dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber

panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak

boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja

dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki

endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial

dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan.

Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka

menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.

Kondisi-kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf dalah

sebagai berikut :

Suhu 111,5°C, waktu 30 menit

Suhu 121,5°C, waktu 20 menit

Suhu 126,5°C, waktu 15 menit

Metode ini biasanya digunakan untuk mensterilisasi:

Larutan dengan pembawa air

Alat-alat gelas

Pembalut untuk bedah

Penutup karet dan plastik

Media untk pekerjaan mikrobiologi

B. Sterilisasi Panas Kering

Beberapa bahan yang tidak dapat disterilkan dengan uap, paling baik disterilkan dengan

panas kering,. Misalnya petrolatum jelly, minyak mineral, lilin, wax, serbuk talk. Karena

panas kering kurang efisien dibanding panas lembab, pemaparan lama dan temperatur tinggi

dibutuhkan. Range luas waktu inaktivasi dalam temperatur bervariasi telah diterapkan

berdasarkan tipe indikator steril yang digunakan, kondisi kelembaban dan faktor lain. Jumlah

air dalam sel mikroba diketahui mempengaruhi resistensinya terhadap destruksi panas

kering(Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th : 1471).

Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan

dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan

sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang

dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan. Sterilisasi panas kering

membutuhkan pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam. Alat yang

digunakan pada umumnya adalah oven. Beberapa waktu dan suhu yang umum digunakan

pada oven :

170°C (340 F) sampai 1 jam

160°C (320 F) sampai 2 jam

150°C (300 F) sampai 2,5 jam

140°C (285 F) sampai 3 jam

Karena suhunya yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan untuk alat-alat

gelas yang membutuhkan keakuratan. Contoh: alat ukur dan penutup karet atau plastik.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang

disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan

mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis

mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada

medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber

karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium

yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks

lainnya. (Volk, dan Wheeler,1993 . Mikrobiologi Dasar Jilid 1).

Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan

substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah

degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus

memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan

faktor tumbuh. (Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

Berdasarkan konsistensi atau kepadatannya, medium dibagi menjadi tiga jenis, yaitu :

a. Medium cair/broth/liquid medium

Contoh : air pepton, nutrient broth, lactosa

b. Medium setengah padat (semi solid medium)

Contoh : sim agar, cary dan brain agar

c. Medium padat (solid medium)

Contoh : endo agar, PDA, nutrient agar

III. ALAT DAN BAHAN

Alat : Autoclave

Erlenmeyer

Tabung Reaksi

Cawan Petri

Gelas Ukur

Labu takar

Pipet Ukur

Benang Kasur

Alumunium Foil

Kapas

Kain Kasa

Kertas HVS bekas

Gunting

Kertas Label

Bahan : Media ( Nutrient Agar, Nutrient Broth)

IV. PROSEDUR KERJA

Persiapan dan Sterilisasi Alat

Alat-alat yang akan disterilisasi dicuci terlebih dahulu kemudian dikeringkan. Alat-

alat yang mempunyai mulut (tabung reaksi, gelas ukur, labu takar) disumbat menggunakan

kain kasa dan kapas. Penyumbatan dilakukan dengan cara, pertama kain kasa digunting

sehingga berbentuk segiempat (besarnya tergantung mulut alat). Kedua, kapas digulung

hingga berbentuk silinder yang cukup padat lalu kapas dibungkus dengan kain kasa dan diikat

dengan benang kasur. Ketiga, kain kasa yang telah berisi kapas dimasukkan ke dalam mulut

alat (2/3 masuk di bagian mulut alat). Kain kasa yang dimasukkan harus dipastikan menutupi

mulut alat dan tidak ada udara yang masuk. Selanjutnya kapas penutup ditutup lagi dengan

alumunium foil lalu ikat dengan benang kasur agar kuat.

Cawan petri dan Pipet ukur dibungkus seluruhnya dengan kertas HVS bersih.

Selanjutnya, semua alat disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121°-126° C selama

15-20 menit.

Pembuatan dan Sterilisasi Media Larutan Pengencer

Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 10 gr (untuk 2 kelompok) sedangkan

nutrient Broth (NB) sebanyak 3,38 gr (untuk 2 kelompok). Masing-masing media

dimasukkan kedalam erlenmeyer yang sudah diberi tanda sesuai nama nutrient, lalu

ditambahkan akuades, untuk NA sebanyak 500mL dan NB sebanyak 260mL. Selanjutnya

media dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk sampai larutan tidak keruh lagi/jernih.

Suhu pemanasan untuk NA T= 300°C sedangkan NB T= 100°C Dinginkan beberapa saat,

kemudian erlenmeyer disumbat dengan kapas dan alumunium foil serta diikat dengan benang

kasur dan diberi etiket (tanggal pembuatan, nama media dan nama pembuat). Kemudian

media disterilisasi menggunakan autoclave. Pengamatan kondisi media dilakukan setelah

2X24 jam.

V. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN

ALAT KONDISI SETELAH STERILISASI

Tabung ReaksiAlumunium foil yang menutupi mulut tabung masih terbungkus rapih ,

tidak ada sobekan.

Gelas Ukur

Alumunium foil yang menutupi mulut gelas masih terbungkus rapih ,

tidak ada sobekan.

Di dalam gelas ukur 100mL terdapat sisa uap air

Labu UkurAlumunium foil yang menutupi mulut labu masih terbungkus rapih ,

tidak ada sobekan.

Cawan Petri Masih terbungkus rapih oleh kertas, tidak ad sobekan

Pipet Ukur Terdapat robekan pada kertas pembungkus dibagian ujung pipet

MEDIA KONDISI SETELAH STERILISASI

Nutrient Agar Padatan berwarna kuning tua jernih dan tidak terdapat lendir dan jamur

Nutrient Broth Berwarna kuning muda jernih, tidak ada endapan

NA sebelum dipanaskan NA setelah dipanaskan NA setelah disterilisasi (Kuning tua keruh) (Kuning tua jernih) kemudian didiamkan 24jam

NB sebelum dipanaskan NB setelah dipanaskan NB setelah disterilisasi(Kuning muda keruh) (Kuning muda jernih) kemudian didiamkan 24jam

Perhitungan Pembuatan Media

Nutrient AgarDiketahui: 20 gram untuk 1000 mL akuadesDitanya: Berapa gram NA yang diperlukan untuk pembuatan 500 mL?Jawab: Berat diketahui = Volume diketahui

Berat ditanya Volume ditanya

20 gr = 1000 mL X 500 mL

X = 10 gr

Nutrient BrothDiketahui: 13 gram untuk 1000 mL akuadesDitanya: Berapa gram NB yang diperlukan untuk pembuatan 260 mL?Jawab: Berat diketahui = Volume diketahui

Berat ditanya Volume ditanya

13 gr = 1000 mL X 130 mL

X = 3,38 gr

VI. PEMBAHASAN

Dalam praktikum mikrobiologi harus menggunakan alat yang steril. Hal ini bertujuan

agar tidak terjadi kontaminasi terhadap lingkungan luar sehingga di dapat hasil yang

maksimal. Proses membuat peralatan menjadi steril disebut dengan proses sterilisasi. Dimana

sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan mikrobia

ataupun peralatan laboratorium dari semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan

di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi

harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri(Fardiaz,

1992). Dalam proses sterilisasi ada empat cara utama yang dipakai, yaitu dengan pemanasan,

penggunaan bahan kimia, penyaringan (filtrasi), dan radiasi.

Dalam praktikum kali ini proses sterilisasi yang digunakan praktikan adalah dengan

pemanasan. Ada dua metode sterilisasi dengan pemanasan yaitu metode strerilisasi uap dan

sterilisasi panas kering. Praktikan lebih memilih menggunakan metode sterilisasi uap karena

metode ini sangat efektif, menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya

tembus kuat dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel

mikroba yang menyebabkan sel hancur. Prinsip sterilisasi uap adalah menggunakan uap air

sebagai pensterilnya. Karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan

dilepaskan panas sebesar 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas ini

mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan dengan

demikian mematikannya (Amir, 2009). Alat yang digunakan untuk sterilisasi dengan metode

uap ini adalah autoclave.

Sebelum dimasukkan ke dalam autoclave alat-alat yang memiliki mulut (tabung

reaksi, gelas ukur dan labu ukur) harus disumbat dulu dengan kapas agar tidak ada udara

yang masuk sehingga setelah proses strelisasi selesai , tidak terkontaminasi oleh bakteri dari

udara luar. Selain disumbat dengan kapas ditutupi lagi dengan alumunium foil karena sifat

alumunium yang dapat menahan uap agar tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Untuk

cawan petri dan pipet ukur cukup dibungkus dengan kertas HVS bekas dengan bagian yang

bersih bersentuhan dengan alat. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai

pembungkus karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

Seharusnya untuk bagian mulut pipet ukur disumbat dengan kapas agar tidak ada udara

masuk. Namun praktikan tidak melakukannya sehingga ketika proses sterilisasi, kertas yang

membungkus pipet ukur sobek, alat terkontaminasi udara dari luar.

Medium pertumbuhan mikrobia adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrien

yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan menggunakan bahan medium

pertumbuhan, aktivitas mikrobia dapat dipelajari dan dengan menggunakan medium tumbuh

dapat dilakukan isolasi mikrobia menjadi biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk

pertumbuhan medium dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang

meliputi air, agar yang bersifat tidak diuraikan oleh mikrobia, gelatin yang merupakan protein

yang dapat diuraikan oleh mikrobia, dan silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium

silikat khusus untuk menumbuhkan mikrobia yang bersifat obligat autotrof, unsur-unsur

nutrien yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi karbohidrat, lemak dan asam-asam

organik, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein, garam-garam kimia (K, Na, Fe

dan Mg), vitamin, dan sari buah, ekstrak sayuran dan susu. Serta bahan-bahan tambahan yaitu

bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium dengan tujuan tertentu seperti indikator

maupun antibiotik. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh media yang digunakan

disterilkan terlebih dahulu (Syamsir, 2008).

Dalam praktikum kali ini percobaan yang dilakukan adalah pembuatan media Nutrient

Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB). NA adalah medium padat yang memiliki komposisi

yang berasal dari bahan olahan seperti beef extract dan peptone sehingga nutrisi yang

dimilikinya banyak. NB adalah media cair yang digunakan untuk menanam bakteri

(mikroorganisme). Komponen nutrisi dari NB adalah ekstrak daging, ekstrak ragi, pepton dan

sodium klorida.

Dalam praktikum kali ini untuk pembuatan media NA digunakan 10 gr NA bubuk

yang kemudian di larutkan dengan aquadest sebanyak 500 ml. Kedua bahan tersebut

dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, dipanaskan sekaligus dilakukan penghomogenan larutan

di atas penangas air dengan stirrer magnetic. Setelah dipanaskan media dibagi dua untuk

kelompok lain. Kemudian dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC tekanan 1-

2 atm. Selanjutnya didiamkan 2x24 jam didapatkan medium padatan NA sebanyak 250 ml

dengan warna kuning tua jernih dan tidak terdapat lendir dan jamur yang mengindikasikan

bahwa media telah steril dan tidak terkontaminasi bakteri.

Sama halnya dengan NA, saat pembuatan medium NB digunakan 3,38 gr bubuk NB

yang dicampurkan dengan aquadest sebanyak 260 ml. Kedua bahan tersebut dimasukkan ke

dalam Erlenmeyer, dipanaskan sekaligus dilakukan penghomogenan larutan di atas penangas

air dengan stirrer magnetic. Setelah mendidih dan homogen larutan dibagi dua kembali,

kemudian dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC tekanan 1-2 atm Setelah

didiamkan selama 2x24 jam didapatkan hasil medium NB dengan berwarna kuning muda

jernih dan tidak ada endapan ini juga mengindikasikan bahwa media telah steril dan tidak

terkontaminasi.

VII. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan:

Proses sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan

mikrobia ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan.

Sumbat atau pembungkus alat yang rusak setelah proses sterilisasi menandakan bahwa

alat tidak steril karena telah terkontaminasi udara dari luar.

Pipet ukur sudah tidak steril karena terkontaminasi udara luar.

Medium yang dibuat yaitu Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) steril dan tidak

terkontaminasi dari segala bentuk kehidupan (bakteri).

DAFTAR PUSTAKA

A.R. Gennaro. 1990. Remington’s Pharmaceutical Sciences 18 th Edition. Pennsylvania :

Mack Publishing Company.

Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Jakarta: Erlangga

Pelczar,Jr.et al.1986. Dasar-Dasar Mirobiologi. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia

Amir. 2008. Pengendalian Mikroorganisme.

http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/pengendalian-mikroorganisme/

Syamsir, Elvira. 2008. Prinsip Sterilisasi Komersial Produk Pangan.

http://id.shvoong.com/exact-sciences/

Aisyah. 2009. Metode Sterilisasi

http://rgmaisyah.wordpress.com/2009/03/15/metode-sterilisasi/

Caray. 2008. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi

http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pembuatan-media-agar-dan-

sterilisasi.html

Marnala. 2009. Sterilisasi Media dan Alat

http://www.marnala.co.cc/2009/07/sterilisasi-media-dan-alat.html

Ahyari, Jimmy. 2008. Pembuatan Media dan Sterilisasi

http://blogkita.info/pembuatan-media-n-sterilisasi/

Farmasi. 2010. Pembuatan Medium Mikroba

http://farmasiblogku.blogspot.com/2010/10/pembuatan-medium-mikroba.html